CN115671373B - GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种GelMA‑DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料及其制备方法，制备方法包括(ⅰ)甲基丙烯酸化明胶的合成；(ⅱ)多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶的合成；(ⅲ)季铵化壳聚糖的合成；(ⅳ)光引发剂溶液的配置；(ⅴ)海绵的制备等步骤。本发明制备工艺简单，对反应过程的设备和条件要求较低，能够实现工业化生产；所制备的复合止血海绵材料具有优异吸水溶胀性能、可控的降解速率、良好的组织粘附能力、适宜的力学性能、良好的体外生物相容性以及显著的抗菌活性和优异的体内外凝血止血性能，在临床体内外止血领域中展现了巨大的的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料及其制备方法。
背景技术
在战争、外科手术和重大意外事故中不可控的大出血是造成创伤性死亡的主要原因之一。在创伤严重和大量出血的情况下，人体血液自身的凝血机能无法实现凝血止血，传统的止血方法(如：压迫止血、纱布包扎或手术缝合等)也难以满足急救需求或达到预期的止血效果。因此，开发新型止血材料对于意外大出血的及时救治具有重要的临床应用价值。理想的止血材料应不仅能快速控制血管或内脏器官出血，而且应具有良好的生物相容性、自粘性、抗菌性、和价格低廉等特点。
目前，以壳聚糖为主要成分的止血材料受到广泛的关注。壳聚糖及其衍生物具有良好是生物相容性，其分子结构中含有大量带正电荷的氨基，能够吸附血液中带负电荷的血小板，促进血小板活化和血红蛋白凝集，加速纤维蛋白凝块的形成。同时，壳聚糖及其衍生物对真菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定的抗菌活性，其表面的正电荷可以与细菌带负电荷的表面相互作用，改变细胞膜的渗透性，引起内容物流出和细菌死亡。然而，壳聚糖的诸多特性也限制了其在止血领域的应用。壳聚糖在体内的降解速率慢，粘附性能较差，导致壳聚糖止血材料在没有外力的作用下很难固定在伤口处，造成止血材料的脱落和二次出血。壳聚糖止血材料往往质地较硬，难以贴合不规则的伤口，不仅降低了止血材料对血管施加的压力，还增加了细菌滋生的空间。
发明内容
基于以上现有技术的不足，本发明所解决的技术问题在于克服壳聚糖在作为止血材料时存在的诸多缺陷。本发明的目的是提供一种GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，包括以下步骤：
(ⅰ)甲基丙烯酸化明胶的合成
将明胶溶解在磷酸盐缓冲液中，再滴加甲基丙烯酸酐，搅拌反应，反应完成后，透析，冷冻干燥，得到甲基丙烯酸化明胶；
(ⅱ)多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶的合成
将甲基丙烯酸化明胶溶解于混合溶液中，溶解完全后，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1～2g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，再加入多巴胺盐酸盐，反应后，透析，冷冻干燥，得到多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶；
(ⅲ)季铵化壳聚糖的合成
将壳聚糖溶解到乙酸水溶液中，加入季铵盐，搅拌反应，反应完成后，透析，冷冻干燥，得到季铵化壳聚糖；
(ⅳ)光引发剂溶液的配置
将光引发剂溶解到溶剂中，得到光引发剂溶液；
(ⅴ)海绵的制备
将步骤(ⅱ)所得多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶、步骤(ⅲ)所得季铵化壳聚糖和甘油加入到光引发剂溶液中，紫外灯固化、冷冻干燥后得到多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料。
在上述技术方案中，所述步骤(ⅰ)中加入的甲基丙烯酸酐与明胶的体积质量比为(0.4～2)mL：1g。
在上述技术方案中，所述步骤(ⅰ)中搅拌反应时长为60min～120min；所述步骤(ⅲ)中的搅拌反应时长为15h～20h；所述步骤(ⅰ)、(ⅱ)和(ⅲ)的透析均在去离子水进行，透析时长均为72h～96h；所述步骤(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)和(ⅴ)的冷冻干燥时长均为12h～24h；所述步骤(ⅴ)中紫外灯固化时长为3min。
在上述技术方案中，所述步骤(ⅱ)中混合溶液为磷酸盐缓冲液和N,N-二甲基甲酰胺按照体积比1：1组成的混合溶液。
在上述技术方案中，所述步骤(ⅱ)中甲基丙烯酸化明胶与溶剂的质量体积比为1g：8mL；所述N-羟基琥珀酰亚胺与甲基丙烯酸化明胶的质量比为(0.5～1)：1；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与甲基丙烯酸化明胶的质量比为(1～2)：1；所述多巴胺盐酸盐与甲基丙烯酸化明胶的质量比为(0.5～2)：1。
在上述技术方案中，所述步骤(ⅲ)中的季铵盐为四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、氯化十二烷基二甲基苄基铵、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵或者超支化吉米奇季铵盐中的任意一种；所述季铵盐与壳聚糖的质量比为(1～2)：1。
