CN110548171B - 一种明胶基骨组织粘合剂、其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种改性纳米颗粒强化的明胶基骨组织粘合剂的制备，包括：将氨基化介孔生物活性纳米颗粒(AMBGN)与醛基葡萄糖的缓冲溶液混合得到预交联溶液，其与明胶溶液混合并置于待粘合的骨块断面，可在水凝胶固化的同时，对两侧的骨组织形成黏附，达到骨组织粘合的效果，固定后粘合剂可通过发挥氨基化介孔生物活性玻璃的促成骨活性促进骨折面的愈合。AMBGN强化的骨粘合剂在保留了良好骨组织粘附性能的基础上，具备了良好的机械力学性能。克服了纳米颗粒物理添加带来的细胞毒性问题，保留了良好的生物相容性。同时，钙、硅等多种离子的稳定释放，赋予粘合剂良好的体外、体内促成骨活性，使之能在粘合骨组织的基础上有效促进骨折愈合。

Description

一种明胶基骨组织粘合剂、其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及材料技术领域，尤其是涉及一种明胶基骨组织粘合剂、其制 备方法和应用。

背景技术

在骨科的临床实践中，部分粉碎性骨折或撕脱性骨折常造成小块骨折块 的出现，这些体积较小、形状不规则的骨折块的固定存在一定难度与争议， 若通过金属内固定器械固定，可能需要扩大伤口，造成额外的手术伤害；若 不予固定，则可能因为骨折块的微动影响骨折整体的愈合，造成骨折延迟愈 合甚至骨折不愈合。此类骨折块的固定，存在着进退两难的困境，缺少一种 简洁可靠的固定方式。

医用粘合剂作为外科领域的常用工具，在普外科、泌尿外科的手术操作 中有着广泛的应用，其应用简便、粘合可靠，在特殊情况下可以代替缝线进 行吻合、封堵等操作。但骨科的临床操作中，缺少一种类似的粘合剂，可以 通过其粘合作用，对小块的、非承重的骨折块进行固定。

明胶作为I型胶原的变性产物，因其具有良好的生物相容性，一直作为组 织工程领域中的热点基材收到了广泛的研究报道。在骨组织工程领域，明胶 也经常以水凝胶的形式，负载各种生物活性因子促进骨再生与修复而收到报 道。葡聚糖，又称右旋糖酐，是临床常用的医用材料，低分子右旋糖酐被用 作血容量扩容药在人体被应用，因其有着明确的代谢方式与良好的相容性， 也被应用于各种组织工程水凝胶中。氧化态的葡聚糖分子链上具有大量醛基， 其与明胶共混可将明胶交联形成水凝胶，亦可以依靠葡聚糖分子上多余的醛基与组织表面蛋白质上的氨基发生席夫式反应，形成席夫氏碱键，从而达成 水凝胶黏附组织的目的，Taichi就曾报道将明胶与氧化葡聚糖混合而得的水凝 胶应用于腹腔内防粘连。此外，由于明胶和葡聚糖优秀的生物相容性，Wang 也曾报道将此种组合用于组织工程领域。

但是，欲达到骨科用粘合剂的要求，需要水凝胶具备良好的力学稳定性 与成骨活性，以保证粘合剂固定的稳定可靠，同时确保固定后远期的愈合效 果。而现有技术的粘合剂一部分力学性能差，降解性好，一部分力学性能好， 但是降解性和生物相容性差。因此有必要开发一种可对较小的不承重的骨折 块进行临时固定的粘性水凝胶材料，能通过水凝胶本身的促成骨能力促进骨 折愈合，增强固定远期疗效，同时具备良好的生物相容性，操作中具有可注 射性。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种明胶基骨组织粘合剂， 本发明提供的明胶基骨组织粘合剂具有良好的力学性能、降解性、生物相容 性，还可促进骨折部分修复愈合。

本发明提供了一种明胶基骨组织粘合剂的制备，包括：

将氨基化介孔生物活性纳米颗粒与醛基葡萄糖的缓冲溶液混合，预交联 反应，得到预交联溶液；

预交联溶液与明胶的缓冲液混合固化反应，得到明胶基骨组织粘合剂。

优选的，所述醛基葡萄糖由如下方法制备：将葡聚糖和高碘酸钠混合搅 拌反应，透析、过滤、冻干得到醛基葡萄糖。

优选的，所述氨基化介孔生物活性纳米颗粒由如下方法制备：

将四水硝酸钙、正硅酸乙酯和磷酸三乙酯溶于含十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)的缓冲液中并搅拌反应，离心、洗涤、煅烧得到生物活性玻璃纳米颗 粒；将生物活性玻璃纳米颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)在正己烷中混 合并反应，得到氨基化介孔生物活性纳米颗粒。

优选的，所述正硅酸乙酯、四水硝酸钙和磷酸三乙酯中Si:Ca:P的摩尔比 为70～90:10～20:6～10；所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液；所述搅拌反应温度为 50～70℃；反应时间为20～24h；所述离心的转速为10000～12000xg；所述洗涤 为采用乙醇清洗后，采用去离子水清洗；所述煅烧温度为600～700℃；所述煅 烧时间为2～3h；

所述生物活性玻璃纳米颗粒的质量g与APTES体积mL比为(0.3～0.5): (4～6)；所述氨基化反应温度为50～70℃；所述反应时间为20～26h。

优选的，所述氨基化介孔生物活性纳米颗粒的粒径为100～500nm。

优选的，所述醛基葡萄糖的缓冲溶液中醛基葡萄糖的质量与缓冲溶液的 体积的比为10％～20％；所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液；所述明胶的缓冲溶液 中明胶的质量与缓冲溶液的体积的比优选为15％～25％。

