CN116712604A - 一种阴离子改性骨修复水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
Abstract
本发明公开了一种阴离子改性骨修复水凝胶及其制备方法和应用，阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，包括步骤：采用阴离子钠盐溶液浸泡水凝胶，对水凝胶改性，制备得阴离子改性骨修复水凝胶。该阴离子改性骨修复水凝胶，是一种包括阴离子与水凝胶中的氨基配位的离子交联复合物。本发明设计了一种新的、简单温和的水凝胶改性方式，通过阴离子钠盐溶液浸泡水凝胶，制备了高强度、抗溶胀的水凝胶。同时，该水凝胶还具有一定的成骨活性，使材料具有优异的促成骨效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种阴离子改性骨修复水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
创伤、肿瘤、感染等因素导致的颅颌面骨缺损是口腔医学常见的疾病之一。颅颌面骨缺损常为不规则的几何形状，缺损部位与复杂的神经肌肉等空间结构关系密切，且颌面部骨需承担咀嚼力的机械要求，这些都增加了颅颌面骨缺损修复的难度。超过临界大小的骨缺损无法自行愈合，需要人为手术干预帮助修复。自体骨移植是骨缺损修复的金标准。但是自体骨移植的供体有限，且需要二次手术，可能导致供区出血、骨折、神经损伤等并发症。骨组织工程是利用支架材料搭载细胞或生物活性成分等，制成骨骼替代品，以促进新骨形成，修复骨缺损。良好的骨骼替代品应具有天然骨骼的生理特性：1)结构支撑作用，即能够承受机械应力；2)良好的生物相容性，作为支架允许成骨相关细胞附着、迁移和增殖；3)一定的骨诱导性，刺激宿主的间充质干细胞成骨向分化，促进新骨的形成；4)可降解性，在发挥完材料的支架作用后，可以缓慢降解，以利于新骨长入而不形成占位。
水凝胶是含水的分子相互交联形成的三维网络结构。其中，天然高分子基水凝胶在骨修复方面有潜在的优势。首先，天然高分子基水凝胶可以模拟天然骨骼的基质结构，从而提供适宜内源性细胞生长的环境。其次，天然高分子基水凝胶有良好的生物相容性和良好的生物降解能力，降解产物可以被周围组织吸收利用，避免了二次手术。另外，天然高分子基水凝胶利于细胞的生长，还可以搭载生长因子、药物等，并控制其释放。在一系列天然高分子基水凝胶中，明胶或明胶多糖复合水凝胶因与细胞外基质中的蛋白质聚糖成分类似，而广泛用于骨组织损伤修复，应用于生物工程。
然而，明胶或明胶多糖复合水凝胶其较差的机械强度和高溶胀性限制了其再组织工程中的应用。骨缺损部位常需要承担机械力如肌肉的拉伸力、外物的压力等，水凝胶柔软的结构导致其缺乏缓冲效果，难以起到支撑作用。水凝胶富含亲水基团，在液体或湿润组织环境中长期服役常导致几倍于初始体积的溶胀发生。应用于骨组织工程时，这种溶胀性会导致水凝胶体积膨胀压迫甚至损害周围的器官和组织。
目前常设计双网络水凝胶、拓扑结构水凝胶、类四面体PEG水凝胶以及复合高强度成分等方式提高水凝胶的力学强度，通过添加疏水层、设计超分子水凝胶等提高水凝胶的抗溶胀性。虽然上述方法可以有效提高水凝胶的机械性能和抗溶胀性，但存在以下不足：
1)步骤较为繁琐，成本高昂，
2)部分材料构建涉及到有机溶剂的使用，一定程度上降低了水凝胶的生物安全性。
3)此外，这方法并没有改善水凝胶的成骨活性。常通过额外添加细胞、生长因子和纳米促成骨成分赋予水凝胶成骨活性。
因此，如何开发出合成方法简单，兼具机械优势和生物活性的水凝胶是骨组织工程的关键。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：开发出合成方法简单，兼具机械优势和生物活性的水凝胶，本发明提供了解决上述问题的一种阴离子改性骨修复水凝胶及其制备方法和应用，本发明提供的水凝胶具有高强度、良好的抗溶胀型及成骨活性，且制备方法相对简单。