在上述技术方案中，所述乙酸水溶液由乙酸和去离子水按照体积比2:1混合而成。
在上述技术方案中，所述光引发剂为Irgacure2959、LAP或Eosin Y中的任意一种；所述步骤(ⅳ)中的溶剂为去离子水；所述光引发剂溶液的浓度为0.5W/V％～2W/V％。
在上述技术方案中，所述步骤(ⅴ)中多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶的浓度为5W/V％～15W/V％；所述季铵化壳聚糖的浓度为1W/V％～3W/V％；所述甘油的浓度为1V/V％～3V/V％。
一种复合止血海绵材料，包括GelMA-DA、季铵化壳聚糖、甘油以及光引发剂，通过前述方法制备。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料及其制备方法，制备工艺简单，对反应过程的设备和条件要求较低，能够实现工业化生产；所制备的复合止血海绵材料具有优异吸水溶胀性能、可控的降解速率、良好的组织粘附能力、适宜的力学性能、良好的体外生物相容性以及显著的抗菌活性和优异的体内外凝血止血性能，在临床体内外止血领域中展现了巨大的的应用前景；
附图说明
图1是本发明实施例1～9对明胶和壳聚糖分别进行甲基丙烯酸酐和季铵化改性后的核磁结果；
图2是本发明对GelMA进行不同浓度DA改性的核磁和扫描电镜结果；
图3是本发明不同GelMA/QCS比例下制备的复合止血海绵材料的扫描电镜结果；
图4是本发明实施例1～9制备的复合止血海绵材料的吸水率测试结果；
图5是本发明实施例1～9制备的复合止血海绵材料的降解度测试结果；
图6是本发明实施例1～9制备的复合止血海绵材料的体外凝血测试结果；
图7是本发明实施例1～9制备的复合止血海绵材料的压缩模量测试结果；
图8是本发明实施例7制备的复合止血海绵材料粘结性能测试结果；
图9是本发明实施例7制备的复合止血海绵材料生物相容性测试结果；
图10是本发明实施例7制备的复合止血海绵材料及对比例1～2材料的抗菌性能测试结果；
图11为本发明实施例7制备的复合止血海绵材料及对比例1～2材料的体内止血性能测试结果。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明技术方案，下面结合说明书附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
一种GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，包括以下步骤：
(ⅰ)甲基丙烯酸化明胶(GelMA)的合成
60℃和磁力搅拌条件下，先将明胶(Gelatin)按照每克明胶加入10mL～15mL常规中性磷酸盐缓冲液(PBS)的比例获得明胶溶液，待明胶完全溶解后，再按每克明胶滴加0.4mL～2mL的甲基丙烯酸酐的比例以每3s～5s一滴的速率向明胶溶液中滴加甲基丙烯酸酐，滴加过程中维持前述搅拌条件及温度，滴加完成后搅拌反应60min～120min；反应完成后，在去离子水中透析72h～96h以去除未反应的甲基丙烯酸酐和明胶等小分子；然后冷冻干燥12h～24h，制得到白色海绵状的GelMA；
明胶(Gelatin)和甲基丙烯酸化明胶(GelMA)的核磁结果如图1所示，由两者的核磁数据对比可见，甲基丙烯酸酯的特征官能团出现在产物上，因此可以证明已成功制备得到GelMA；
同时，由图2(b)可以看出GelMA清晰的海绵状结构。
(ⅱ)多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶(GelMA-DA)的合成
搅拌状态下，按质量体积比1g:(7～9)mL的比例将步骤(ⅰ)制备的甲基丙烯酸化明胶(GelMA)溶解在混合溶液中，GelMA全部溶解后，依次先后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)粉末和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)粉末；随后，按每克GelMA加入0.5g～2g多巴胺盐酸盐的比例将盐酸多巴胺粉末加入到上述体系内，反应18h～24h后，在去离子水中透析72h～96h以去除未反应的多巴胺和GelMA等小分子，然后冷冻干燥12h～24h，制得到海绵状的GelMA-DA；
其中，混合溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)按照体积比1：1组成的混合溶液；
N-羟基琥珀酰亚胺与甲基丙烯酸化明胶的质量比为(0.5～1)：1；
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与甲基丙烯酸化明胶的质量比为(1～2)：1；
由图2(a)的核磁数据可以看出，不同多巴胺加入比例下的产物上均出现多巴胺基团的特征吸收峰，说明产物已成功接枝上多巴胺基团，同时由图2(b)的SEM图也可以看出，不同多巴胺加入比例下的产物均具有清晰的海绵状结构。
(ⅲ)季铵化壳聚糖(QCS)的合成
按照每72mL乙酸水溶液加入1g壳聚糖(Chitosan)粉末的比例，将壳聚糖粉末溶解到2V/V％乙酸水溶液中，按每克壳聚糖加入1g～2g季铵盐的比例向其中加入季铵盐，搅拌反应15h～20h以控制壳聚糖的季铵化程度，然后通过在去离子水中透析72h～96h以去除未反应的壳聚糖和季铵盐等小分子，然后冷冻干燥12h～24h，制得到海绵状的季铵化壳聚糖；