优选的，所述氨基化介孔生物活性纳米颗粒的质量与醛基葡萄糖的缓冲 溶液的体积的比为5％～10％；所述预交联溶液与所述明胶的缓冲溶液的体积 比优选为0.8～1.2。

优选的，所述预交联反应的温度为30～50℃；时间为0.5～1h；所述固化反 应的温度为30～50℃；时间为1～5min。

本发明提供了一种明胶基骨组织粘合剂，由上述技术方案任意一项所述 的制备方法制备得到。

本发明提供了上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到明胶基骨 组织粘合剂在非承重部位骨折固定与修复领域中的应用。

与现有技术相比，本发明提供了一种明胶基骨组织粘合剂的制备，包括： 将氨基化介孔生物活性纳米颗粒与醛基葡萄糖的缓冲溶液混合，预交联反应， 得到预交联溶液；预交联溶液与明胶的缓冲液混合固化反应，得到明胶基骨 组织粘合剂。本发明通过过氧化反应，制备醛基葡聚糖，其可与明胶交联形 成水凝胶，交联的同时将水凝胶置于待粘合的组织界面，水凝胶表面部分的 醛基可与组织蛋白中侧链上的氨基反应，生成席夫氏碱键，故此水凝胶可在 交联的同时形成组织黏附；AMBGN强化的骨粘合剂在保留了良好骨组织粘附性能的基础上，具备了显著增强的机械力学性能。同时，体外实验发现， 通过AMBGN与水凝胶网络的稳定整合，水凝胶表面培养的大鼠骨髓间充质 干细胞铺展状态、增值率显著高于添加未改性生物活性玻璃的分组；同时， 钙、硅等多种离子的稳定释放，亦可促进干细胞向成骨方向分化。本实验还 通过兔的桡骨骨折模型，模拟了骨胶在体内的固定及促进骨折愈合的效果， 同时将骨胶与目前临床常用的氰基聚丙烯酸酯粘合剂进行了对比，实验发现， 相较于致密、组织难以长入的人造高分子粘合剂，明胶基水凝胶形式的骨胶 在固定骨折的同时，可促进局部骨折的修复愈合，骨量显著大于其他组。

附图说明

图1(a).醛基葡聚糖合成的化学示意图及红外光谱(FTIR)表征；(b). 生物活性玻璃氨基化改性的化学示意图及FTIR表征；

图2(a)、(b).GelDex/MBGN以及GelDex-AMBGN成胶原理及应用过 程；(c).不同的未改性/改性生物活性玻璃比例的明胶基骨粘合剂的大体观；

图3(a).骨粘合剂成胶过程中储能模量G’与损耗模量G”的流变检测；(b).成胶时间点各组粘合剂的G’比较；(c).各组粘合剂的成胶时间；

图4(a).各组骨粘合剂冻干后的扫描电镜照片；(b；).成胶后的各组骨 胶表面的原子力显微镜微观结构观察与杨氏模量测试

图5(a).骨粘合剂的拉伸实验及拉伸模量计算；(b).骨粘合剂的压缩实 验及压缩模量计算；

图6(a).骨块端对端粘附示意图及拉伸曲线、最大断裂负荷；(b).骨块 剪切方向粘附示意图及拉伸曲线、最大断裂负荷；

图7(a～d).骨髓间充质干细胞(BMSC)细胞贴附的扫面电子显微镜(SEM) 观察(a：氰基丙烯酸酯粘合剂组；b：GelDex组；c：GelDex/MBGN组；d： GelDex-AMBGN组)；(e).BMSC细胞贴附面积的定量比较；(f).BMSC细 胞在各组材料表面的7天的增殖率情况；

图8A:(a～d).各组材料细胞的ALP染色(a：空白对照；b：GelDex组； c：GelDex/MBGN组；d：GelDex-AMBGN组)；(e).ALP活性定量；

B:(a～d).各组材料细胞的茜素红染色(a：空白对照；b：GelDex组；c： GelDex/MBGN组；d：GelDex-AMBGN组)；(e).钙结节定量检测；

图9(a～d).骨粘合剂修复桡骨骨折8周的CT图片(a：氰基丙烯酸酯粘 合剂对照组；b：GelDex组；c：GelDex/MBGN组；d：GelDex-AMBGN组)； (e).骨折缺损局部ROI的BV/TV(骨组织体积与组织总体积)比值；(f). 骨折缺损局部ROI(CT数据分析时设定的感兴趣区域，即骨折缺损区域)的 BMD定量。

具体实施方式

本发明提供了一种明胶基骨组织粘合剂、其制备方法和应用，本领域技 术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所 有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发 明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关 人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改 动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种明胶基骨组织粘合剂的制备，包括：

将氨基化介孔生物活性纳米颗粒与醛基葡萄糖的缓冲溶液混合，预交联 反应，得到预交联溶液；

预交联溶液与明胶的缓冲液混合固化反应，得到明胶基骨组织粘合剂。

本发明首先制备醛基葡萄糖。

本发明对于所述醛基葡萄糖的制备方法不进行限定，本领域技术人员熟 知的即可，优选可以按照如下方式制备：

将葡聚糖和高碘酸钠混合搅拌反应，透析、过滤、冻干得到醛基葡萄糖。

首先将葡聚糖溶于去离子水中，将高碘酸钠溶于去离子水中，在室温、 避光、搅拌的条件下，将高碘酸钠溶液逐滴加入葡聚糖溶液中，随后在室温、 避光条件下磁力搅拌反应，所述反应时间为4～6h。