本发明通过下述技术方案实现：
一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，包括步骤：采用阴离子钠盐溶液浸泡水凝胶，对水凝胶改性，制备得阴离子改性骨修复水凝胶。
创伤、感染、肿瘤等原因导致的颅颌面骨缺损的治疗是临床难点。设计、开发出具有高强度、抗溶胀、且有成骨活性的材料是骨组织工程的关键。本研究设计了一种新的、简单温和的水凝胶改性方式，通过阴离子钠盐溶液浸泡水凝胶，制备了高强度、抗溶胀的水凝胶。同时，该水凝胶还具有一定的成骨活性，使材料具有优异的促成骨效果。
进一步可选地，所述阴离子钠盐中，阴离子包括HPO4 2-、Bor2-中的至少一种。
生物体可接受的阴离子钠盐均可适用于本申请，如优选采用HPO4 2-、Bor2-中的至少一种，在不搭载细胞、生长因子等生物成分的情况下，在体外可以促进骨髓间充质干细胞和MC3T3-E1细胞成骨向分化，在体内可以促进大鼠颅骨缺损的修复，其中CGG-HPO4 2-水凝胶效果更佳，12周时可使临界骨缺损愈合。
进一步可选地，所述阴离子钠盐溶液的浓度为0.8mol/L-5mol/L。
进一步可选地，阴离子钠盐溶液的浓度为饱和浓度。
进一步可选地，所述水凝胶包括双网络水凝胶。
进一步可选地，所述双网络水凝胶是由京尼平共价交联明胶和壳聚糖合成的水凝胶。
本发明通过引入共价交联，提高了水凝胶的稳定性。
进一步可选地，所述双网络水凝胶的制备方法包括：
先将壳聚糖和明胶溶解混合，制备获得明胶壳聚糖水凝胶；
再加入京尼平进行交联，制备获得双网络水凝胶。
具体地，优选为：
先将壳聚糖溶解于溶剂中，进行搅拌溶解；再加入明胶进行搅拌溶解，获得明胶壳聚糖水凝胶；
然后加入京尼平溶解在明胶壳聚糖水凝胶中进行充分溶解，得到液态的京尼平共价交联明胶和壳聚糖水凝胶，迅速将京尼平共价交联明胶和壳聚糖水凝胶加入预制模型中，在常温下恒温孵箱过夜使其充分交联，待水凝胶颜色变黑，将交联好的水凝胶冷冻，后取出备用。
一种阴离子改性骨修复水凝胶，是一种包括阴离子与水凝胶中的氨基配位的离子交联复合物。
进一步可选地，采用上述逇一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法制备获得。
上述的一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法制备获得的水凝胶或上述的一种阴离子改性骨修复水凝胶在骨组织修复中的应用，包括颅颌面骨修复。
本申请构建了明胶和不同多糖复合的双网络水凝胶，用无机离子磷酸根离子和四硼酸根离子处理水凝胶，探究离子对水凝胶机械性能和成骨活性的影响。通过引入共价交联，提高了水凝胶的稳定性。
本发明具有如下的优点和有益效果：
1、本发明提供的阴离子改性骨修复水凝胶，具有较高的机械性能和抗溶胀性能。此外，阴离子改性不仅可以提高水凝胶的机械性能和抗溶胀性，磷酸根离子和四硼酸根离子本身还具备一定的促成骨活性，可以赋予水凝胶促成骨性能。
2、本发明提供的阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，相比传统的改性方式，该方法不涉及有机溶剂的使用，所使用的主要成分降解产物为人体代谢物，生物安全性较高，无潜在致癌及毒副作用。
3、本发明提供的阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，相比传统的改性方式，该方法较为简单，可以大规模生产，成本低廉，制备的材料均匀性良好。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明的阴离子改性骨修复水凝胶机制模式图。
