CN112055599A - 多维止血产品及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及打印的止血产品，其具有至少三个维度且由从第一外层直至第二外层沉积在彼此之上的叠层制成，其中所述叠层的相邻层接合在一起，和其中所述叠层的至少一层具有由止血流动剂制成的至少一部分，所述止血流动剂的组成包括：‑非交联的原纤维型胶原，其包含含量为相对于胶原的总重量至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；和‑至少一种单糖。本发明还涉及用三维增材打印机形成这样的止血产品的方法、和止血流动剂在这样的三维增材打印机中作为打印墨的用途。

Description

多维止血产品及其制造方法
技术领域
本发明涉及止血组合物(组成，composition)领域，特别是涉及打印的止血产品例如三维(3D)止血产品，并且涉及用于制造这样的三维止血产品的方法。
背景技术
伤口，无论是外部的还是内部的、创伤性的还是手术性的，均频繁地导致出血。这种出血可或多或少为显著的。出血经由一组称为“止血”的生理现象来防止和阻止。止血有助于修复血管破裂，并且通常确保维持血管和组织完整性。
当血管受伤时，触发包括各种阶段的自然机制以阻止血液流动。首先，减缓出血的血管收缩(vasoconstriction)持续15至60秒，并诱发一连串复杂反应。在血小板栓塞周围形成由纤维蛋白构成的纤维网：形成最终的血栓，并且通过使纤维蛋白稳定化的因子XIII而保护其免于过早溶解。最后，纤维蛋白网拉得更紧(紧缩)并且伤口的边缘合在一起：伤口收缩。在稳定的交联纤维蛋白内，成纤维细胞然后可生长并组织成血栓内的结合基质(conjunctive matrix)并最终使伤口闭合。
循环血液中不存在固体纤维蛋白；如果存在则其会立即阻塞至关重要的血管。然而，存在纤维蛋白的前体—纤维蛋白原。在凝血酶(其合成通过凝血因子而激活)的作用下，纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白。
最后，在伤口成功愈合后的数天或数周，纤维蛋白簇在纤维蛋白溶解期间被破坏。
尽管存在这种生化现象，但经常需要“人工地”进行止血，特别是在伤口太大的情况下或者在弥漫性出血的情况下。
存在用于帮助获得止血的“机械”解决方案，比如按压、绷带和电凝，它们用作一线疗法。然而，这些解决方案在一定数量的情况下收效甚微或没有效果，例如，渗出性毛细血管出血，富血管器官(如脾脏或肝脏)的出血，导致弥漫性出血的出血，例如骨骼，和/或在神经外科手术中。
还存在“化学”解决方案，特别是以某些现有的止血产品实施的“化学”解决方案。所述化学解决方案的组分大体为“吸收性”或“活性”类型的。
吸收性止血产品，特别是包含多糖比如再生氧化纤维素或藻酸盐的吸收性止血产品，主要通过机械作用和简单吸收起作用。它们经常出现过度溶胀的问题。如果所述溶胀导致液体特别是血液的快速吸收，则当在“封闭”环境中例如与硬脑膜接触或在泌尿科中使用时，它还可导致不希望的压力。
另外，某些产品，特别是包含植物多糖比如纤维素或藻酸盐的那些，可在其再吸收期间进一步引起炎症反应和/或可导致宿主不识别的降解产物。其后果是希望除去这些产物，使得它们不留在体内，从而不产生这些不利影响。
活性止血产品，比如含有凝血酶或纤维蛋白的产品，通常是血液衍生的产品。这些产品涉及过敏和疾病传播的风险，特别是在疾病载体不会通过惯用处理而灭活的情况下尤为如此。此外，所述下游处理通常是复杂的和/或昂贵的。最后，一般来说，它们可能需要在使用前进行准备，这就紧急情况而言可能是一种约束，实际上是一种麻烦。
此外，含有纤维蛋白和凝血酶两者的产品将它们的作用模式建立在包括该产品的两种血液衍生产品之间的相互作用的基础上。反应可偶尔在不与血液相互作用的情况下发生，在这种情况下产品被说成浮动的(float)。换句话说，产品被继续流动的血液推开，可能导致产品变稀或在血液顶上凝血和形成凝胶，在该情形中血液流动未被阻断。因此，无法实现止血。
在2012年11月1日以编号WO2012/146655公布的国际申请中已经公开了止血粉末、其制备方法和使用方法，其内容通过引用整体并入本申请中。
这种止血粉末具有令人满意的吸收能力、良好的止血能力、几乎没有副作用、良好的锚定在伤口边缘的能力以及在使用它的血流中令人满意的渗透和/或有限溶胀。
除了这些良好的止血性能之外，这种止血粉末还表现出的优点是具有非常好的流动性，这使其能够喷雾在出血区域上。它可在大多数外科手术，比如剖腹手术、腹腔镜检查、体腔镜检查(coelioscopy)以及机器人手术技术，中施用。
所述止血粉末可直接施加在出血区域上而无需外科医生的专门准备，这是另一个优点。
有时可能需要使用特定的粉末分配器以易于将止血粉末施加在非常特定的出血区域上。
本发明的目的在于提出如下止血产品：其使用简单并且尤其不需要复杂的准备过程，其可进一步容易地施加在特定区域上以覆盖整个目标出血区域。
本发明的另一目的在于提出如下止血产品：其具有良好的止血功效、和较之于现有止血产品提升的功效。
本发明的又一目的在于提出如下止血产品：其可适应于非常特定的患者需求，并且可容易地制造。
本发明进一步的目的在于提出如下止血产品：其可在多重(multiple)出血区域中和/或在出血区域具有复杂形式的情况下使用。
本发明的目的还在于提出易于实施并且使得能够形成复杂三维止血产品的三维止血产品制造方法。
发明内容
为此，提出了如所附权利要求中限定的多维止血产品、其制造方法、和止血流动剂(可流动物，flowable)的用途。
更准确地，提出了如下三维止血产品：其由从第一外层直至第二外层沉积在彼此之上(on one another)的叠层(层堆叠体，stack of layers)制成，其中相邻层接合在一起，其特征在于所述叠层的第一外层和第二外层的至少一个由如下的止血流动性混合物(流动剂混合物，flowable mixture)制成：
-原纤维型胶原，这样的胶原优选为非交联的，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；
-至少一种单糖；和
-至少一种糖胺聚糖。
这样的三维止血产品的优选的但非限制性方面(取单独地或以组合)于下：
-所述叠层的第一外层和第二外层具有相同组成。
-所述叠层的各层具有由与所述第一外层和第二外层的至少一个的流动性混合物相同的流动性混合物制成的周缘。
-所述叠层的所有层具有相同组成。
还提出了止血流动剂在三维打印机中作为打印墨(printing ink)的用途，其中所述止血流动剂由与盐水溶液混合的止血粉末制成，其中所述止血粉末具有包括如下的组成：
-非交联的原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；
-至少一种单糖；和
-至少一种糖胺聚糖。
进一步提出了用三维增材打印机制造三维止血产品的方法，其包括以下步骤：
-向三维增材打印机提供三维模型，所述三维模型对应于所要制造的三维止血产品的形状，和处理所述三维模型以用多个层限定打印图案，所述多个层设计成在彼此之上层叠(堆叠，stack)以形成对应于三维模型的叠层；
-向三维增材打印机提供止血流动剂以作为打印墨使用，其中所述流动剂由与盐水溶液混合的止血粉末制成，其中所述止血粉末具有包括如下的组成：
o非交联的原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；
o至少一种单糖；和
o至少一种糖胺聚糖；
-用三维增材打印机沉积所述止血流动剂以形成所述叠层的外层的至少一个。
对于这样的制造三维止血产品的方法，优选地使用所述止血流动剂形成所述叠层的所有层以获得三维止血产品(10)。
上述的止血流动剂的优选的但非限制性方面(取单独地或以组合)于下：
-在止血粉末的组成中：
o胶原的量在相对于止血粉末组成的总重量80％-90％重量范围；
o至少一种单糖的量在相对于止血粉末组成的总重量1％-12.5％重量范围；和
o至少一种糖胺聚糖的量在相对于止血粉末组成的总重量2％-25％重量范围。
-在止血粉末的组成中：
o胶原的量在相对于止血粉末组成的总重量80％-90％重量范围；
o至少一种单糖的量在相对于止血粉末组成的总重量2.5％-7.5％重量范围；和
o至少一种糖胺聚糖的量在相对于止血粉末组成的总重量5％-12.5％重量范围。
-在止血粉末的组成中：
o胶原的量在相对于止血粉末组成的总重量84％-88％重量范围；
o至少一种单糖的量在相对于止血粉末组成的总重量4％-6％重量范围；和
o至少一种糖胺聚糖的量在相对于止血粉末组成的总重量8％-10％重量范围。
-在止血粉末的组成中，至少一种单糖为葡萄糖并且至少一种糖胺聚糖为硫酸软骨素。
-在止血粉末的组成中，至少一种糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物。
-止血粉末的组成进一步包括至少一种凝血因子，其量相对于止血粉末组成的总重量低于0.1％重量。
-凝血因子为凝血酶。
-盐水溶液包括如下或由如下组成：蒸馏水和氯化钠，其中氯化钠相对于盐水溶液总重量的量在0.5％-1.5％重量范围，最优选地相对于盐水溶液总重量的量为0.9％重量。
-盐水溶液的质量为止血粉末的质量的2-10倍、和优选地为止血粉末的质量的4-5倍。
-止血流动剂通过将在1g和2g之间的止血粉末与在4mL和10mL之间的盐水溶液、优选地在5mL和10mL之间的盐水溶液混合而制成。
-止血流动剂通过将1.65g止血粉末混以7mL纯盐水溶液、或以任意其它类似比率混合而制成。
还提出了打印的止血产品，其具有至少三个维度并且由从第一外层直至第二外层沉积在彼此之上的叠层制成，其中叠层的相邻层接合在一起，和其中所述叠层的至少一层具有由止血流动剂制成的至少一部分，所述止血流动剂的组成包括：
-非交联的原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；和
-至少一种单糖。
这样的打印的止血产品的优选的但非限制性方面(取单独地或以组合)于下：
-叠层的至少一层具有由组成不同的止血流动剂制成的多个部分。
-叠层的至少一层完全由相同的止血流动剂制成。
-叠层的所有层具有相同组成。
-打印的止血产品包括多个相邻层，所述多个相邻层的各层具有由止血流动剂制成的至少一部分。
-叠层的第一外层和第二外层的至少一个具有由止血流动剂制成的部分。
-第一外层和第二外层的至少一个完全由相同的止血流动剂制成。
-叠层的第一外层和第二外层具有相同组成。
-叠层的各层具有由与第一外层和第二外层的至少一个的流动性混合物相同的流动性混合物制成的周缘部分。
-叠层的至少一层包括由溶胀性质不同于所述叠层的其它层的溶胀性质的止血流动剂制成的部分。
-止血流动剂的组成包括相对于该组成的总重量范围为70％-99％重量、优选地范围为75％-96％重量、和甚至更优选地范围为80％-90％重量的胶原含量。
-止血流动剂的组成包括相对于该组成的总重量范围为1％-12.5％重量、优选地范围为2％-8％重量、更优选地范围为2.5％-7.5％重量、和甚至更优选地范围为4％-6％重量的单糖含量。
-止血流动剂的组成包括至少一种糖胺聚糖。