反应结束后加入乙二醇终止氧化反应，而后将反应体系转移至分子量 3500的透析袋中，置于去离子水中透析36～48h，透析用去离子水每10～12h 更换一次，透析完成后用滤纸对所得产物进行过滤，过滤后产物置于-20度冰 箱预冻，随后冷冻干燥器冻干40～48h得到醛基葡聚糖(Dex-CHO)的干粉。

制备氨基化介孔生物活性纳米颗粒。本发明所述氨基化介孔生物活性纳 米颗粒可以为45S生物活性纳米颗粒、80S生物活性纳米颗粒，本发明对此不 进行限定。

本发明氨基化生物活性玻璃颗粒相对未氨基化颗粒克服了直接添加纳米 颗粒导致粘合剂生物相容性下降、理化性能强化效果有限的问题。

按照本发明，所述制备氨基化介孔生物活性纳米颗粒优选具体为：将四 水硝酸钙、正硅酸乙酯和磷酸三乙酯溶于含CTAB的缓冲液中并搅拌反应 24h，离心、洗涤、煅烧得到生物活性玻璃纳米颗粒；将生物活性玻璃纳米颗 粒与APTES在正己烷中混合并反应，得到氨基化介孔生物活性纳米颗粒。

首先配置pH为8的Tris-HCl缓冲液，将CTAB在油浴下持续搅拌直至完 全溶解，随后依次加入反应原料：四水硝酸钙(CN)、正硅酸乙酯(TEOS) 及磷酸三乙酯(TEP)，并在油浴下搅拌反应。

所述正硅酸乙酯、四水硝酸钙和磷酸三乙酯中Si:Ca:P的摩尔比优选为 70～90:10～20:6～10；更优选为80:16:4；所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液；所述 搅拌反应温度优选为50℃～70℃；更优选为60℃～65℃；所述搅拌反应时间优 选为20～24h；更优选为22～24h。

反应结束离心分离纳米颗粒，随后在无水乙醇中重悬并超声振荡，再次 以相同条件离心，所述离心的转速为10000～12000xg。

离心后为清洗，所述洗涤为采用乙醇清洗后，采用去离子水清洗；优选 可以具体为：重复3次乙醇冲洗，随后改用去离子水冲洗3次。

优选具体为：分别用乙醇和去离子水清洗球三次，每次清洗后通过 12000xg离心去除上清液，这两步步骤的目的为将合成后的微球表面残余的有 机溶剂等杂质清洗掉。

最后将烘干后的颗粒煅烧，得到MBGN。

本发明所述煅烧温度优选为600～700℃；所述煅烧时间优选为2～3h。

将生物活性玻璃纳米颗粒与APTES混合氨基化反应，得到氨基化介孔生 物活性纳米颗粒。

优选具体为：将MBGN置于己烷中振荡均匀，随后加入APTES，搅拌反 应。所述生物活性玻璃纳米颗粒的质量g与APTES体积mL比优选为(0.3～0.5): (4～6)；所述氨基化反应温度为50～70℃；所述反应时间为20～26h。

反应产物经过离心后进行分别三次醇洗及三次水洗，最终得到氨基化的 MBGN，即为AMBGN(aminated MBGN)。

上述制备得到的所述氨基化介孔生物活性纳米颗粒的粒径优选为 100～500nm；更优选为200～300nm；将氨基化介孔生物活性纳米颗粒与醛基葡 萄糖的缓冲溶液混合，预交联反应，得到预交联溶液。所述预交联反应为超 声震荡反应；所述预交联反应的温度为30～50℃；时间为0.5～1h。

将醛基葡萄糖溶于缓冲溶液中，得到醛基葡萄糖的缓冲溶液；所述醛基 葡萄糖的缓冲溶液中醛基葡萄糖的质量与缓冲溶液的体积的比优选为 10％～20％；更优选为10％～15％；最优选为10％。所述缓冲溶液为PBS缓冲 溶液。

其中，所述氨基化介孔生物活性纳米颗粒的质量与醛基葡萄糖的缓冲溶 液的体积的比优选为5％～10％；更优选为6％～8％。

预交联反应后，再与明胶的缓冲液混合固化反应，得到明胶基骨组织粘 合剂。

将明胶溶于缓冲溶液中，得到明胶的缓冲溶液；本发明所述明胶的缓冲 溶液中明胶的质量与缓冲溶液的体积的比优选为15％～25％；更优选为 20％～25％。所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液。

按照本发明，所述预交联溶液与所述明胶的缓冲溶液的体积比优选为 0.8～1.2；更优选为1。

本发明所述固化反应的温度为30～50℃；时间为1～5min。本发明固化反 应静置即可。

在实际应用时，将未成胶明胶基骨粘合剂注入到骨折块间，待其固化后， 即在成胶的同时达成黏附骨组织的作用。逐层缝合肌肉、皮肤，并再次用碘 伏消毒皮肤，即可。

本发明提供了一种明胶基骨组织粘合剂，由上述技术方案任意一项所述 的制备方法制备得到。

本发明提供了上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到明胶基骨 组织粘合剂在非承重部位骨折固定与修复领域中的应用。