图2为本发明的电镜图；其中，图2(A)表示双网络水凝胶CGG的电镜图，图2(B)表示阴离子改性水凝胶CGG-Bor2-的电镜图，图2(C)表示阴离子改性水凝胶CGG-HPO4 2-的电镜图。
图3为网络水凝胶CGG、阴离子改性水凝胶CGG-Bor2-和CGG-HPO4 2-的XPS图。
图4为网络水凝胶CGG、阴离子改性水凝胶CGG-Bor2-和CGG-HPO4 2-的FT-IR图。
图5为本发明的力学性能测试结果图；其中，图5(A)表示施加500g外力作用，图5(B)表示三种水凝胶的应力-应变曲线，图5(C)表示三种水凝胶的弹性模量，图5(D)表示三种水凝胶的韧性。
图6为本发明的抗溶胀性、吸水性测试结果图；其中，图6(A)表示三种水凝胶在PBS溶液浸泡三天的形态变化，图6(B)表示三种水凝胶的吸水量，图6(C)表示三种水凝胶的溶胀曲线。
图7为本发明的成骨性能体外检测结果图；其中，图7(A)表示水凝胶浸提液促成骨效果的ALP染色，图7(B)表示水凝胶浸提液促成骨效果的茜素红染色。
图8为本发明的成骨性能体外检测结果图；其中，图8(A)表示水凝胶浸提液培养大鼠BMSCs五天的成骨标志基因表达情况，图8(B)表示水凝胶浸提液培养大鼠BMSCs十四天的成骨标志基因表达情况。
图9为本发明的成骨性能体内检测结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例提供了一种阴离子改性骨修复水凝胶，具体制备方法如下所示：
步骤1：制备四硼酸钠饱和溶液至0.2mM；
步骤2：在预制模型中，加入双网络水凝胶CGG，室温下静置10min待水凝胶成型，将成型后的水凝胶放于-20℃冰箱过夜；
步骤3：第二天取出成型的水凝胶，放于20倍体积的四硼酸钠饱和溶液中浸泡48h；
步骤4：最后，将浸泡后的水凝胶置于去离子水中用超声震荡清洗30min，洗净未与水凝胶结合的钠盐，以获得阴离子改性的水凝胶，此阴离子改性水凝胶的命名为水凝胶-阴离子缩写为CGG-Bor2-。
实施例2
本实施例提供了一种阴离子改性骨修复水凝胶，具体制备方法如下所示：
步骤1：制备磷酸氢二钠饱和溶液至1M；
步骤2：在预制模型中，加入双网络水凝胶CGG，室温下静置10min待水凝胶成型，将成型后的水凝胶放于-20℃冰箱过夜；
步骤3：第二天取出成型的水凝胶，放于20倍体积的磷酸氢二钠饱和溶液中浸泡48h；
步骤4：最后，将浸泡后的水凝胶置于去离子水中用超声震荡清洗30min，洗净未与水凝胶结合的钠盐，以获得阴离子改性的水凝胶，此阴离子改性水凝胶的命名为水凝胶-阴离子缩写为CGG-HPO4 2-。
上述实施例1和实施例2中，双网络水凝胶CGG为由京尼平共价交联明胶和壳聚糖合成的水凝胶，具体制备方法如下所示：
(1)明胶壳聚糖水凝胶(Gelatin/chitosan，CG)的制备：取0.4g壳聚糖粉末，溶于7.6mL质量分数为2％的冰乙酸溶液中，在65℃条件下，以600r/min的速度搅拌，待壳聚糖溶解后，加入2g明胶粉末，继续搅拌2h；后停止搅拌，65℃环境下静置2h待气泡除尽，以获得均匀的CG。
(2)取10mL均匀的CG，在65℃下溶解，加入0.01g京尼平粉末，充分搅拌使其溶解，获得液态CGG水凝胶。迅速将CGG水凝胶加入预制模型中，在37℃恒温孵箱过夜使其充分交联，第二天水凝胶颜色变黑，将交联好的水凝胶放于-20℃冰箱中过夜，第二天取出备用。
一、关于阴离子改性水凝胶的结构分析
如图1所示，以磷酸氢二钠溶液为例说明，当CGG水凝胶浸入磷酸氢二钠溶液(1M，pH～8.8)时，阴离子可以极化水合水分子，并让氨基去质子化；这些作用会导致聚合物的亲水基团与水合水分子之间的氢键断裂，增加疏水链间的相互作用，形成分子间聚集和链缠结微结构。同时，溶解在CGG水凝胶中的阴离子HPO4 2-可以与氨基配位或与多糖的单体结构结合，形成离子交联复合物，在双网络水凝胶结构中发挥交联剂的作用。因此，弱碱性的HPO4 2-比其他阴离子更能促进氨基的去质子化过程，并在CGG网络中形成更强、更稳定的复合结构，从而使CGG-HPO4 2-水凝胶具有强大的机械性能、抗溶胀性、稳定性。此外，浓度较低的Bor2-(2mM，pH～9.1)改性CGG水凝胶，也可以增强水凝胶的力学性能，同时较为稳定、抗溶胀。这些性质可能也归因于聚合物分子间疏水作用增强以及Bor2-和氨基之间新形成的离子交联。