-糖胺聚糖相对于所述组成的总重量的含量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地范围为4％-15％重量、更优选地范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地范围为8％-10％重量。
-糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物。
-止血流动剂的组成包括至少一种凝血因子、特别是凝血酶。
-凝血因子的量的范围为所述组成的0.01IU/mg-20IU/mg、优选地范围为所述组成的0.05IU/mg-10IU/mg、更优选地范围为所述组成的0.1IU/mg-5IU/mg、和甚至更优选地范围为所述组成的0.2IU/mg-2IU/mg。
-止血流动剂用止血粉末制成，所述止血粉末具有包括如下的组成：
o原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原，所述胶原的量相对于所述止血粉末的组成的总重量范围为75％-96％重量、优选地范围为80％-90％重量；
o至少一种单糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-12.5％重量、优选地量范围为2.5％-7.5％重量、和更优选地量范围为4％-6％重量。
-止血粉末进一步包括至少一种糖胺聚糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地量范围为4％-15％重量、更优选地量范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地量范围为8％-10％重量。
-止血粉末进一步包括至少一种凝血因子，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量低于0.5％重量、优选地量低于0.1％重量。
进一步提出了止血流动剂在三维打印机中作为打印墨的用途，其中止血流动剂由与盐水溶液混合的止血粉末制成，其中所述止血粉末具有包括如下的组成：
-非交联的原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；
-至少一种单糖。
止血流动剂作为打印墨的这样的用途的优选的但非限制性方面(取单独地或以组合)于下：
-形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括相对于该组成的总重量范围为70％-99％重量、优选地范围为75％-96％重量、和甚至更优选地范围为80％-90％重量的胶原含量。
-形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括相对于该组成的总重量范围为1％-12.5％重量、优选地范围为2％-8％重量、更优选地范围为2.5％-7.5％重量、和甚至更优选地范围为4％-6％重量的单糖含量。
-形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括至少一种糖胺聚糖。
-相对于该组成的总重量，糖胺聚糖的含量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地范围为4％-15％重量、更优选地范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地范围为8％-10％重量。
-糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物。
-形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括至少一种凝血因子、特别是凝血酶。
-凝血因子的量的范围为所述组成的0.01IU/mg-20IU/mg、优选地范围为所述组成的0.05IU/mg-10IU/mg、更优选地范围为所述组成的0.1IU/mg-5IU/mg、和甚至更优选地范围为所述组成的0.2IU/mg-2IU/mg。
-盐水溶液包括至少一种凝血因子、特别是凝血酶。
-凝血因子的量的范围为所述盐水溶液的10IU/mL-5000IU/mL、优选地范围为所述盐水溶液的25IU/mL-2500IU/mL、更优选地范围为所述盐水溶液的50IU/mL-1000IU/mL、和甚至更优选地范围为所述盐水溶液的100IU/mL-500IU/mL。
-形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括：
o原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原，所述胶原的量相对于所述止血粉末的组成的总重量范围为75％-96％重量、优选地范围为80％-90％重量；
o至少一种单糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-12.5％重量、优选地量范围为2.5％-7.5％重量、和更优选地量范围为4％-6％重量。
-形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成进一步包括至少一种糖胺聚糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地量范围为4％-15％重量、更优选地量范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地量范围为8％-10％重量。
-形成止血流动剂的止血粉末进一步包括至少一种凝血因子，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量低于0.5％重量、优选地量低于0.1％重量。
-用于形成所述止血流动剂的盐水溶液的质量为所述止血粉末的质量的2-10倍、和优选地为所述止血粉末的质量的4-5倍。
-形成止血流动剂的止血粉末包括至少80％重量的其尺寸在20μm和300μm之间的颗粒。
-形成止血流动剂的止血粉末包括至少90％重量的其尺寸低于350μm的颗粒。
最后提出了用三维增材打印机制造具有至少三个维度的止血产品的方法，其包括以下步骤：
a)向三维增材打印机提供三维模型，所述三维模型对应于所要制造的止血产品的结构，和处理所述三维模型以用多个层限定打印图案，所述多个层设计成在彼此之上层叠以形成对应于三维模型的叠层；
b)向三维增材打印机提供至少一种止血流动剂以作为打印墨使用，其中所述流动剂由与盐水溶液混合的止血粉末制成，其中所述止血粉末具有包括如下的组成：
o非交联的原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量
为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；和
o至少一种单糖；
c)用三维增材打印机通过沉积打印墨以在彼此之上相继地打印层而打印止血产品，所述形成包括用三维增材打印机沉积止血流动剂以形成所述叠层的至少一层的至少一部分。
这样的制造止血产品的方法的优选的但非限制性方面(取单独地或以组合)于下：
-叠层的至少一层全部由所述止血流动剂的沉积而制成。
-所述止血流动剂在所述叠层的多个层中使用以获得止血产品(10)。
-使用所述止血流动剂形成所述叠层的所有层以获得止血产品(10)。
-在步骤b)中，向三维增材打印机提供多种止血流动剂以作为打印墨使用，所述止血流动剂具有不同组成。
-形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括：
o原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原，所述胶原的量相对于所述止血粉末的组成的总重量范围为75％-96％重量、优选地范围为80％-90％重量；
o至少一种单糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-12.5％重量、优选地量范围为2.5％-7.5％重量、和更优选地量范围为4％-6％重量。
-形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成进一步包括至少一种糖胺聚糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地量范围为4％-15％重量、更优选地量范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地量范围为8％-10％重量。
-形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成进一步包括至少一种凝血因子，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量低于0.5％重量、优选地量低于0.1％重量。
-用于形成止血流动剂的盐水溶液包括至少一种凝血因子，所述凝血因子的量的范围为所述盐水溶液的10IU/mL-5000IU/mL、优选地范围为所述盐水溶液的25IU/mL-2500IU/mL、更优选地范围为所述盐水溶液的50IU/mL-1000IU/mL、和甚至更优选地范围为所述盐水溶液的100IU/mL-500IU/mL。
-用于形成所述止血流动剂的盐水溶液的质量为所述止血粉末的质量的2-10倍、和优选为所述止血粉末的质量的4-5倍。
-打印步骤c)在环境大气下、优选地在环境温度下完成。
-在已经在打印步骤c)中形成止血产品之后，进行其中使用包括凝血因子、特别是凝血酶的溶液涂覆止血产品的外表面的涂覆步骤d)。
-涂覆步骤d)通过将包括凝血因子的溶液喷雾在止血产品的外表面上而进行。
-在已经在打印步骤c)中形成止血产品之后，进行其中将止血产品浸泡在包括凝血因子、特别是凝血酶的溶液中的浸泡步骤e)。
-制造止血产品的最后步骤在于，将打印的止血产品在环境大气中维持预定的静置期，所述预定的静置期优选地少于10分钟、更优选地少于5分钟、和甚至更优选地少于1分钟。
-整个过程在环境大气下在对所述止血产品没有任何刺激、特别是没有光刺激或热刺激的情况下进行。
附图说明
本发明的其它特征和优势由以下描述将变得清楚，以下描述仅出于说明性意图而给出且决不为限制性的，并且应参考附图进行解读，在图中：
-图1为正在由至少使用止血流动剂作为打印墨的三维(3D)增材打印机制造的3D止血产品的示意性图示。
-图2为实施例10中描述的电泳的结果的实例。
具体实施方式
发明人已经意外地发现，尽管有用于形成止血流动剂的与盐水溶液混合的止血粉末组合物是由非交联的胶原制成的这一事实，但在三维打印机中使用止血流动剂作为打印墨仍可制造三维(3D)止血产品。
如从下面的描述中将明晰的是，止血流动剂具有使如下成为可能的结构：用3D打印机进行简单的沉积，以及由相继的层在沉积在彼此之上时自然地接合在一起而形成的产品的内聚性(cohesion)良好。
在下面的描述中，在没有相反陈述的情况下，重量百分数相对于一个产品(例如，本公开中限定的止血粉末或止血流动剂或止血产品)的组成的总干重(干重量，dryweight)给出。
在本发明的上下文中，“止血粉末组成的总干重”和“止血粉末组合物的总干重”指的是，不含溶剂特别是水的止血粉末组成(组合物)的总重量，且由此是相对于无水产品的总重量。