本发明提供了一种明胶基骨组织粘合剂的制备，包括：将氨基化介孔生 物活性纳米颗粒与醛基葡萄糖的缓冲溶液混合，预交联反应，得到预交联溶 液；预交联溶液与明胶的缓冲液混合固化反应，得到明胶基骨组织粘合剂。 本发明通过过氧化反应，制备醛基葡聚糖，其可与明胶交联形成水凝胶，交 联的同时将水凝胶置于待粘合的组织界面，水凝胶表面部分的醛基可与组织 蛋白中侧链上的氨基反应，生成席夫氏碱键，故此水凝胶可在交联的同时形 成组织黏附；AMBGN强化的骨粘合剂在保留了良好骨组织粘附性能的基础 上，具备了显著增强的机械力学性能。同时，体外实验发现，通过AMBGN 与水凝胶网络的稳定整合，水凝胶表面培养的大鼠骨髓间充质干细胞铺展状 态、增值率显著高于添加未改性生物活性玻璃的分组；同时，钙、硅等多种 离子的稳定释放，亦可促进干细胞向成骨方向分化。本实验还通过兔的桡骨 骨折模型，模拟了骨胶在体内的固定及促进骨折愈合的效果，同时将骨胶与 目前临床常用的氰基聚丙烯酸酯粘合剂进行了对比，实验发现，相较于致密、 组织难以长入的人造高分子粘合剂，明胶基水凝胶形式的骨胶在固定骨折的 同时，可促进局部骨折的修复愈合，骨量显著大于其他组。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种明胶基骨 组织粘合剂、其制备方法和应用进行详细描述。

实施例1

改性生物活性玻璃纳米颗粒强化的明胶基骨组织粘合剂的合成：

1.醛基葡聚糖的制备

将5g葡聚糖溶于100ml去离子水中，5g高碘酸钠溶于60ml去离子水中， 在室温、避光、搅拌的条件下，将高碘酸钠溶液逐滴加入葡聚糖溶液中，随 后在室温、避光条件下磁力搅拌，反应6h。反应结束后向反应体系内加入1ml 乙二醇中止氧化反应。随后将反应体系转移至分子量3500的透析袋中，置于 去离子水中透析48h，透析用去离子水每12h更换一次，透析完成后用滤纸对 所得产物进行过滤，过滤后产物置于-20度冰箱预冻，随后冷冻干燥器冻干48h 得到醛基葡聚糖(Dex-CHO)的干粉。

2.生物活性玻璃纳米颗粒的制备及其改性

首先配置pH为8的Tris-HCl缓冲液，取100ml置于圆底烧瓶内，称取 0.6g CTAB加入圆底烧瓶并在60℃油浴下持续搅拌直至完全溶解，随后依次加 入反应原料：四水硝酸钙(CN)、正硅酸乙酯(TEOS)及磷酸三乙酯(TEP)， 并在60℃油浴下搅拌反应24h，反应结束后通过12000xg离心分离纳米颗粒， 随后在无水乙醇中重悬并超声振荡，再次以相同条件离心，重复3次乙醇冲 洗，随后改用去离子水冲洗3次，最后将颗粒烘干后以650℃煅烧3小时，得 到MBGN.

将0.4gMBGN置于100ml己烷中振荡均匀，随后加入5mlAPTES，60℃ 下搅拌反应24h，反应产物经过离心后进行分别三次醇洗及三次水洗，最终得 到氨基化的MBGN(AMBGN)。

3.粘合剂的成胶过程

将Dex-CHO以10％(m/v)的浓度溶于PBS溶液，明胶以20％(m/v) 的浓度溶于PBS溶液；对于GelDex的成胶：将Dex-CHO与明胶的PBS溶液 等体积混合，充分混匀后置于37度水浴中10min，即可充分成胶得到GelDex 水凝胶；对于GelDex/MBGN的成胶：将MBGN以6％(m/v)的比例加入到 Dex-CHO的PBS溶液中37度水浴下超声振荡1h，随后将混合均匀的溶液与等体积的明胶的PBS溶液混合，充分混匀后在37℃条件下静置10min，即可 得到成胶的GelDex/MBGN水凝胶；对于GelDex-AMBGN的成胶,将AMBGN 以6％(m/v)的比例加入到Dex-CHO的PBS溶液中，在37℃水浴条件下超 声振荡1h，将反应所得体系加入到等体积明胶的PBS溶液中，充分混匀后静 置于37度环境下10min，即可成胶得到GelDex-AMBGN水凝胶。

实施例2明胶基骨粘合剂理化性能表征

1.傅里叶变换红外光谱(FTIR)

将冷却干燥后的各组明胶基骨粘合剂,与溴化钾按照1/50的质量比混合并 均匀研磨，在置入压片机中制备相应的片状样品，在Nicolet 560采用 ATR-FTIR模式扫描样品，设置分辨率为4cm-1，扫描波长为400～4000cm-1， 通过所得不同的曲线分析材料改性前后化学结构的异同。

结果如图1所示，图1.(a).醛基葡聚糖合成的化学示意图及FTIR表征； (b).生物活性玻璃氨基化改性的化学示意图及FTIR表征。本发明通过FTIR 证明醛基葡聚糖的成功合成和MBGN的是否氨基化。如图1a所示：葡聚糖 经过氧化反应后，FTIR曲线位于1731cm^-1处出现了反映醛基存在的波峰，说 明氧化反应成功在葡聚糖分子链上生成大量醛基，为后续实验中的骨粘合剂 的成胶、黏附活动提供了化学基础。由图1b所示：经过APTES改性的MBG亦被证明在表面含有大量接枝的氨基，并在1535cm^-1处形成了代表氨基的波 峰，证明氨基化修饰成功。