二、关于阴离子改性水凝胶的表征分析
1、电镜表征：
结果如图2所示，三种水凝胶均是均匀的多孔结构。
2、XPS和FT-IR表征：
结果如图3和图4所示，XPS结果可见，CGG-Bor2-在192.03Ev处有一个峰，该峰对应了B1s信号；CGG-HPO4 2-在133.18Ev处有一个峰，该峰对应了P2p信号。而在CGG水凝胶中均未观察到这两个峰。FT-IR结果可见，CGG-Bor2-在1 307.64cm-1处有一个宽峰，该峰对应了Bor2-基团；CGG-HPO4 2-在890cm-1处有一个宽峰，该峰对应着HPO4 2-基团。
综上所述，通过XPS、EDS、FT-IR实验，证明离子已经结合至水凝胶，通过扫描电镜证明水凝胶均为均匀的多孔结构。
三、力学性能测试
1、测试方法：
用模具制备高度为5mm，直径为8mm的圆柱状水凝胶CGG，用上述阴离子改性后制得CGG-Bor2-、CGG-HPO4 2-水凝胶，进行力学测试。
首先，用500g砝码对水凝胶垂直施加外力，观察阴离子改性水凝胶的形变情况。其次，使用万能力学测试仪进行压缩性能检测，速率为1mm/min，测得应力-应变曲线，前10％应变段曲线计算弹性模量；材料断裂点前的曲线计算韧性。每组重复三个样本。
2、测试结果：
测试结果如图5所示，两种离子改性水凝胶力学强度大幅度提高。具体地，图5(A)施加500g外力作用，CGG水凝胶形变明显，CGG-Bor2-水凝胶不明显，而CGG-HPO4 2-水凝胶几乎没有形变。图5(B)三种水凝胶的应力-应变曲线，图5(C)三种水凝胶的弹性模量，图5(D)表示三种水凝胶的韧性，可见CGG-HPO4 2-水凝胶力学强度大幅度提高。
四、抗溶胀性、吸水性测试：
1、测试方法：
为了测试水凝胶的溶胀性能和吸水性能，用模具制备高度为3mm，直径为8mm的圆柱状水凝胶，用阴离子改性水凝胶进行测试。首先，用吸水纸擦干表面的水分，测量阴离子改性水凝胶初始质量记为W0，初始体积记为V0。将水凝胶置于20倍体积的PBS中，放在37℃恒温孵箱，在第1、3、5天记录阴离子改性水凝胶的质量Wt，体积Vt。每组重复三个样本。阴离子改性水凝胶吸水率为(Wt-W0)/W0×100％，制作吸水曲线；阴离子改性水凝胶的溶胀率为(Vt-V0)/V0×100％，制作溶胀曲线。
2、测试结果：
测试结果如图6所示，两种离子改性水凝胶有良好的抗溶胀性。
五、水凝胶成骨性能体外检测
1、测试方法：
将大鼠骨髓间充质干细胞以1×106个/孔的密度接种于六孔板，以1×105个/孔的密度接种于12孔板，培养24h后更换为阴离子改性水凝胶浸提液继续培养，分别于第五天、第十四天进行ALP、ARS染色，并用RT-qPCR进行基因定量检测。
2、测试结果：
结果如图7和图8所示，两种离子改性水凝胶具有在体外促成骨能力，CGG-HPO4 2-水凝胶效果更加显著。
五、水凝胶成骨性能体内检测
1、测试方法：
1)8周龄的雄性SD大鼠随机分为4组，分别为空白对照组，CGG、CGG-Bor2-、CGG-HPO42-水凝胶组，每组各时间点五只。术前12h禁食禁饮。
2)异氟烷进行气体麻醉，待大鼠呼吸平稳、四肢无力后将四肢固定于鼠板；大鼠颅顶部位备皮，碘伏消毒后沿中线剪开皮肤，作2.0cm的矢状切口，暴露骨面。
3)用低速环钻于颅中缝两侧造两个直径5mm的全厚骨组织缺损，使用生理盐水降温并冲净残留的骨组织。使用模具取两块厚度1mm，直径5mm的圆形水凝胶薄片置于缺损处，对照组不放置任何材料。放置好水凝胶后，首先缝合骨膜层以达到固位效果，后对位缝合皮肤。