类似地，在本发明的上下文中，“止血流动剂组成的总干重”和“止血流动剂组合物的总干重”指的是，不含溶剂特别是水的止血流动剂组成(组合物)的总重量，且由此是相对于无水产品的总重量。
类似地，在本发明的上下文中，“止血产品组成的总干重”和“止血产品组合物的总干重”指的是，不含溶剂特别是水的止血产品组成(组合物)的总重量，且由此是相对于无水产品的总重量。
此外，组分的重量和所得百分数可对应于这些组分的无水重量，换言之，对应于不包括其可含有的水的组分的重量。这也可适用于获得的百分数。
用于形成止血流动剂的止血粉末的组成可包含相对于止血粉末组成的总重量大于或等于70％重量，特别是大于或等于75％重量，特别是大于或等于77％重量，甚至是大于或等于80％重量的胶原含量。
此外，止血粉末的组成可包含相对于止血粉末组成的总重量小于或等于99％重量，特别是小于或等于96％重量，特别是小于或等于93％重量，甚至是小于或等于90％重量的胶原含量。
因此，止血粉末的组成可包含相对于止血粉末组成的总重量为70至99％重量，特别是75至96％重量，特别是77至93％重量，甚至是80至90％重量的胶原含量。优选地，胶原含量为止血粉末组成总重量的约86％重量。
胶原是哺乳动物中的主要结构蛋白。胶原由长度约280-300nm且直径约1.5nm的原胶原(TC)分子构成。
术语“纤维胶原”是指对应于原纤维集合体的纤维形式的胶原。纤维通常具有范围在1μm至10μm的直径。术语“原纤维胶原”是指原纤维形式的胶原。更确切地说，原纤维通常具有10nm至1μm的直径。因此，原纤维由原胶原分子的交错阵列形成，并且这些原纤维可排列而形成胶原纤维。纤维和/或原纤维胶原通常是不可溶的，而非原纤维胶原是高度可溶的。
纤维胶原和原纤维胶原的定义可特别地为由Markus Buehler在“Nature designstough collagen:explaining the nanostructure of collagen fibrils”(PNAS，2006年8月15日，第103卷，第33期，pp.12285-12290)中给出的定义。
已发现超过28种不同的胶原，且其分为3大类：原纤维型胶原、非原纤维型胶原和FACIT胶原。
原纤维型胶原是主要包含原纤维和/或纤维胶原且几乎不包含任何非原纤维胶原(例如I型胶原)的胶原。类似地，非原纤维型胶原是主要包含非原纤维胶原的胶原。一些非原纤维型胶原可仅由非原纤维胶原(例如IV型或V型胶原)组成。
胶原的工业提取和纯化通常在于初始(原始)组织的破坏，以1)除去每种或大部分污染蛋白，和2)获得所需的结构化(structuration)水平，这取决于产品的最终用途。胶原提取通常在允许单分子可溶性胶原(其不是原纤维的)溶解的酸性或碱性条件下进行。最终的胶原自然地含有原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原的混合物。原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原之间的比例取决于对于提取和提取过程所选择的组织。
最终产物不同于已经通过仅原纤维胶原和仅非原纤维胶原的人工混合物获得的胶原。在题为“Extraction of collagen from connective tissue by neutral saltsolutions”(Proceedings of the NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES，第41卷，第I期，1955年1月15日，
Figure BDA0002635646570000121
Gross、John H.Highberger和Francis O.Schmitt)的文章中，示出了在特定的提取过程之后获得的原纤维和非原纤维胶原之间的差异，该提取过程得到如前所述这两种胶原的混合物。
在用于形成止血流动剂的止血粉末中，胶原是原纤维型的，并且包含相对于胶原的总重量，量为至少60％重量，特别是至少70％重量，特别是至少75％重量，甚至是至少80％重量的纤维和/或原纤维胶原。
更特别地，所述胶原包含相对于止血粉末组成中胶原总重量的至少85％、特别是至少90％、特别是至少95％、甚至是至少98％重量的纤维和/或原纤维胶原。
优选地，所述组成包含相对于组成中胶原的总重量范围为85％至95％重量、和最优选为85％至90％重量的纤维和/或原纤维胶原的含量。
这意味着在优选实施方式中，止血粉末的组成由此包含相对于组成中的胶原的总重量范围为5％至15％重量，最优选为10％至15％重量的非原纤维胶原含量。
具有这样的纤维和/或原纤维胶原相对于非原纤维胶原的比例的组成是非常有利的，特别是对于用作止血粉末制剂。实际上，纤维和/或原纤维胶原应以足以进行止血的量存在，并且非原纤维胶原也应以对于该产品的内聚性足够的量而非太大以至于无法避免过度溶胀的量存在。
胶原可选自I型胶原或I型和III型胶原。胶原可从各种源组织，特别是来自所有物种(更特别地猪、牛或马物种)的皮肤和/或肌腱(tendon)中提取。
胶原大多数可由从皮肤和/或肌腱中提取的猪源纤维胶原制成。在从肌腱中提取的胶原的情况下，提取可如在国际申请WO2010/125086中描述的那样。
上述胶原，特别是纤维和/或原纤维胶原，可来自酸性或碱性提取。根据一种特别实施方式，所述胶原来自碱性提取。根据一种特别实施方式，胶原可为例如在专利申请FR2944706中所描述的。
优选地，胶原来自碱性提取，其能够使提取的胶原中的纤维和/或原纤维胶原的含量最大化。此外，可优化这种碱性提取，以控制提取的胶原内原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原的比例。与酸性提取不同，碱性提取允许蛋白多糖的水解。这种作用导致组织的破坏和纤维的分离而不改变它们的形状。在酸性条件下，纤维中内胶原分子的溶胀导致它们在该过程中的部分破坏，释放较大量的可溶性非原纤维胶原。
胶原可在提取后原样使用，即无需进一步处理，或者其可交联，特别是通过经典的交联模式比如热脱水、使用桥联剂(例如甲醛和/或戊二醛)；通过经氧化的多糖，例如根据在国际申请WO2010/125086中描述的方法；和/或通过经氧化的支链淀粉或糖原。然而，使胶原交联不是优选的，因为它使制造工艺复杂化，而不一定增加止血功效。
因此，优选地，组成中使用的胶原不经历任何进一步处理，且特别是它不是交联的。使用非交联的胶原尤其具有简化制造工艺的优点。
在可用于形成止血产品的止血流动剂中使用非交联的胶原也是非常有利的，因为它限制可增加产品毒性的化学品在产品降解期间的浸出。最终产品的再吸收将更快，并且在这样的再吸收期间不会有任何毒性中间产物。
用于止血流动剂的止血粉末的组成进一步包含至少一种单糖(单独的或以与其它单糖的混合物)。所述单糖可选自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物。存在于止血组合物中的单糖(单独的或以单糖混合物)特别是葡萄糖。
止血粉末的组成可包含相对于组成总重量为1％至12.5％重量，特别是1.5％至10％重量，特别是2％至8％重量，十分特别是2.5％至7.5％重量的单糖含量。最优选地，单糖含量相对于组成总重量为约5％重量。
止血粉末组成可包含的胶原/单糖重量比为5至100，特别是7至65，更特别是10至50，还更特别是11至40。最优选地，该组成包含的胶原/单糖重量比为约19。
单糖，特别是核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物，且特别是葡萄糖，可以特别地使得可获得主要包含纤维和/或原纤维胶原和单糖的颗粒，所述颗粒具有所需的特征，特别是尺寸和密度。在胶原混合物中加入单糖还可以减少组成中的电荷，这使得能够形成适于放置在容器比如管、鼓风机、喷雾器或施用分配器内的粉末。这也简化通过混合这样的止血粉末和盐水溶液的止血流动剂的形成，所得的止血流动剂具有对于其作为用于3D增材打印机的打印墨的用途尤其有利的性质。
相当特别地，单糖的存在可使得获得特别地在改善组成粉末的止血性质方面期望的密度和/或尺寸的颗粒更容易和/或更便宜。
在没有任何添加剂的情况下研磨胶原纤维会导致纤维尺寸减小并降低粉末密度。此外，最终制剂含有阻止最终产品的操作的大量电荷。在研磨胶原之前添加单糖导致制剂硬化为混合物，从而允许快速研磨(限制变性)，因此能够制备具有电荷减少的(适于将粉末放入容器，比如分配器)和适于施加且重构组成的最终密度的粉末。如上所述，这还使得能够使用这样的止血粉末形成具有如下特定性质的止血流动剂：不仅特别地在颗粒的维度和密度方面、而且在止血流动剂的流变性方面对于增材打印有利地适合。
与可能已经预期的不同，单糖的这种结合对产品的最终活性没有影响。特别地，它不会改变最终产品的生物活性。单糖没有止血效果。
此外，单糖的这种结合不会使其表现为发泡剂，如WO01/97873中的情况。在WO01/97873中，经稀释溶液的加热导致明胶的形成。可以制备高浓度的明胶以获得非常浓缩的溶液，但最终产品含有明胶而不是胶原。已知明胶比胶原更少止血，因为血小板聚集需要胶原原纤维和明胶中不存在的天然胶原的结构的存在。
根据一实施方式，所述组成包括颗粒、优选地由其组成，所述颗粒包括胶原和单糖、优选地由它们组成，所述单糖特别地选自核糖、蔗糖、果糖、葡萄糖及其混合物，尤其是葡萄糖。
所述组成可包含至少一种凝血因子。所述凝血因子是本领域技术人员所熟知的。优选地，凝血因子之一是凝血酶。甚至更优选地，止血粉末组成仅包含凝血酶作为凝血因子。
所述凝血因子，特别是凝血酶，可来自动物来源(从动物组织和体液中提取)或来自重组来源(由基因修饰细胞的培养物产生)。凝血因子可为例如从人体组织和体液中提取的凝血酶。
当存在凝血因子特别是凝血酶时，其含量相对于止血粉末组成的总重量优选地小于0.5％重量、优选地小于0.1％重量。
在凝血酶的情况下，通常使用国际单位(IU)。因此，组成可以包含的凝血酶含量为0.01-20IU/mg组成，特别是0.05IU/mg至10IU/mg，特别是0.1IU/mg至5IU/mg，甚至是0.2IU/mg至2IU/mg。最优选地，凝血酶的含量(如果有的话)为约0.83IU/mg组成。
除了胶原和单糖的混合物之外，组成还可包含至少一种其他碳水化合物，其可以是糖胺聚糖。这种碳水化合物可以是具有或不具有凝血因子比如凝血酶的组成的一部分。
所述糖胺聚糖可选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物，特别是硫酸软骨素。
糖胺聚糖可以提高止血组成吸收血液的速度。更特别地，糖胺聚糖可以加速血液和止血产品特别是胶原和凝血酶之间的接触。
该组成可包含的糖胺聚糖含量相对于组成的总重量为1至30％重量，特别地2至25％重量，特别地3至20％重量，特别地4至15％重量，特别是5至12.5％重量。最优选地，糖胺聚糖(如果有的话)的含量为组成总重量的约9％重量。
该组成可包含的胶原/糖胺聚糖重量比为2.5至50，特别是3.5至35，更特别是5至25，还更特别是6.5至20。
根据一实施方式，所述组成包含至少一种(特别是一种)单糖和至少一种(特别是一种)糖胺聚糖，特别地如上所定义，特别是以上面定义的量。
碳水化合物非常特别地是单糖和糖胺聚糖。
该组成可包含的碳水化合物含量相对于组成的总重量为2至25％重量，特别是5至23％重量，特别是7至21％重量，特别是10至18％重量。