2、改性生物活性玻璃纳米颗粒强化的明胶基骨粘合剂的合成制备及成胶 原理及大体图如图2所示，图2.(a)、(b).GelDex/MBGN以及GelDex-AMBGN 成胶原理及应用过程；(c).不同的未改性/改性生物活性玻璃比例的明胶基骨 粘合剂的大体观查。

对于GelDex/MGBN成胶过程如图2a所示：在氧化葡聚糖溶液中添加未 改性的MBGN，MBGN不会与氧化葡聚糖发生任何反应，随后将混合物与明 胶溶液混合并在涂抹于待粘接的骨组织表面。在37℃条件下即可成胶粘合骨 组织。而对于GelDex-AMGBN的成胶过程则如图2b所示，首先将氨基化修 饰所得的AMBGN加入氧化葡聚糖溶液中，通过席夫氏反应在两者间形成共 价键联系，再将所得产物与明胶溶液混合，涂抹于骨组织表面，待其成胶后 及形成粘合。由于席夫氏反应的发生可使反应体系颜色向黄色转变，大体图 如图2c所示：添加AMBGN比例越多的骨粘合剂颜色越偏黄。骨粘合剂的成 胶过程可通过简单共混实现，操作简便，成胶时间短，成胶后的骨粘合剂力 学性能稳定，弹性好。

3、明胶基骨粘合剂成胶过程的流变学表征

将充分混匀后未成胶的骨粘合剂迅速滴加于流变测试仪载样台上，设置 间隙为0.5mm，载样台温度37℃，使用时间扫描模式(time sweep)监测骨粘 合剂成胶过程中G’与G”的变化情况。结果如图3所示，图3.(a).骨粘合 剂成胶过程中G’与G”的流变检测；(b).成胶时间点各组粘合剂的G’比较； (c).各组粘合剂的成胶时间

水凝胶的流变学中，通常认为：当储能模量G’等于或大于粘性模量G” 时，可认为测试的样品成胶。通过运用流变仪观察并记录不同组别骨粘合剂 成胶过程中的G’及G”曲线，可以发现：如图3a、c所示，添加了氨基化生物 活性玻璃微球的粘合剂G’与G”的交叉点出现时间显著短于未添加或添加未 改性生物活性玻璃微球的粘合剂。且如图3b所示GelDex-AMBGN在成胶后 不同时间点的储能模量也均大于GelDex及GelDex/MBGN组。较短的成胶时 间便于粘合剂在术中的快速固定，节省手术时间且可减少成胶不及时造成的 粘合剂渗漏的问题。

4、扫描电子显微镜(SEM)

骨粘合剂成胶后置于-20℃下预冻24h，随后用冷冻干燥机干燥48h得到冻 干的骨粘合剂，通过脆断和病理切片刀得到横断面结构，将样品进行表面喷 金后，在SEM下以10kv的电压下观察样品内部结构并拍摄图片。结果如图4 所示，图4.(a).各组骨粘合剂冻干后的扫描电镜照片；(b).各组骨粘合剂 的体外溶胀曲线；(c).各组骨粘合剂的体外降解曲线。

本发明使用扫描电子显微镜对明胶基骨粘合剂冻干后的内部结构，如图 4a所示：各组明胶基骨粘合剂在冻干后内部都表现为多孔结构，未添加生物 活性玻璃颗粒的GelDex组表现为孔壁光滑的，添加生物活性玻璃的组别： GelDex/MBGN与GelDex-AMBGN则表现为类似的多孔结构，但孔壁表面可 见均匀分布的生物活性玻璃微球。

骨粘合剂的在体内生理环境下保持形态稳定对于其固定作用的维持有重 要作用。明胶基水凝胶材料的溶胀可对其力学稳定性及结构完整性造成影响， 骨胶作为一种骨折块的固定方式，在生理环境下需要具有比较稳定的溶胀性 能。如图4b所示：通过溶胀实验我们发现，添加未改性MBGN的 GelDex/MBGN可在一定程度上降低了原GelDex的溶胀率，这种现象主要来 源于纳米颗粒在水凝胶网络中的物理占位作用；添加AMBGN相比未改性MBGN则可进一步降低溶胀率，因为GelDex-AMBGN的溶胀率的降低不仅 来源于AMBGN的物理添加作用，还来自于AMBGN表面氨基与葡聚糖分子 链上的醛基所发生的席夫氏碱反应所带来的高交联密度。溶胀稳定性的提升， 也有利于骨粘合剂稳定粘合。

此外，明胶基水凝胶往往存在降解过快、降解速度不可控等问题，体内 过快的降解可能导致固定不稳甚至失效，通过添加AMBGN，GelDex-AMBGN 在成胶之前对醛基葡聚糖进行了一次预交联，显著提高了水凝胶的交联密度。 如图4c所示：根据体外降解实验可知：GelDex-AMBGN在经过一个月的体外 降解后，降解率显著低于GelDex与GelDex/MBGN，可见AMBGN的添加显 著改善了明胶基骨粘合剂的结构稳定性。