4)术后给予大鼠正常饮食，观察大鼠状态。4周、8周、12周后用高浓度异氟烷过量通气处死大鼠，取大鼠颅骨PBS冲洗后放于4％多聚甲醛于4℃冰箱固定24h。
5)使用Micro-CT成像系统扫描大鼠颅骨，扫描精度为15.6μm，扫描条件为70kVp，200μA。使用VGStudio Max 30软件重建三维图像。
2、测试结果：
结果如图9所示，两种离子改性水凝胶具有在体内促成骨能力，CGG-HPO4 2-水凝胶效果更加显著。
综上，创伤、感染、肿瘤等原因导致的颅颌面骨缺损的治疗是临床难点。设计、开发出具有高强度、抗溶胀、且有成骨活性的材料是骨组织工程的关键。本发明设计了一种新的、简单温和的水凝胶改性方式，用常见阴离子钠盐浸泡明胶多糖水凝胶，提高材料的机械性能，并引入京尼平共价交联提高水凝胶的稳定性。
如上述实施例所示，磷酸氢根和四硼酸根离子改性共价交联的明胶壳聚糖水凝胶CGG-HPO4 2-和CGG-Bor2-力学性能增强，且具有抗溶胀性。CGG-HPO4 2-和CGG-Bor2-的生物相容性和成骨性能检测证明，两者对骨髓间充质干细胞和MC3T3-E1细胞均有良好的生物相容性，且能促进这两种细胞成骨向分化，CGG-HPO4 2-效果更佳。体内颅骨临界骨缺损修复实验发现，两种水凝胶均可以促进骨缺损修复，其中CGG-HPO4 2-效果更显著，12周时可促使临界骨缺损完全愈合。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，包括步骤：
采用阴离子钠盐溶液浸泡水凝胶，对水凝胶改性，制备得阴离子改性骨修复水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述阴离子钠盐中，阴离子包括HPO4 2-、Bor2-中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述阴离子钠盐溶液的浓度为0.8mol/L-5mol/L。
4.根据权利要求3所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，阴离子钠盐溶液的浓度为饱和浓度。
5.根据权利要求1所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水凝胶包括双网络水凝胶。
6.根据权利要求5所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述双网络水凝胶是由京尼平共价交联明胶和壳聚糖合成的水凝胶。
7.根据权利要求6所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法，其特征在于，所述双网络水凝胶的制备方法包括：
先将壳聚糖和明胶溶解混合，制备获得明胶壳聚糖水凝胶；
再加入京尼平进行交联，制备获得双网络水凝胶。
8.一种阴离子改性骨修复水凝胶，其特征在于，是一种包括阴离子与水凝胶中的氨基配位的离子交联复合物。
9.根据权利要求8所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶，其特征在于，采用权利要1-7任一项所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法制备获得。
10.权利要求1-7任一项所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶的制备方法制备获得的水凝胶或权利要求8-9所述的一种阴离子改性骨修复水凝胶在骨组织修复中的应用，包括颅颌面骨修复。
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