该组成可包含的胶原/碳水化合物重量比为2至40，特别是2.5至30，更特别是3至20，还更特别是3.5至15。
表述“碳水化合物的总重量”是指上面定义的单糖的重量和上述其他碳水化合物的重量之和。
根据一实施方式，该组成包含如下组分、优选地由其组成：
-胶原，其主要包含含量为相对于胶原的总重量至少50％重量的纤维和/或原纤维胶原，和
-至少一种、特别是一种单糖。
特别地，该组成包含如下组分、优选地由其组成：
-胶原，特别地其的量相对于组成的总重量为70至99％重量，特别是75至96％重量，特别是77至93％重量，甚至是80至90％重量，其中所述胶原包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50％重量，和
-至少一种单糖、特别是葡萄糖，其量相对于组成的总重量为1至12.5％重量，特别是1.5至10％重量，特别是2至8％重量，特别是2.5至7.5％重量。
根据另一实施方式，该组成包含如下组分、优选地由其组成：
-胶原，主要包含含量为相对于胶原的总重量至少50％重量的纤维和/或原纤维胶原，
-至少一种、特别是一种单糖，
-至少一种、特别是一种凝血因子。
特别地，该组成包含如下组分、优选地由其组成：
-胶原，特别地其的量相对于组成的总重量为70至99％重量，特别是75至96％重量，特别是77至93％重量，甚至是80至90％重量，其中所述胶原含量包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50％重量，
-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其的量相对于组成的总重量为1至12.5％重量，特别是1.5至10％重量，特别是2至8％重量，特别是2.5至7.5％重量，和
-至少一种、特别是一种凝血因子，特别是凝血酶，其的量为0.01IU/mg至20IU/mg组成，特别是0.05IU/mg至10IU/mg，特别是0.1IU/mg至5IU/mg，甚至是0.2IU/mg至2IU/mg。
根据另一实施方式，该组成如下组分、优选地由其组成：
-胶原，主要包含含量为相对于胶原的总重量至少50％重量的纤维和/或原纤维胶原，
-至少一种特别是一种单糖，和
-至少一种特别是一种糖胺聚糖。
特别地，该组成包括如下组分、优选地由其组成：
-胶原，特别地其的量相对于组成的总重量为70至99％重量，特别是75至96％重量，特别是77至93％重量，甚至是80至90％重量，其中所述胶原含量包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50％重量，
-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其的量相对于组成的总重量为1至10％重量，特别是1至12.5％重量，特别是1.5至10％重量，特别是2至8％重量，特别是2.5至7.5％重量，和
-至少一种糖胺聚糖，特别是硫酸软骨素，其的量相对于组成的总重量为1至30％重量，特别是2至25％重量，特别是3至20％重量，特别是4至15％重量，特别是5至12.5％重量。
根据另一实施方式，该组成包括如下组分、优选地由其组成：
-胶原，包含含量为相对于胶原的总重量至少50％重量的纤维和/或原纤维胶原，
-至少一种、特别是一种单糖，
-至少一种、特别是一种凝血因子，和
-至少一种、特别是一种糖胺聚糖。
特别地，该组成包括如下组分、优选地由其组成：
-胶原，特别地其相对于组成的总重量(特别地干重)的量为70至99％重量，特别是75至96％重量，特别是77至93％重量，甚至是80至90％重量，其中所述胶原包含的纤维和/或原纤维胶原含量相对于胶原的总重量为至少50％重量，
-至少一种单糖，特别是葡萄糖，其的量相对于组成的总重量为1至10％重量，特别是1至12.5％重量，特别是1.5至10％重量，特别是2至8％重量，特别是2.5至7.5％重量，
-至少一种凝血因子，特别是凝血酶，其量为0.01IU/mg至20IU/mg组成，特别是0.05IU/mg至10IU/mg，特别是0.1IU/mg至5IU/mg，甚至是0.2IU/mg至2IU/mg，和
-至少一种糖胺聚糖，特别是硫酸软骨素，其的量相对于组成的总重量为1至30％重量、特别是2至25％重量，特别是3至20％重量，特别是4至15％重量，特别是5至12.5％重量。
根据非常特别的实施方式，该组成包括如下组分、优选地由其组成：
-原纤维型胶原，主要包含纤维和/或原纤维胶原，所述原纤维型胶原例如通过在碱性介质中提取而获得并且其的量相对于组成的总重量为约85％重量，
-葡萄糖，其的量相对于组成的总重量为约4.9％重量，
-凝血酶，其的量为0.2IU/mg至2IU/mg组成，和
-硫酸软骨素，其的量相对于组成的总重量为约10％重量。
根据另一特别实施方式，该组成如下组分、优选地由其组成：
-原纤维型胶原，主要包含纤维和/或原纤维胶原，所述原纤维型胶原例如通过在碱性介质中提取而获得，并且其的量相对于组成的总重量为约85％重量，
-葡萄糖，其的量相对于组成的总重量为约5％重量，和
-硫酸软骨素，其的量相对于组成的总重量为约10％重量。
在本公开的上下文中，表述“约X％的量”是指±20％的变化，换句话说，约10％的量表示8至12％，特别是±10％的变化，甚至是±5％。
当加入粉末形式的凝血因子、特别是凝血酶时，凝血因子的这种粉末优选与已经制备的胶原/单糖的均匀分子混合物的粉末混合。
当加入糖胺聚糖(例如硫酸软骨素)和凝血因子(例如凝血酶)两者时，优选首先将它们混合在一起，并将该混合物加入到胶原/单糖的预先混合物(已经研磨成粉末)中。
凝血酶既不因碳水化合物也不因胶原而不稳定化。凝血酶从不与单糖溶液接触(与WO98/57678相反)，其防止蛋白质的任何变性和导致无法再适当地将粉末干燥的粉末的再水合。
粉末形式的组成可特别地包括如下组分、特别地由其组成：
-包括原纤维型胶原和至少一种单糖特别是葡萄糖、或由它们组成的颗粒，其中特别地所述颗粒具有如本说明书中所定义的尺寸、粒度和/或密度，和
-任选地，包括至少一种糖胺聚糖特别是硫酸软骨素和/或至少一种凝血因子特别是凝血酶、或由它们组成的颗粒，其中特别地所述颗粒具有如本说明书中所定义的尺寸、粒度和/或密度。
如上所解释的，所提出的止血粉末具有如下优势：容许适于止血粉末使用的研磨，特别地用于具有小维度、特别地低于500μm、更优选地低于350μm的颗粒的研磨。
止血粉末组成有利地可例如包含至少50％重量的尺寸在200μm和400μm之间的颗粒。
构成止血粉末的颗粒有利地具有的平均粒度为10μm至500μm，特别是50μm至400μm。
有利地，构成所述止血粉末的颗粒的至少90％重量特别是100％重量可通过网眼为500μm特别是400μm的筛网。
构成所述止血粉末的颗粒的至少90％重量特别是至少95％重量可通过筛网保留，该筛网的网眼为10μm、特别是20μm、实际上为30μm、实际上为50μm。例如，构成所述止血粉末的颗粒的至少90％重量、和优选地90％重量具有通过网眼为20μm的筛网可保留的比20μm大的尺寸。
根据一种具体示例，将止血粉末组成成形为包括至少50％重量的尺寸低于200μm的颗粒、90％重量的尺寸低于350μm的颗粒、98％重量的尺寸低于400μm的颗粒。在该情形中，构成止血粉末的颗粒有利地具有范围为20μm至300μm、优选地25μm至270μm的平均粒度。例如，构成止血粉末的颗粒的80％重量具有范围为20μm至300μm的粒度。止血粉末的这样的具体实例对于形成在3D增材打印机中使用的止血流动剂是特别有利的，如下文更详细地描述。
为容许将粉末水合，优选地选择所述粉末再分配。由于颗粒尺寸太小，粉末形不成与所需规格和方面一致的水合基质。
粉末形式的止血组成特别包括：
-包含胶原和单糖的颗粒，和
-任选地，至少糖胺聚糖和/或凝血因子比如凝血酶。
止血粉末组成可包括：
-包含胶原、单糖和任选的至少一种糖胺聚糖和/或凝血因子的颗粒，
-包含胶原、单糖和任选的凝血因子的颗粒和任选的糖胺聚糖颗粒，
-包含胶原和单糖的颗粒和包含至少一种糖胺聚糖和/或凝血因子的颗粒。
在本发明的上下文中，表述“干燥粉末”是指组成包含有限含量的溶剂，特别是水。所述有限含量相对于组成的总重量可以为小于5％重量，特别是小于3％重量，特别是小于1％重量。
所述干燥形式可通过简单蒸发所用溶剂、通过有机溶剂脱水获得。
如上所述，所描述的止血粉末由非交联的胶原形成，因为它在制造过程方面更简单，并且已经证明即使粉末的胶原没有交联，也具有良好的止血功效。
本发明人意外地已经发现，尽管所述胶原是非交联的，但将上述特定止血粉末与盐水溶液混合使得能够形成具有如下的流变性、特别是粘度的止血产品：使用例如所述止血流动剂作为通过3D增材打印机以连续层沉积的原材料，容许其用于形成复杂3D止血产品。
这确实不是预期的，因为相反地，所知晓的是，由基于胶原的粉末和盐水溶液的混合物制备止血胶原糊状物需要交联胶原的使用以起作用并稳定。这已在1990年1月2日以参考文献US4,891,359公布的美国专利中特别公开。也就是说，所知晓的是，交联通过向相应的分子结构加入化学键来赋予分子稳定性，为了使所述分子呈水性(含水)形式，通常需要所述另外的化学键。
如下也不是预期的：这样的止血流动剂可在3D打印机中直接使用以形成3D止血产品，而不必不得不修改常规3D增材打印机、特别地通过挤出运转的3D打印机的打印工艺。
结果，根据优选的实施方式，为了形成将在3D打印机中作为打印墨使用的止血流动剂，将如上所述的止血干粉末因此在所述胶原没有交联的情况下例如通过盐水溶液或水而水合。
如本文所用的术语“流动剂”应用于这样的组成：其稠度使得组成能够在没有施加任何应力的情况下维持特定的形状，同时如果对组成施加应力比如压力则可形变。用于引发产物流动所需的最小剪切应力对应于屈服应力。
流动剂不是液体，也不是海绵，也不是粉末，而是一种展现特定粘度的糊状物、凝胶或基质，这样的粘度取决于对流动剂施加的应力。
优选地，当不施加应力或施加低应力(例如低于10Pa)时，流动剂的粘度在20Pa.s和10000Pa.s之间(对应于0.0001(Pa.s)-1和0.05(Pa.s)-1之间的流度范围)。然而，对于较高应力，流动剂可具有例如1000Pa.s至1000000Pa.s的较高粘度。
流动剂是指例如能够通过注射器和/或套管的组成。有利地，它也可通过3D打印机的打印头的喷嘴，如下面将解释的。
在本说明书中，我们无差别地提及用于指代相同的特定组成的止血流动剂、流动性止血剂和止血基质。
因此，进行止血粉末和盐水溶液的混合，以制备如上所述的止血流动剂，其中止血粉末悬浮在水中或盐水溶液中。
用于制造止血流动剂的止血粉末可例如根据包括至少以下步骤的方法制备：
a)形成含水悬浮液，其包括原纤维型胶原-主要包含纤维和/或原纤维胶原-和单糖比如葡萄糖、优选地由它们组成，
b)收取以沉淀物、糊状物或凝胶形式的产物，特别地通过离心或倾析进行，
c)干燥产物，例如通过蒸发进行，
d)将产物研磨成所需的颗粒尺寸，特别地通过锤磨机进行，以及
e)任选地，加入凝血酶和/或硫酸软骨素，特别是以固体形式、尤其地以粉末形式。