5、明胶基骨粘合剂的力学性能表征

按照前述的成胶方法，将不同组别待成胶的骨粘合剂注入到圆柱形及哑 铃状模具中充分成胶10min，随后从模具中取出浸泡于PBS溶液中，并置于 37℃恒温摇床中振荡过夜，随后使用通用力学测试仪测试样品的压缩模量及拉 伸模量，测试时压缩速度设定为5mm/min，拉伸速度设定为10mm/min，获得 力值-形变量曲线，通过换算得出应力-应变曲线，并根据曲线过原点处的斜率， 分别得出明胶基骨粘合剂成胶后的压缩模量与拉伸模量。结果如图5所示，. (a).骨粘合剂的拉伸实验及拉伸模量计算；(b).骨粘合剂的压缩实验及压 缩模量计算。

单纯明胶基水凝胶力学性能不足是限制其在骨组织工程及骨粘合剂方面 运用的重要因素。为了进一步探索不同组别骨粘合剂的力学强度，了解不同 生物活性玻璃颗粒对骨粘合剂的力学强化作用。本实验对充分成胶的各组骨 粘合剂的压缩模量及弹性模量进行了表征，如图5a、b所示：添加未改性的 生物活性玻璃微球，尽管可提高单纯明胶基骨粘合剂的压缩模量和拉伸模量， 但模量提高的程度比较有限，但添加氨基化改性的AMBGN可在物理混合的 基础上，与粘合剂中的葡聚糖网络形成化学层面的整合，提高了水凝胶的化学交联密度，可进一步强化水凝胶的压缩模量和拉伸模量：压缩模量和拉伸 模量相较于添加未改性MBGN的组别分别提升至43.19kPa及35.11kPa，前者 的提升具有显著性。

6、明胶基骨粘合剂的黏附性能表征

使用线锯将新鲜的猪长骨骨骺的骨松质部分锯成形状固定的长方体，所 有骨块现锯现用，实验前保存于PBS中。按照前述的成胶方法，将20μL不 同组别待成胶的骨粘合剂注入到待粘合的松质骨界面上，同时将待粘接的骨 块固定于上述界面，将粘接的骨块置于37℃环境下10min使粘合剂充分成胶。 随后将粘接的骨块置于PBS溶液中等待进一步力学测试；使用通用力学测试 仪测试粘接的骨块在垂直的端对端方向及水平的剪切方向上粘接面的最大断 裂强度。结果如图6所示，图6.(a).骨块端对端粘附示意图及拉伸曲线、 最大断裂负荷；(b).骨块剪切方向粘附示意图及拉伸曲线、最大断裂负荷。

随后，通过测试骨块粘合在不同方向上的力学强度，我们发现，尽管理 论上添加氨基化改性的AMBGN会通过席夫氏碱反应，消耗掉一部分葡聚糖 分子链上的醛基，但这种程度的消耗未导致添加了AMBGN的水凝胶黏附性 能上的衰减，相反地，我们发现如图6a所示：相较于未添加无机成分的 GelDex，通过添加未改性和改性MBGN所获得的GelDex/MBGN及 GelDex-AMBGN粘合剂的最大断裂强度在端对端拉伸测试有一定程度的提 高：相较于未添加MBGN的GelDex组(23.22kPa)，添加了未改性MBGN的 GelDex/MBGN组，最大粘合强度达到了42.31kPa，而添加了AMBGN的 GelDex-AMBGN组则达到了72.13kPa。图6b则示：剪切方向拉伸实验中， 各组明胶基骨粘合剂之间未见显著性差异。由此可见，MBGN微球的添加， 不论是改性还是未改性者，均不会降低明胶骨粘合剂的黏附力学性能，甚至 可以提高端对端测试时的最大粘合强度。值得注意的是：骨粘合剂粘接的骨 块在端对端方向拉断后，两头的断面都有骨粘合剂残留，这说明粘合面的断 裂，发生在粘合剂本身，而不在粘合剂和骨块之间。

实施例3

细胞在明胶基骨粘合剂表面的生长及分化

1.细胞形态的SEM观察以及细胞铺展面积的定量

将50μL待成胶的明胶基骨粘合剂注入到48孔板中铺平并在37℃环境下 充分成胶，将同样体积的α-氰基丙烯酸酯注入到48孔板中，通过γ射线进行 消毒后用于以下细胞实验。

使用代次在第三代至第九代之间的间充质干细胞(BMSC)，并使用0.25％ 的胰酶对细胞进行消化，1500转/分离心，使用培养基进行重悬后，通过细胞 计数板对细胞悬液的细胞浓度进行测试，随后按照10000/孔的细胞量将细胞 悬液种于之前准备的48孔板中，以空白板作为对照，分别培养24小时，随 后将培养基吸出，并用4％的多聚甲醛溶液对细胞进行固定15min，固定后用 PBS溶液冲洗3次后使用不同浓度乙醇(10％，30％，50％，70％，85％，90％， 100％)对细胞进行梯度脱水，脱水完成后将贴附有细胞的明胶基骨粘合剂置于临界点干燥仪中进行干燥，所得样本喷金60s后置于扫描电子显微镜，以 10kV电压进行观察拍摄。所得图片使用ImageJ软件对细胞的铺展面积进行定 量研究。