其中，季铵盐为四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、氯化十二烷基二甲基苄基铵、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵或者超支化吉米奇季铵盐中的任意一种；
通过图1(b)的核磁数据可以看出，产物上出现季铵盐基团，说明成功获得季铵化壳聚糖(QCS)。
(ⅳ)光引发剂溶液的配置
将光引发剂溶解到去离子水溶液中制得0.5W/V％～2W/V％光引发剂溶液；
其中，光引发剂为Irgacure2959、LAP或Eosin Y中的任意一种；
(ⅴ)海绵的制备
将步骤(ⅱ)制得的GelMA-DA、步骤(ⅲ)制得的季铵化壳聚糖和甘油依次加入到步骤(ⅳ)制得的光引发剂溶液中，搅拌均匀，紫外灯固化3min，然后冷冻干燥12h～24h，升华水凝胶体系中的水分，形成多孔状网络结构，提高止血海绵快速吸收血液的能力，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料；
其中，GelMA-DA浓度为5W/V％～15W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为1W/V％～3W/V％，甘油的浓度为1V/V％～3V/V％，
由图3的SEM数据可以看出，不同GelMA-DA、QCS比例下的止血材料均获得清晰的海绵状结构。
(ⅵ)止血材料的剪裁
将经冷冻干燥后的海绵，通过剪刀裁剪成长1.5cm、宽1cm和厚0.5cm的海绵块备用。
本发明中各原料所起的作用以及反应机理如下：
本发明制备了一种GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料，该止血海绵的主要成分包括GelMA-DA、季铵化壳聚糖、甘油以及光引发剂。在紫外光照射下，光引发剂能够产生高活性的自由基，进一步打开GelMA-DA上甲基丙烯酸基团的碳碳双键，引发GelMA-DA交联聚合，构成了止血海绵的主要骨架，为复合海绵提供了力学强度并维持了使用过程中止血海绵的主要结构；同时，以GelMA-DA作为主要结构也有利于实现可控的止血海绵降解速率。此外，GelMA-DA上的邻苯二酚基团为止血海绵提供了组织粘结能力，使得止血海绵能够紧实地贴合在伤口处，避免了使用过程中的按压。止血海绵的止血和抗菌效益主要得益于季铵化壳聚糖，季铵化改性后的壳聚糖携带了更多的正电荷，能够吸附血小板和红细胞，促进内源性凝血反应；同时，能够改变细菌细胞膜的通透性，抑制细菌生长。甘油是一种被广泛应用的塑化剂，能够降低止血海绵的压缩模量，使得止血海绵与创伤组织贴合更紧密，减少细菌滋生空间，促进伤口愈合。
与现有技术相比，本发明通过按比例混合GelMA-DA、季铵化壳聚糖以及甘油，结合冷冻干燥技术，制备了一种具有优异的吸水性、良好的自粘性、适当的降解性以及合适的力学性能的止血海绵材料；在本发明的制备方法中，通过光固化的方式，将具有良好的生物相容性、快速的生物降解能力以及组织粘附性的GelMA-DA交联聚合形成复合海绵材料的主要网络结构。季铵化壳聚为复合海绵提供了富集血小板、促凝血的止血功能。同时，季铵化壳聚糖的添加，有效地增强了复合海绵对金球菌和大肠杆菌的抗菌能力。添加适量的甘油以改善复合材料的力学性能，致使复合海绵材料能够贴合不规则的伤口，提升止血效果。在大鼠的肝脏及尾部出血模型中，该止血海绵材料能够快速有效地控制伤口出血，减少失血量并缩短止血时间。本发明的制备工艺简单，对反应过程的设备和条件要求较低，能够实现工业化生产。
实施例1
一种GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵的制备方法，具体包括以下步骤：
甲基丙烯酸化明胶(GelMA)的合成：先将10g明胶溶解在100mL磷酸盐缓冲液中，再向其中滴加8mL甲基丙烯酸酐，搅拌反应120min；反应完成后，在去离子水中透析72h以去除未反应的小分子；然后冷冻干燥24h，制得到白色海绵状的GelMA。
多巴胺改性GelMA(GelMA-DA)的合成：将1g的GelMA溶解在8mL的磷酸盐缓冲液(PBS)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)组成的混合溶液(PBS和DMF体积比为1：1)中；GelMA全部溶解后，加入0.9g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1.5g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)；随后，按1g的盐酸多巴胺到上述体系内，充分反应后，在去离子水中透析72h以去除未反应的小分子，然后冷冻干燥24h，制得到海绵状的GelMA-DA；
季铵化壳聚糖的合成：将1g壳聚糖粉末溶解到72mL浓度为2V/V％乙酸水溶液中，加入1.82g的2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，搅拌反应18h，通过在去离子水中透析72h以去除未反应的小分子，然后冷冻干燥24h，制得到海绵状的季铵化壳聚糖。
光引发剂溶液的配置：将I2959光引发剂溶解到去离子水溶液中制得1W/V％I2959水溶液。