步骤a)中包括纤维/原纤维胶原和单糖的含水悬浮液的形成导致单糖在胶原分子周围的均匀再分配。此外，胶原的分子种类和单糖之间的紧密接触在脱水后导致适于通过研磨获得具有所需的高密度的粉末的硬饼。相反，混合胶原粉末和葡萄糖粉末特别地由于密度和电荷而不产生均匀且可喷雾的粉末。
在步骤a)中，胶原可以30g/L至150g/L的浓度存在。
单糖可以如说明书中所定义的量、和更特别地以相对于胶原的重量约2至5％重量加入到悬浮液或均匀胶原糊状物。
在步骤a)中，单糖可以0.3g/L至10g/L的浓度存在。
步骤a)的胶原的含水悬浮液可以是酸，并且特别地包括酸比如盐酸。所述酸可以0.01M至0.5M、和特别地0.02M至0.1M、实际上约0.05M的浓度范围存在。所述悬浮液可以是均匀糊状物的形式。
步骤b)可包括将悬浮液倒入模具中。
进行步骤c)以获得尽可能厚(高于所需的最终颗粒尺寸)的饼，其具有非常高的密度且饼内尽可能少的气泡(小于5％)。
特别地为了获得所需的颗粒尺寸，在步骤d)之后可以进行粉末的筛选步骤。
根据一种优选实施方式，步骤a)在于，形成包括95％重量非交联的原纤维型胶原和5％重量单糖(例如葡萄糖)的混合物。
如上所述，可向通过非交联的原纤维型胶原和单糖形成的混合物加入糖胺聚糖(例如硫酸软骨素)。优选地，这样的糖胺聚糖以混合物/糖胺聚糖的重量比范围为70/30至100/0、优选地重量比为80/20、或85/15、或90/10或95/5加入。所述重量比可对于任一种通过非交联的原纤维型胶原和单糖形成的混合物使用。
例如，在95/5重量比中，止血粉末组成可包括95％重量由95％胶原和5％葡萄糖制成的混合物、和5％重量硫酸软骨素。因此，止血粉末包括90.25％重量胶原和4.75％重量葡萄糖、以及5％重量硫酸软骨素。
替代地，在85/15重量比中，止血粉末组成可包括85％重量由95％胶原和5％葡萄糖制成的混合物、和15％重量硫酸软骨素。因此，止血粉末包括80.75％重量胶原、4.25％重量葡萄糖、和15％重量硫酸软骨素。
替代地，在80/20重量比中，止血粉末组成可包括80％重量由95％胶原和5％葡萄糖制成的混合物、和20％重量硫酸软骨素。因此，止血粉末包括76％重量胶原、4％重量葡萄糖、和20％重量硫酸软骨素。
替代地，在90/10重量比中，止血粉末组成可包括90％重量由95％胶原和5％葡萄糖制成的混合物、和10％重量硫酸软骨素。因此，止血粉末包括85.5％重量胶原、4.5％重量葡萄糖、和10％重量硫酸软骨素。
根据一种具体示例，用于制造止血流动剂的止血粉末组成包括含量为混合物总重量的10％重量的硫酸软骨素，使得最终组成包括：
-胶原：86.36％重量，相对于组成的总重量；
-葡萄糖：4.54％重量，相对于组成的总重量；
-硫酸软骨素：9.09％重量，相对于组成的总重量；
当还加入凝血酶时，其具有低于0.01％重量的最终含量，相对于组成的总重量。在以上混合物中，凝血酶的量可为0.083IU/mg组成。
对于前述的所有粉末产物，根据研磨类型和其持续期可施加或多或少的彻底研磨以获得颗粒尺寸可变的粉末。
如所解释的，然后将止血粉末悬浮在盐水溶液中。盐水溶液优选为在操作室中使用的标准无菌盐水溶液。
盐水溶液的组成可包括浓度范围为0至300mM、优选地浓度范围为100至200mM、特别地浓度为约150mM的一价或二价氯阴离子例如氯化钙或氯化钠。
其优选地由蒸馏水和在0.5％和1.5％之间、和优选地大约0.9％量的氯化钠构成。
盐水溶液优选为纯的，其意味着它由氯化钠在蒸馏水中的混合物组成而不加入任何其它组分。
替代地，盐水溶液可包括凝血因子例如凝血酶。在该情形中，与盐水溶液混合的止血粉末优选地不包括任何凝血因子。
例如，凝血因子的量在10-5000IU/mL盐水溶液的范围中、优选地在25-2500IU/mL盐水溶液的范围中、更优选地在50-1000IU/mL盐水溶液的范围中、和甚至更优选地在100-500IU/mL盐水溶液的范围中。
盐水溶液可以多种形式，例如在大型容器中的散装(批量)形式或在确定体积的特定容器中，储存。
优选地，盐水溶液为用于制造止血流动剂的试剂盒的部分，这样的试剂盒还包括容器中特定量的止血粉末。
由止血粉末制成的止血流动剂的组成可包括含量相对于组成的总重量在60％-99％重量范围中、特别地在75％-90％重量范围中、和相当特别地在83％-88％重量范围中的干燥的非交联的原纤维胶原。
由止血粉末制成的止血流动剂的组成可包括含量范围为相对于组成的总重量1％-10％重量、特别地范围为3％-7％重量、和相当特别地范围为4％-5％重量的单糖、特别地葡萄糖。
由止血粉末制成的止血流动剂的组成可包括含量范围为相对于组成的总重量1％-30％重量、特别地范围为5％-12％重量、和相当特别地范围为8％-10％重量的糖胺聚糖(冻干的干燥的颗粒)、特别地硫酸软骨素。
由止血粉末制成的止血流动剂的组成可包括凝血因子、优选地凝血酶，其含量为低于1％重量，相对于组成的总重量。优选地，如果存在凝血因子，则其含量优选地低于0.5％重量、优选地少于0.1％重量，相对于组成的总重量。
可能地，由止血粉末制成的止血流动剂的组成可包括交联引发剂、特别是氧化糖原或视黄醇，或光引发剂。所述引发剂对于止血产品的制造不是必须的，而是将随后用于将止血产品功能化。为了只有在特定刺激时才使得止血产品中的反应能够进行而选择这样的交联引发剂或光引发剂。具体地，对于交联引发剂，交联不会自发地发生并且不得不将交联引发剂激活。
可使用由与特定量混合的盐水溶液的止血粉末制成的止血流动剂作为止血试剂。
该止血流动剂还可作为药物组成、特别是止血药品使用。
如前所述，止血流动剂适于制造3D-止血产品，并且可有利地在3D打印机中直接使用。
优选地，止血流动剂在任意类型的3D打印机、特别是所谓的生物打印机、例如通过原材料挤出工作的3D打印机中可作为形成打印墨的原材料使用。
在3D打印机包括多个打印头的情形中，通常使用组成不同的多种打印墨，它们的至少一种为所提出的止血流动剂。在具体情形中，组成不同的多种止血流动剂将在3D打印机中作为打印墨使用。
关于生物打印机，可参考Ibrahim T.Ozbolat和Monika Hospodiuk在2015年在Biomaterials上发表的题为“Current advances and future perspectives inextrusion-based bioprinting”的文章(参见Biomaterials 76(2016)321-343)，其通过引用整体并入。
在止血流动剂准备在3D打印机中使用之前，所有活性组分可以粉末形式在特定容器内全部容纳在一起。这由于多个方面而是非常有利的。首先，它简化产品的储存，因为必须特别照料具有止血粉末的容器，而非在实际中作为常见产品的盐水溶液。
这在制造方面也是十分有利的，因为在储存前只须将止血粉末灭菌，例如倘若首先将一些组分(例如凝血酶)与盐水溶液混合、并然后将其混入到止血粉末则不会是该情形。
必须指出，如果在止血粉末中或在盐水溶液中不使用凝血因子例如凝血酶，则可考虑在止血产品的制造结束时加入该凝血因子。
在该方面，止血产品例如可在包括凝血因子的溶液中浸泡。
还可使用包括凝血因子的溶液涂覆止血产品的外表面。这样的涂覆可例如通过在止血产品的外表面上喷雾所述溶液完成。
可能地，如将会解释的，还可将通过3D-打印制成的止血产品在制造过程结束时灭菌，并因此将不需要对止血粉末进行灭菌。
所述容器可具有在3D打印机中可直接使用的卡盒的形式。
优选地，为了制备用于通过3D增材打印机制造3D止血产品的止血流动剂，用于将止血组成水合的盐水溶液的质量为止血粉末的质量的2-10倍、优选为止血粉末的质量的4-5倍。
所提出的止血流动剂具有如下优势：其具有确保通过生物打印机的可打印性的流变性。
特别地，止血流动剂的颗粒具有足够低的以至于通过打印机的打印头并避免打印机喷嘴中的堵塞的维度(典型地低于400μm)。
优选地，包括在500Pa和20000Pa之间、优选地少于15000Pa、甚至更优选地在1000Pa和3000Pa之间的止血流动剂的屈服应力。
打印墨卡盒的止血粉末的量可在1g和2g之间。
于是，这样的打印墨卡盒中盐水溶液的量在4mL和10mL之间、更优选地在5mL和10mL之间。
根据优选的示例，打印墨卡盒的打印墨为通过与7mL纯盐水溶液混合的1.65g止血粉末制成的止血流动剂。
可想到，提供较大容量的打印墨卡盒(特别是如果所要打印的3D止血产品具有大的体积)，但用于形成止血流动剂的止血粉末和盐水溶液的量之间的比率将优选地保持与以上相同。例如，打印墨卡盒包含通过与70mL纯盐水溶液混合的16.5g止血粉末制成的止血流动剂。
在将盐水溶液转移到包含止血粉末的容器中的同时，为了便于将盐水溶液引入到止血粉末中，所述容器优选地例如围绕其自身轴旋转。如果用户手动引入盐水溶液，则容器的旋转也可用手完成。然而，该过程按需可自动化。
在转移盐水溶液时拍打和/或轻摇容器也可有利于促进将盐水溶液引入到止血粉末中。
一旦盐水溶液被转移到容器中，容器就关闭并搅动以将止血粉末与盐水溶液混合。搅动可通过用抹刀混合组分或通过摇动进行。
搅动优选地进行在5秒和60秒之间、甚至更优选地至少30秒、例如20秒的持续期。然而，就止血粉末的水合而言，10秒-30秒、例如20秒的摇动时间已经充足。
摇动优选地用手进行单还可自动化。
当手动进行时，混合或摇动可在于，将容器上下地移动一定时长。例如，分配器可上下地移动至少10至30次、优选地20次。为提升混合效率，还可将分配器滚翻并然后上下地移动一定时长。在手动混合的第二阶段中，分配器1也可上下地移动至少10至30次、优选地20次。
在摇动之后，将包封已经形成的止血流动剂的容器优选地静置至少30秒、优选地至少60秒、和甚至更优选地至少90秒。
静置时间可能在30秒和120秒之间、优选为大约90秒。
该静置期使得止血粉末的水合和初始溶胀能够进行以形成水合的止血流动剂。
止血流动剂可在室温下制备并静置一分钟至几小时。在少于5分钟内可达到最大溶胀。
止血流动剂的以上制备可在生物打印机中使用的卡盒中直接完成、或在止血流动剂转移到打印卡盒中之前在中间容器中完成。
由此形成的止血流动剂具有如下优势：其是均匀的。特别地，止血流动剂基本上具有在容器内的均匀流动性。这是特别有利的，因为止血流动剂的沉积因此将是相同的，不管其是来自容器的材料的起始部分还是该材料的其余部分。
一旦止血流动剂通过止血粉末与盐水溶液的水合已经形成，止血流动剂就可使用几小时、例如至少8小时，而没有任何性质或性能损失。
图1示意性说明使用3D增材打印机20制造3D止血产品，从图中仅示出沉积喷嘴21和打印墨容器22主体。
打印工艺优选地在环境大气下在室温下完成。
该工艺具有如下优势：例如容许直接在操作室中层压3D止血产品。当然，打印工艺也可在任何其它室中、特别地在操作室的外部并且独立于任何外科手术地完成。
替代地，3D止血产品可直接在患者的待治疗表面上、例如直接在患者的正在处理的出血区或出血伤口上打印。
然而，在患者的待治疗表面上直接打印止血产品并非必须的。打印过程可在没有患者的情况下、在患者外部、特别是在患者的任何手术区的外部完成。
使用3D打印机20的喷嘴21将止血流动剂23从打印墨容器22沉积到载体24上并且将连续层11形成到彼此之上以产生3D止血产品10。
控制3D打印机以产生包括止血流动剂的–和优选地由其组成的–原材料的空间图案化，并且使用计算机辅助逐层沉积途径将其组装以制作3D止血产品10。
优选地，所要制造的3D止血产品具有可由作为输入数据提供到3D增材打印机20的三维模型限定的形状。