细胞在早期一定时间内在材料表面的贴附、铺展情况可以反映出材料的 细胞亲和性与相容性。在将一定量的骨髓间充质干细胞(BMSC)种于三个组 别的明胶基骨粘合剂及α-氰基丙烯酸酯上，共培养24h后通过扫描电镜进行 观察，细胞在材料表面的贴附如图7a所示，可见α-氰基丙烯酸酯表面的细胞 贴附极少，且贴附的形态较差，基本保持了悬浮状态的圆形，这样的情况主 要是由α-氰基丙烯酸酯这种高分子水凝胶本身的化学性质决定，人造高分子 分子链上缺乏可供细胞识别的黏附序列，且其在接触组织成胶的过程中会释 放出部分毒性副产物，以上因素综合导致了细胞在这种材料表面较差的贴附 情况。对于三组明胶基骨粘合剂，如图7b～d所示，可见在未添加MBGN的 GelDex组，细胞铺展形态良好，铺展面积巨大，可见尽管葡聚糖分子链上的 醛基具有一定的细胞毒性，但由于明胶分子上大量的氨基存在可以在成胶后 充分中和这些过量的醛基，且由于明胶作为胶原蛋白的变性产物，分子量上 具有大量注入RGD、GFOGER等适合细胞黏附的多肽序列，以上因素综合作 用带来了GelDex组良好的细胞贴附状态。而两种添加了MBGN的骨粘合剂， 在细胞贴附形态上展现出了显著的差异：BMSC在添加了氨基化改性的 MBGN的骨粘合剂(GelDex-AMBGN)表面所表现的贴附形态显著优于添加 了未改性MBGN的GelDex/MBGN组，如图7e中定量分析所示：细胞在 GelDex-AMBGN表面的贴附面积较GelDex/MBGN有接近3倍的提高，但GelDex-AMBGN在细胞表面的铺展面积仍略低于未添加MBGN的GelDex组， 可见MBGN的添加对细胞相容性的影响难以完全避免。

2.细胞增殖率的测定

用前述方法消化间充质干细胞(BMSC)得到一定浓度的BMSC悬液， 并以10000/孔的浓度将细胞种至铺有各组明胶基骨粘合剂及α-氰基丙烯酸酯 的48孔板中，以空白板作为对照，对细胞进行培养，分别在1天、3天、5 天、7天后使用CCK-8试剂盒对细胞在各组材料及空白板的上增殖率进行定 量。

细胞在材料表面的增殖率变化可以反应材料中成分对细胞生长所带来的 影响，通过在细胞与各组材料共培养不同时间后，使用CCK-8试剂盒对增殖 情况进行了测试，测试细胞在不同粘合剂表面的短期增殖表现，得到如图7f 可见：在共培养第一天及第三天时，三组未表现出显著性差异，表现为氰基 丙烯酸酯粘合剂组和GelDex/MBGN增殖率略差于其余各组。但在从第五天开 始，空白组及GelDex组的增殖率逐渐高于添加了MBGN的GelDex/MBGN 和GelDex-AMBGN组，后两者中，GelDex-AMBGN的增殖率又显著高于 GelDex/MBGN组。BMSC在氰基丙烯酸酯粘合剂组上的增殖率为所有组别中 最低。

3.细胞成骨诱导分化的研究

用前述方法消化间充质干细胞(BMSC)，并以10000/孔的浓度将细胞种 至各组材料上，培养若干时间后融合率达到80％～90％时，将培养基换为成骨 诱导培养基，每隔2天换液一次，当镜下出现钙结节时每隔1天半量换液一 次。使用ALP染色试剂盒在诱导第7天对细胞进行染色，并用定量试剂盒对 ALP进行定量检测。使用茜素红染料对在诱导第21天对细胞钙结节进行染色， 使用倒置显微镜观察染色情况并拍摄照片，并用高氯酸溶液溶解钙结节，在 使用酶标仪在波长490处定量分析钙结节生成量。

碱性磷酸酶(ALP)作为干细胞成骨分化的一个早期标志物，可用于表征 材料对干细胞成骨的早期影响，通过BMSC与不同组别的明胶基骨粘合剂进 行不同时间的成骨诱导培养后，对共培养的细胞进行ALP的染色和定量分析， 如图8所示，可以发现：在细胞与材料在共培养7天后，ALP的表达有着较 显著的区别：两组添加了MBGN的骨粘合剂(GelDex/MBGN与 GelDex-AMBGN)ALP染色相较于未添加MBGN的GelDex组和空白对照组， 染色更深，ALP活动显著升高。通过运用ALP定量试剂盒，我们也找到了类 似的趋势：不论是否改性，MBGN都能显著提升BMSC早期成骨活性，而 GelDex/MBGN与GelDex-AMBGN之间未发现有统计学差异。

干细胞与材料成骨诱导共培养较长时间后所产生的钙结节，是反应BMSC 在诱导晚期成骨活性的一个重要指标，通过使用茜素红染料对钙结节进行染 色，可以观察经过较长时间的共培养后，各组明胶基骨粘合剂所带来的促成 骨效应，同时，可以使用高氯酸溶液对钙结节进行溶解并显色，可通过酶标 仪分析，定量比较不同组别远期促成骨效应。如图9所示，可见在21天后的 诱导培养后，GelDex-AMBGN中红染的钙结节显著多余GelDex/MBGN，而 后者钙结节的形成又显著多于GelDex组和空白对照组。定量分析也验证了GelDex-AMBGN相较于GelDex/MBGN显著提高的钙结节生成，表现出 GelDex-AMBGN在晚期成骨作用上具有较强的促进功能。

实施例4

1.新西兰大白兔桡骨骨折模型的制备

使用10％的水合氯醛溶液按照7ml/kg的剂量对兔进行腹腔内注射麻醉， 随后剔除前肢毛发并用碘伏消毒，做一纵行切口并逐层暴露组织直到暴露桡 骨，剥去表面骨膜并使用电锯在桡骨约外、中1/3交界处做一3mm的骨折缺 损，使用纱布充分止血，随后将约30μL的未成胶明胶基骨粘合剂或α-氰基丙 烯酸酯注入到缺损中，待其固化后，逐层缝合肌肉、皮肤，并再次用碘伏消 毒皮肤。术后三天每天给予青霉素80万单位/只，肌肉注射。饲养8周后通过 注射空气针对兔进行安乐死，取出尺桡骨，并置于10％福尔马林溶液中进行 固定。

2.2.3 Micro-CT

对固定后的尺桡骨标本进行Micro-CT扫描，扫描的参数为：65kV电压， 385μA电流，18μm分辨率，随后用Mimic、CTAn等软件对Micro-CT数据 进行重建及定量分析，并通过划定一个固定体积的感兴趣区域(Region of interest,ROI),得到其中新生骨体积(Bonevolume,BV,mm3)和感兴趣区域 总体积(Total volume,TV,mm3)，并计算相对骨含量(BV/TV,％)，同时分析 ROI空间内的骨矿密度(Bone mineral density,BMD,mg/cm3)。

通过各组别明胶基骨粘合剂粘合兔的桡骨骨折模型，研究了骨粘 合剂的体内生物学性能。需要提及的是：兔的尺桡骨模型，由于尺骨 承担了兔前肢的大部分负荷，单独的桡骨骨折经过粘合剂填充后，粘 接部分不会收到过大的应力负荷，可以模拟体内经过某些金属内固定 器械固定后，再用粘合剂粘接小片骨折块的情况。在动物手术中注入 粘合剂的实际操作中，在经过8周的体内实验后，Micro-CT的表征发 现：如图9a～d所示，采用氰基丙烯酸酯的对照组在经过8个月时间后， 仍有大量材料在骨缺损处无法降解，导致骨折愈合不良，CT横断面 扫描可见大量孔隙被材料占据，骨组织无法长入。而明胶基粘合剂组 降解良好，骨折两端骨性连接基本形成，其中以GelDex-AMBGN组 愈合效果为最佳。通过CT数据处理软件分析可得如图9e、f所示： GelDex-AMBGN组骨折局部区域的ROI内的新生骨占比(BV/TV)、 骨矿密度(BMD)均高于GelDex及GelDex/MBGN组。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种明胶基骨组织粘合剂的制备方法，其特征在于，包括：

将氨基化介孔生物活性玻璃纳米颗粒与醛基葡聚糖的缓冲溶液混合，预交联反应，得到预交联溶液；

预交联溶液与明胶的缓冲液混合固化反应，得到明胶基骨组织粘合剂。

2.根据权利要求1所述的粘合剂的制备方法，其特征在于，所述醛基葡聚糖由如下方法制备：将葡聚糖和高碘酸钠混合搅拌反应，透析、过滤、冻干得到醛基葡聚糖。

3.根据权利要求1所述的粘合剂的制备方法，其特征在于，所述氨基化介孔生物活性玻璃纳米颗粒由如下方法制备：

将四水硝酸钙、正硅酸乙酯和磷酸三乙酯溶于含十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的缓冲液中并搅拌反应，离心、洗涤、煅烧得到生物活性玻璃纳米颗粒；将生物活性玻璃纳米颗粒与3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)在正己烷中混合并氨基化反应，得到氨基化介孔生物活性玻璃纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的粘合剂的制备方法，其特征在于，所述正硅酸乙酯、四水硝酸钙和磷酸三乙酯中Si:Ca:P的摩尔比为 70~90:10~20:6~10；

所述缓冲液为Tris-HCl缓冲液；所述搅拌反应温度为50~70℃；反应时间为20~24h；所述离心的转速为10000~12000×g；所述洗涤为采用乙醇清洗后，采用去离子水清洗；所述煅烧温度为600~700℃；所述煅烧时间为2~3h；

所述生物活性玻璃纳米颗粒的质量g与APTES体积mL比为（0.3~0.5）: （4~6）；所述氨基化反应温度为50~70℃；所述氨基化反应时间为20~26h。

5.根据权利要求1所述的粘合剂的制备方法，其特征在于，所述氨基化介孔生物活性玻璃纳米颗粒的粒径为100~500nm。

6.根据权利要求1所述的粘合剂的制备方法，其特征在于，所述醛基葡聚糖的缓冲溶液中醛基葡聚糖的质量与缓冲溶液的体积的比为10%~20%；所述缓冲溶液为PBS缓冲溶液；所述明胶的缓冲溶液中明胶的质量与缓冲溶液的体积的比为15%~25%。

7.根据权利要求6所述的粘合剂的制备方法，其特征在于，所述氨基化介孔生物活性玻璃纳米颗粒的质量与醛基葡聚糖的缓冲溶液的体积的比为5%~10%；所述预交联溶液与所述明胶的缓冲溶液的体积比为0.8~1.2。

8.根据权利要求1所述的粘合剂的制备方法，其特征在于，所述预交联反应的温度为30~50℃；时间为0.5~1h；所述固化反应的温度为30~50℃；时间为1~5min。

9.一种明胶基骨组织粘合剂，其特征在于，由权利要求1~8任意一项所述的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的明胶基骨组织粘合剂在制备非承重部位骨折固定与修复材料领域中的应用。

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