3D增材打印机20通常包括处理单元，其配置成处理3D模型以限定这样的打印方式：设计将多个层在彼此之上层叠以形成对应于3D模型的叠层。该打印方式还将取决于作为打印墨使用的原材料和所要制造的3D止血产品的性质。
确实如此，最简单的3D止血产品由排列成自然地接合在一起(也就是说，将所述层一起加入)的叠层的单一材料(即止血流动剂)制成。通过自然地接合在一起，这意味着不需要用于使两个相邻层接合在一起的进一步活化过程，特别地不需要交联。
在彼此之上打印的层通过自组装而接合在一起。没有交联现象并且在所述层之间不产生共价键。
确实如此，所提出的用于止血产品打印的止血流动剂具有高的聚合物浓度(由于胶原浓度引起的)，其促进所述自组装。
另外，所提出的止血流动剂主要由非交联的原纤维型胶原构成，其进一步促进所述自组装。
最后，所提出的止血流动剂具有对于通过打印的产品制造而言尤为令人关注的实现自组装的触变性质。
当生物打印机对所提出的止血流动剂施加高于屈服应力的约束条件时，这样的止血流动剂的粘度将降低，使得打印过程能够进行。这样的现象称为剪切稀化。
在通过所述打印机赋予这样的剪切应力之后，所提出的止血流动剂具有在如下的预定时间内使得能够返回到它原始的不受约束的更加粘稠且稳定的状态的触变性质：其对于在容许用于打印所述层的材料的混合的同时将另一层打印到第一层上是足够长的、并且对于打印的产品快速地内聚并稳定是足够短的。
优选地，在沉积之后，所提出的止血流动剂在少于10分钟、更优选地少于5分钟、甚至更优选地少于1分钟或少于30秒内返回到它原始的不受约束的状态。
还可想到，具有如下3D止血产品：其中叠层的外层的仅一层、或两个外层(上层和下层)通过止血流动剂的沉积制成，而夹在外层之间的中间层的一些或全部由也适于通过3D打印机进行沉积的另外材料制成。
例如，可想到，通过3D打印机形成人造身体部位(例如肌腱部分、软骨、半月板、椎间盘等)并将其用止血流动剂涂覆以改善其在患者体内的移植和相应的治愈过程。
为了避免只有3D产品的上下层具有止血性质(当只有所述外层通过止血流动剂制成时，情况如此)，可控制打印工艺使得各层均可由多种打印墨制成。因此，形成具有由止血流动剂制成的周缘部分的中间层将会是可能的。这种增材打印方式使得能够制造带有具有止血性质的被膜(外壁)的3D产品，而3D产品的芯可由不同材料制成。
还可想到，通过由组成不同的止血流动剂制成的多种打印墨形成3D止血产品。这将例如可用于提出具有止血性质不同的层的多层产品。
有利地，3D增材打印机20可为装备有多个喷嘴分配器的挤出打印机，各喷嘴分配器与不同的打印墨相关。这呈现如下优势：容许便利地打印由不同(多个)层制成的3D止血产品，其中各层可由容纳在不同打印卡盒中的不同组成构成。特别地，一个层可具有通过不同打印墨、特别地不同的止血流动剂各自打印的多个部分。
而且，3D止血产品的各层可以不同图案制成，并且重叠层可以多个取向和图案打印。
3D止血产品10可通过重叠二维(2D)层而制成。
如上所述，2D层可通过形成所述层的多个部分的多种止血流动剂组成制成。
有利地，通过用具有不同止血能力的多种止血流动剂形成多个部分，2D层可形成为具有止血梯度。
如上所述，2D层可以多种图案例如曲线、圆、多边形、斑点、波浪状打印。
在重叠层之间或在层内，图案可具有不同取向，例如图案可垂直地或以沿对角线的各种角度取向。而且，在层内，图案间的距离也可变化。
而且，重叠层可具有不同的厚度、形状和维度。
2D层可完全填充，或替代地存在孔隙。
结果，可打印具有复杂形状的止血产品。那些打印的止血产品还可具有拥有特定功能的区域和具有不同功能的多个区域。
打印的止血产品还可制备成具有随时间例如水合时可变的形状。更准确地，打印的止血产品为3D止血产品，即具有按照三个空间维度的形状的产品，其中第四维度对应于产品随时间的变换。这样的具有第四维度的3D打印产品也称为4D产品。
可参考A.Sydney Gladman等人在2016年在Nature Materials上发表的题为“Biomimetic 4D printing”的文章(参见Nature Materials，第15卷，第413–418页(2016))，其通过引用整体并入。
这容许例如制造如下的3D止血产品：各层或至少两个不同层例如在水合时可具有不同的止血和/或溶胀性质。
最终打印的止血产品组成可包含范围为60％-99％重量、特别地范围为75％-90％重量、和相当特别地范围为83％-88％重量的原纤维胶原含量、优选地部分原纤维胶原含量，相对于组成的总重量。
打印的止血产品组成可包括范围为1％-10％重量、特别地范围为3％-7％重量、和相当特别地范围为4％-5％重量的单糖含量，相对于组成的总重量。
打印的止血产品组成可包括范围为1％-30％重量、特别地范围为5％-12％重量、和相当特别地范围为8％-10％重量的糖胺聚糖含量，相对于组成的总重量。
打印的止血产品组成可包括含量相对于组成的总重量为低于1％重量的凝血因子、优选地凝血酶。优选地，如果凝血因子存在，则其含量相对于组成的总重量低于0.5％重量、优选地少于0.1％重量。
胶原在用于制造3D-止血产品的止血流动剂中的存在对于产品内聚性、特别地产品的不同层之间的内聚性是必须的。非交联的原纤维胶原的使用是特别有利的。另外，使用原纤维胶原帮助促进止血。
如上所述，止血流动剂具有高的聚合物浓度(对应于胶原浓度)，其促进打印过程并且使得能够通过自组装制造工艺制造止血产品。特别地，它使得能够制造内聚性的、自支撑的、和抵抗性的打印的止血产品，而不需例如通过使用例如光刺激或热刺激的自然或强迫交联的进一步增强步骤。
如前面解释的，单糖、和特别是葡萄糖便利地用于制备止血粉末，特别地因为它减少所述组成内的电荷。
而且，单糖也因其亲水性可使用，并且通常电荷极化并能够氢键结合。这使得这些分子不仅在水中而且在其它极性溶剂中是可溶的。单糖也可用于可能的凝血因子的保存。
糖胺聚糖、和特别是硫酸软骨素也是非常亲水的。糖胺聚糖在用于制造打印的止血产品的止血流动剂组成中的比例使得打印产品的溶胀性质变化。更准确地，它影响通过特定的止血流动剂制成的图案的溶胀性质。
打印通过叠加硫酸软骨素浓度不同的层制成的止血产品可为特别有利的，因为硫酸软骨素在水合时通过溶胀促进产品形变。
例如，富含硫酸软骨素的层比主要由胶原构成且硫酸软骨素较贫乏的层溶胀更多。例如为了覆盖出血伤口，可使用在打印的止血产品上的水合和溶胀差异以使所述止血产品在水合时形变和/或扩展。
止血流动剂中糖胺聚糖、和特别是硫酸软骨素的使用也是有利的，因为它帮助打印过程。更准确地，似乎它促进止血流动剂流动通过生物打印机的打印头的喷嘴，正如润滑剂可办到的。
使用在止血产品的制造过程的任意步骤时可加入的凝血因子例如凝血酶以促进凝血。当使用不同止血流动剂打印3D-止血产品的不同层时，可仅在目标区域中、例如在需要凝血的区域中打印包含凝血因子的止血流动剂。
通过所提出的3D打印工艺制成的3D止血产品可在通过3D打印机已经制造后、例如在几分钟内快速地使用。因为通过生物打印机的制作工艺是简便且自动化的，所以取决于待治愈的伤口或出血位点，例如在预先设计模板之后为了立即使用可打印3D止血产品。
有利地，止血产品可在出血位点上干燥和部分(施加)干燥。如果期望在随后阶段时、例如在以上的该最佳用法推荐之后很久使用3D止血产品，则可将3D止血产品例如在环境大气下和/或在高压釜中部分干燥。在该情形中，止血产品可在伤口上施加之前再水合。将3D止血产品在使用前再水合是优选的，尽管这不是绝对必须，因为它可通过在不得不使用其的区域周围的血液再水合。
为了更好地保存胶原的三螺旋结构，打印的3D-止血产品可在室温下干燥或冻干。
如上所述，所提出的止血流动剂具有如下优势：为形成内聚性层叠层，在增材打印过程之前或期间不需要任何交联。然而，可想到，在打印过程期间具有交联更精细地控制所述层的接合并且可能实行更复杂的打印图案。这样的交联可例如通过使用聚焦的UV照射或任何适合的化学交联方法完成。
而且，打印的3D止血制品可在干燥之前或之后交联。为了产生增强的局部区域、或为了局部固定打印的形状，所述交联可为局部的。这对于制造具有高耐操纵性和较高的出血流动强度的产品是尤其有利的。然而，必须指出的是，这样的交联步骤对于产生内聚性、自支撑的、和抵抗性的打印的3D产品的打印工艺绝非必须。
替代地，为了增强止血产品、并且特别地为了阻碍或限制其溶胀和形变，所述交联可涉及整个止血产品。
局部或总体交联可通过热、光或任何适宜方法引起。
如上解释的，在需要特定交联的情况中，优选的是，用于打印止血产品的止血流动剂上的组成内具有交联引发剂。
如果止血产品不含凝血因子，则它在干燥之前或之后可通过凝血因子例如凝血酶溶液浸泡、浸渍、喷雾。替代地，凝血因子可吸收或沉积在产品上。
止血流动剂的组分可无菌使用，但并非必须。在该情形中，打印的止血产品可在使用之前灭菌。
在出血伤口上可施加干燥的无菌的打印的止血产品。
替代地，干燥的无菌的打印的止血产品在其在出血伤口上施加之前可在盐水溶液或/和凝血因子溶液中浸泡。
打印的止血产品的性质和相应的用途将取决于形成该打印的止血产品的各层的性质。
例如，为了溶胀和形变成与出血伤口相符，可选择打印的止血产品的组成和结构。
可能的富含凝血因子的图案可局部地促进凝血。
可能的“促胶粘(pro-adhesive)”图案可局部地促进产品内聚到出血伤口或与其胶粘。
可能的富含水的外层可有利地防止产品胶粘到周围组织。
使用通过如上所述的止血流动剂形成的打印的止血产品具有如下优势：加强与伤口的接触面积。特别地，与出血区的接触更深入。这当出血区对应于软组织和薄壁组织器官时尤其引入关注。
在3D止血产品通过3D增材打印机制造的情况下，它可具有任何类型的三维结构，从作为全容积的简单结构到具有很多网格和角的十分复杂的结构。
3D止血产品例如可具有棒、中空圆柱体、球等形状。3D止血产品还可为提供有蜂窝状结构的贴片，例如形状为具有至少几毫米(例如5mm至50mm)的厚度的膜的贴片。
有利地，止血产品根据所述产品的尺寸、厚度或可能的交联可例如在已经施加之后的几周到数月再吸收。
如上所述，我们还提出了一种止血方法，其包括将打印的止血产品(例如，以上所定义的)沉积在包括人在内的动物身体的出血部位上。特别地，打印的止血产品可在外科手术，特别地剖腹手术、腹腔镜检查、体腔镜检查和机器人手术，中使用。
上述的打印的止血产品也可作为用于内和外伤口的愈合剂使用。术语“愈合剂”指的是如下产品：使得可获得对与其接触的组织在临床上令人满意的治愈。
实施例：
实施例1：用于体外测量止血能力的方案
在整个测量中，将柠檬酸化(约0.1M)的人血液在水浴中保持在37℃。将待测产品(10mg)沉积在具有搭扣盖的5mL聚丙烯管中，然后加入柠檬酸化的新鲜血液(2mL)。然后加入CaCl2，使得血液中的最终CaCl2浓度为15mM，且然后封闭试管。然后通过剧烈翻转(10次)将内容物混合在一起，然后将试管插入水浴中；试管每10秒钟返回到竖直位置。记录形成凝块所需的时间并且其对应于止血能力。
实施例2：测量颗粒尺寸的方案
将已知量的产品特别是粉末通过50μm、100μm、200μm、300μm和400μm筛网筛选2分钟(每个筛网)。将来自各筛网的级分称重。测定各颗粒尺寸范围的比例。
实施例3：用于测量组合物溶胀的方案
对15mL烧瓶进行称重(m0，以mg计)，然后加入X mg干组合物粉末(m0+X，以mg计)。加入0.15M NaCl水溶液(2mL)，并使组合物溶胀20分钟；然后将烧瓶以1000rpm离心。
用巴斯德(Pasteur)吸管除去过量的NaCl，并且通过在滤纸上翻转烧瓶消除液滴；然后，对具有湿粉末的烧瓶进行称重(m1，以mg计)。
如下计算溶胀比：((m1-m0)/(m0+X-m0))。
实施例4：通过碱性提取制备原纤维型胶原
将用丙酮脱脂的猪真皮片(30kg)在100kg的0.05M NaOH溶液中溶胀3小时。将所述真皮通过切磨机细切碎，并将获得的糊状物用50升的0.05M NaOH稀释。然后将混合物在压力下筛分通过1mm筛网。然后用HCl将获得的糊状物调至pH 6-7.5，并且通过离心或过滤通过1mm筛网收集获得的沉淀物。
根据本领域技术人员已知的方法将保留物用丙酮脱水。因此，该脱水的保留物在于原纤维/纤维胶原相对于非原纤维胶原的含量大的原纤维型胶原。通常，这样提取的胶原包含相对于胶原总重量85％至95％重量的原纤维/纤维胶原和相对于胶原总重量5％至15％重量的非原纤维胶原。
实施例5：制备止血粉末#1
将30g如实施例4中制备的原纤维型胶原加入1L的0.02M HCl水溶液中，然后将混合物搅拌5小时。接着，向获得的均匀糊状物以相对于胶原重量2％重量的量(0.6g)加入粉末状果糖。
将混合物均化1小时，然后倒出并脱水。干燥后，使用Fitzpatrick锤磨机以7000rpm在受控加热下将干燥产物以25g/min的速率研磨。然后通过机械筛选除去尺寸大于400μm的颗粒而对产物进行筛分。
然后，将硫酸皮肤素以相对于粉末干物质2％重量的量(0.612g)加入粉末中。
然后使用球磨机将混合物均化，将冻干的凝血酶以15IU/mg粉末的量加入混合物中，并最后使用球磨机将混合物均化。
实施例6：制备止血粉末#2
将7.5kg如实施例4中制备的原纤维型胶原加入到50L的0.05M HCl水溶液中，然后将混合物搅拌16小时。接着，向获得的均匀糊状物以相对于胶原重量5％重量的量(375g)加入粉末状果糖。
将混合物均化3小时，然后分配到板上并脱水。干燥后，使用锤磨机以12000rpm在受控加热下将干燥产物以5g/min的速率分级研磨。然后通过机械筛选除去尺寸大于400μm的颗粒和小于50μm的颗粒而对产物进行筛分。
测量粒度而证实分布是这样的：样品的60％重量具有大于200μm的粒度。
然后，将纯化的硫酸软骨素以相对于粉末干物质20％重量的量(1.575kg)加入粉末中。使用球磨机将混合物均化。
最后，将冻干的凝血酶以10IU/mg粉末的量加入混合物中。如前面那样，使用球磨机将混合物均化。
实施例7：止血粉末#3的制备
将1000g如实施例4中制备的原纤维型胶原加入到60mL的0.02M HCl水溶液中，然后将混合物搅拌5小时。接着，向获得的均匀糊状物以相对于胶原重量5％重量的量(50g)加入粉末状葡萄糖。
将混合物均化1小时，然后倒出并脱水。干燥后，使用Fitzpatrick锤磨机以7000rpm在受控加热下将干燥产物以25g/min的速率研磨。然后通过机械筛选除去尺寸大于400μm和小于50μm的颗粒而对产物进行筛分。
然后，将硫酸软骨素以相对于粉末干物质10％重量的量(105g)加入粉末中。然后使用球磨机将混合物均化。
这种粉末组合物的振实密度为约0.408g/mL。
实施例8：止血粉末#4的制备
将500g如实施例4中制备的原纤维型胶原加入30mL的0.02M HCl水溶液中，然后将混合物搅拌5小时。接着，向获得的均匀糊状物以相对于胶原重量5％重量的量(25g)加入粉末状葡萄糖。
将混合物均化1小时，然后倒出并脱水。干燥后，使用Fitzpatrick锤磨机以7000rpm在受控加热下将干燥产物以25g/min的速率研磨。然后通过机械筛选除去尺寸大于400μm和小于50μm的颗粒而对产物进行筛分。
然后将与凝血酶粉末混合的硫酸软骨素以相对于粉末干物质10％重量的量(52.5g)加入粉末中。将凝血酶以0.85U/mg的最终量加入混合物中。然后使用球磨机将混合物均化。
这种粉末组合物的振实密度为约0.425g/mL。
实施例9：止血粉末#5的制备
将750g如实施例4中制备的原纤维型胶原与6675mL高度纯化的水混合。将混合物以20rpm的第一搅拌速率搅拌10分钟，且然后以40rpm的第二搅拌速率搅拌15分钟。
然后将以上混合物再次以20rpm的第一搅拌速率搅拌，同时引入葡萄糖溶液(37.5g葡萄糖和300mL水)。加入的葡萄糖的量相当于相对于混合物中正使用的胶原的重量的5％重量。将该新的混合物以40rpm的第二搅拌速率搅拌10分钟。然后将该制剂储存16小时。
然后将量为87.5mL的1M HCl水溶液加入到制剂中，同时以30rpm的搅拌速率进行搅拌。然后将该新的混合物以35rpm的第一搅拌速率搅拌1分钟，然后以40rpm的第二搅拌速率搅拌1分钟，然后接着是以40rpm的相同搅拌速率的多个5分钟搅拌期，在两个搅拌期之间进行搅拌的暂停。
然后将在前一阶段中获得的稠糊状物分成具有相似形状和质量的多个块。然后将这些糊状物块放入具有用氨气饱和的气氛的气密密封的外壳中24小时。在该中和步骤之后，将糊状物块在20℃干燥96小时，然后使用Forplex低温磨机以8500rpm将干燥产物以1kg/h的速率研磨。然后通过机械筛选除去尺寸大于200μm和小于50μm的颗粒而对粉末产物进行筛分，从而得到胶原-葡萄糖粉末。
然后，将由尺寸在50μm和200μm之间的颗粒制成的硫酸软骨素(CS)粉末以相对于胶原-葡萄糖粉末的干物质10％重量的量加入到所述胶原-葡萄糖粉末中。例如，将30g硫酸软骨素粉末与300g胶原-葡萄糖粉末混合。对于该止血粉末#5，还以1000UI/g的量加入冷干的凝血酶。然后使用V型共混器将混合物均化。最终的止血粉末的振实密度为约0.4g/mL。
实施例10：胶原表征→胶原中可溶性胶原的存在，原纤维/纤维胶原与非原纤维胶原之间的比率的测定。
实验的目标是确定胶原(提取的胶原或研磨成粉末的胶原)中的原纤维/纤维胶原和非原纤维胶原的比例。该比例可通过研究胶原中不可溶胶原(对应于原纤维/纤维胶原)和可溶胶原(对应于非原纤维胶原)的比例来确定。
该实验在于将约2.5g待测胶原在166mL pH 13的水中溶解16小时。然后将溶液离心(10000rpm，10分钟)。然后分离上清液(对应于非原纤维胶原)和残余物(对应于纤维/原纤维胶原)。将残余物用相继的丙酮浴和在受控的气流下直接干燥。用6M的盐酸和乙酸将上清液的pH调节至pH 3。通过添加NaCl 0.6M并通过进行离心获得来自上清液的固体胶原。然后将其用相继的丙酮浴和在受控的气流下进行干燥。
计算来自残余物(M残余物)和来自上清液(M上清液)的胶原重量，并且公式M残余物/(M残余物+M上清液)×100给出纤维胶原占胶原总量的百分数。
在本发明中，对于用于制备粉末的胶原和对于最终的胶原粉末两者，所述比率M残余物/(M残余物+M上清液)必须高于80％。优选地，该比率高于85％。
例如，由三批如实施例4中制备的胶原进行的以上实验给出非常相似的比率，分别为92.67％、94.60％和91.51％。在对这三批胶原进行研磨后，该比率依然保持非常相似，分别为91.63％、88.02％和88.69％。
表明存在纤维/原纤维胶原和可溶性胶原两者的另一种方法是进行SDS PAGE电泳。
图2示出了这种电泳，其中样品S1对应于第一批(由如实施例4中提取的胶原制成)的上清液，样品S2对应于该第一批的残余物，样品S3对应于第二批(同样由如实施例4中提取的胶原制成)的上清液，样品S4对应于该第二批的残余物。
结果表明，对于来自残余物的胶原，较大量的纤维无法迁移通过丙烯酰胺凝胶并在凝胶顶部(stop)处染色。样品的制备不允许各链从胶原分离。因此，α链以非常低的量存在。来自上清液的胶原能够在凝胶中全部迁移，顶部没有纤维被阻塞，来自胶原的链在电泳过程期间适当地分离。
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Claims (52)

1.打印的止血产品，其具有至少三个维度且由从第一外层直至第二外层沉积在彼此之上的叠层制成，其中所述叠层的相邻层接合在一起，和其中所述叠层的至少一层具有由止血流动剂制成的至少一部分，所述止血流动剂的组成包括：
-非交联的原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；和
-至少一种单糖。
2.如权利要求1所述的打印的止血产品，其中所述叠层的所述至少一层具有由组成不同的止血流动剂制成的多个部分。
3.如权利要求1所述的打印的止血产品，其中所述叠层的所述至少一层完全由相同的止血流动剂制成。
4.如权利要求3所述的打印的止血产品，其中所述叠层的所有层均具有相同组成。
5.如权利要求1至4任一项所述的打印的止血产品，其包括多个相邻层，所述多个相邻层的各层具有由所述止血流动剂制成的至少一部分。
6.如权利要求1至5任一项所述的打印的止血产品，其中所述叠层的第一外层和第二外层的至少一个具有由所述止血流动剂制成的部分。
7.如权利要求6所述的打印的止血产品，其中所述第一外层和第二外层的所述至少一个完全由相同的止血流动剂制成。
8.如权利要求6至7任一项所述的打印的止血产品，其中所述叠层的第一外层和第二外层具有相同组成。
9.如权利要求8所述的打印的止血产品，其中所述叠层的各层具有由与所述第一外层和第二外层的至少一个的流动性混合物相同的流动性混合物制成的周缘部分。
10.如权利要求1至9任一项所述的打印的止血产品，其中所述叠层的至少一层包括由溶胀性质不同于所述叠层的其它层的溶胀性质的止血流动剂制成的部分。
11.如权利要求1至10任一项所述的打印的止血产品，其中所述止血流动剂的组成包括相对于该组成的总重量范围为70％-99％重量、优选地范围为75％-96％重量、和甚至更优选地范围为80％-90％重量的胶原含量。
12.如权利要求1至11任一项所述的打印的止血产品，其中所述止血流动剂的组成包括相对于该组成的总重量范围为1％-12.5％重量、优选地范围为2％-8％重量、更优选地范围为2.5％-7.5％重量、和甚至更优选地范围为4％-6％重量的单糖含量。
13.如权利要求1至12任一项所述的打印的止血产品，其中所述止血流动剂的组成包括至少一种糖胺聚糖。
14.如权利要求13所述的打印的止血产品，其中所述糖胺聚糖的含量相对于所述组成的总重量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地范围为4％-15％重量、更优选地范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地范围为8％-10％重量。
15.如权利要求13至14任一项所述的打印的止血产品，其中所述糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物。
16.如权利要求1至15任一项所述的打印的止血产品，其中所述止血流动剂的组成包括至少一种凝血因子、特别是凝血酶。
17.如权利要求16所述的打印的止血产品，其中所述凝血因子的量的范围为所述组成的0.01IU/mg-20IU/mg、优选地范围为所述组成的0.05IU/mg-10IU/mg、更优选地范围为所述组成的0.1IU/mg-5IU/mg、和甚至更优选地范围为所述组成的0.2IU/mg-2IU/mg。
18.如权利要求1至10任一项所述的打印的止血产品，其中所述止血流动剂由止血粉末制成，所述止血粉末的组成包括：
-原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原，所述胶原的量相对于所述止血粉末的组成的总重量范围为75％-96％重量、优选地范围为80％-90％重量；和
-至少一种单糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-12.5％重量、优选地量范围为2.5％-7.5％重量、和更优选地量范围为4％-6％重量。
19.如权利要求18所述的打印的止血产品，其中所述止血粉末进一步包括至少一种糖胺聚糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地量范围为4％-15％重量、更优选地量范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地量范围为8％-10％重量。
20.如权利要求18和19任一项所述的打印的止血产品，其中所述止血粉末进一步包括至少一种凝血因子，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量低于0.5％重量、优选地量低于0.1％重量。
21.止血流动剂在三维打印机中作为打印墨的用途，其中所述止血流动剂由与盐水溶液混合的止血粉末制成，其中所述止血粉末的组成包括：
-非交联的原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；和
-至少一种单糖。
22.如权利要求21所述的用途，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括相对于该组成的总重量范围为70％-99％重量、优选地范围为75％-96％重量、和甚至更优选地范围为80％-90％重量的胶原含量。
23.如权利要求21至22任一项所述的用途，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括相对于该组成的总重量范围为1％-12.5％重量、优选地范围为2％-8％重量、更优选地范围为2.5％-7.5％重量、和甚至更优选地范围为4％-6％重量的单糖含量。
24.如权利要求21至23任一项所述的用途，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括至少一种糖胺聚糖。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述糖胺聚糖的含量相对于所述组成的总重量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地范围为4％-15％重量、更优选地范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地范围为8％-10％重量。
26.如权利要求24至25任一项所述的用途，其中所述糖胺聚糖选自硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸及其混合物。
27.如权利要求21至26任一项所述的用途，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括至少一种凝血因子、特别是凝血酶。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述凝血因子的量的范围为所述组成的0.01IU/mg-20IU/mg、优选地范围为所述组成的0.05IU/mg-10IU/mg、更优选地范围为所述组成的0.1IU/mg-5IU/mg、和甚至更优选地范围为所述组成的0.2IU/mg-2IU/mg。
29.如权利要求21至26任一项所述的用途，其中所述盐水溶液包括至少一种凝血因子、特别是凝血酶。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述凝血因子的量的范围为所述盐水溶液的10IU/mL-5000IU/mL、优选地范围为所述盐水溶液的25IU/mL-2500IU/mL、更优选地范围为所述盐水溶液的50IU/mL-1000IU/mL、和甚至更优选地范围为所述盐水溶液的100IU/mL-500IU/mL。
31.如权利要求21所述的用途，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括：
-原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原，所述胶原的量相对于所述止血粉末的组成的总重量范围为75％-96％重量、优选地范围为80％-90％重量；和
-至少一种单糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-12.5％重量、优选地量范围为2.5％-7.5％重量、和更优选地量范围为4％-6％重量。
32.如权利要求31所述的用途，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成进一步包括至少一种糖胺聚糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地量范围为4％-15％重量、更优选地量范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地量范围为8％-10％重量。
33.如权利要求31和32任一项所述的用途，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末进一步包括至少一种凝血因子，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量低于0.5％重量、优选地量低于0.1％重量。
34.如权利要求21至33任一项所述的用途，其中用于形成所述止血流动剂的盐水溶液的质量为所述止血粉末的质量的2-10倍、优选地为所述止血粉末的质量的4-5倍。
35.如权利要求21至34任一项所述的用途，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末包括至少80％重量的其尺寸在20μm和300μm之间的颗粒。
36.如权利要求21至35任一项所述的用途，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末包括至少90％重量的其尺寸低于350μm的颗粒。
37.用三维增材打印机制造具有至少三个维度的止血产品的方法，其包括以下步骤：
a)向所述三维增材打印机提供三维模型，所述三维模型对应于所要制造的止血产品的结构，和处理所述三维模型以用多个层限定打印图案，所述多个层设计成在彼此之上层叠以形成对应于三维模型的叠层；
b)向所述三维增材打印机提供至少一种止血流动剂以作为打印墨使用，其中所述流动剂由与盐水溶液混合的止血粉末制成，其中所述止血粉末的组成包括：
o非交联的原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原；和
o至少一种单糖；
c)用所述三维增材打印机通过沉积打印墨以将层相继地打印在彼此之上而打印所述止血产品，所述形成包括用所述三维增材打印机沉积所述止血流动剂以形成所述叠层的至少一层的至少一部分。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述叠层的至少一层全部由所述止血流动剂的沉积而制成。
39.如权利要求37至38任一项所述的方法，其中所述止血流动剂在所述叠层的多个层中使用以获得止血产品(10)。
40.如权利要求37至39任一项所述的方法，其中使用所述止血流动剂形成所述叠层的所有层以获得止血产品(10)。
41.如权利要求37至39任一项所述的方法，其中在步骤b)中，向所述三维增材打印机提供多种止血流动剂以作为打印墨使用，所述止血流动剂具有不同的组成。
42.如权利要求37至41任一项所述的方法，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成包括：
-原纤维型胶原，其包含相对于该胶原的总重量，含量为至少70％重量的纤维胶原和/或原纤维胶原，所述胶原的量相对于所述止血粉末的组成的总重量范围为75％-96％重量、优选地范围为80％-90％重量；和
-至少一种单糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-12.5％重量、优选地量范围为2.5％-7.5％重量、和更优选地量范围为4％-6％重量。
43.如权利要求42所述的方法，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成进一步包括至少一种糖胺聚糖，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量范围为1％-30％重量、优选地范围为2％-25％重量、优选地量范围为4％-15％重量、更优选地量范围为5％-12.5％重量、和甚至更优选地量范围为8％-10％重量。
44.如权利要求42至43任一项所述的方法，其中形成所述止血流动剂的所述止血粉末的组成进一步包括至少一种凝血因子，相对于所述止血粉末的组成的总重量，其量低于0.5％重量、优选地量低于0.1％重量。
45.如权利要求42至43任一项所述的方法，其中用于形成所述止血流动剂的所述盐水溶液包括至少一种凝血因子，所述凝血因子的量的范围为所述盐水溶液的10IU/mL-5000IU/mL、优选地范围为所述盐水溶液的25IU/mL-2500IU/mL、更优选地范围为所述盐水溶液的50IU/mL-1000IU/mL、和甚至更优选地范围为所述盐水溶液的100IU/mL-500IU/mL。
46.如权利要求37至45任一项所述的方法，其中用于形成所述止血流动剂的所述盐水溶液的质量为所述止血粉末的质量的2-10倍、和优选地为所述止血粉末的质量的4-5倍。
47.如权利要求37至46任一项所述的方法，其中打印步骤c)在环境大气下完成。
48.如权利要求37至47任一项所述的方法，其中在已经在打印步骤c)中形成所述止血产品之后，进行其中使用包括凝血因子、特别是凝血酶的溶液涂覆所述止血产品的外表面的涂覆步骤d)。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述涂覆步骤d)通过在所述止血产品的外表面上喷雾包括凝血因子的溶液而进行。
50.如权利要求37至49任一项所述的方法，其中在已经在打印步骤c)中形成所述止血产品之后，进行其中将所述止血产品浸泡在包括凝血因子、特别是凝血酶的溶液中的浸泡步骤e)。
51.如权利要求37至50任一项所述的方法，其中制造所述止血产品的最后步骤在于，将打印的止血产品在环境大气中维持预定的静置期，所述预定的静置期优选地少于10分钟、更优选地少于5分钟、和甚至更优选地少于1分钟。
52.如权利要求37至51任一项所述的方法，其中整个过程在环境大气下在对所述止血产品没有任何刺激、特别是没有光刺激或热刺激的情况下进行。
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