海绵的制备：将上述的GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油分别加入到光引发剂溶液中，其中，GelMA-DA浓度为5W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为1W/V％，甘油的浓度为1V/V％，搅拌均匀；紫外灯固化3min；冷冻干燥24h，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料。
实施例2
GelMA、GelMA-DA、季铵化壳聚糖的合成以及光引发剂溶液配置和实施例1相同。
海绵的制备：将上述的GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油分别加入到I2959水溶液中，其中，GelMA-DA浓度为10W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为1W/V％，甘油的浓度为2V/V％，搅拌均匀；紫外灯固化3min；冷冻干燥24h，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料。
实施例3
GelMA、GelMA-DA、季铵化壳聚糖的合成以及光引发剂溶液配置和实施例1相同。
海绵的制备：将上述的GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油分别加入到光引发剂溶液中，其中，GelMA-DA浓度为15W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为1W/V％，甘油的浓度为3V/V％，搅拌均匀；紫外灯固化3min；冷冻干燥24h，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料。
实施例4
GelMA、GelMA-DA、季铵化壳聚糖的合成以及光引发剂溶液配置和实施例1相同。
海绵的制备：将上述的GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油分别加入到I2959水溶液中，其中，GelMA-DA浓度为5W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为2W/V％，甘油的浓度为2V/V％，搅拌均匀；紫外灯固化3min；冷冻干燥24h，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料。
实施例5
GelMA、GelMA-DA、季铵化壳聚糖的合成以及光引发剂溶液配置和实施例1相同。
海绵的制备：将上述的GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油分别加入到I2959水溶液中，其中，GelMA-DA浓度为10W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为2W/V％，甘油的浓度为3V/V％，搅拌均匀；紫外灯固化3min；冷冻干燥24h，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料。
实施例6
GelMA、GelMA-DA、季铵化壳聚糖的合成以及光引发剂溶液配置和实施例1相同。
海绵的制备：将上述的GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油分别加入到I2959水溶液中，其中，GelMA-DA浓度为15W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为2W/V％，甘油的浓度为1V/V％，搅拌均匀；紫外灯固化3min；冷冻干燥24h，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料。
实施例7
GelMA、GelMA-DA、季铵化壳聚糖的合成以及光引发剂溶液配置和实施例1相同。
海绵的制备：将上述的GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油分别加入到I2959水溶液中，其中，GelMA-DA浓度为5W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为3W/V％，甘油的浓度为3V/V％，搅拌均匀；紫外灯固化3min；冷冻干燥24h，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料。
实施例8
GelMA、GelMA-DA、季铵化壳聚糖的合成以及光引发剂溶液配置和实施例1相同。
海绵的制备：将上述的GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油分别加入到I2959水溶液中，其中，GelMA-DA浓度为10W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为3W/V％，甘油的浓度为1V/V％，搅拌均匀；紫外灯固化3min；冷冻干燥24h时，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料。
实施例9
GelMA、GelMA-DA、季铵化壳聚糖的合成以及光引发剂溶液配置和实施例1相同。
海绵的制备：将上述的GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油分别加入到I2959水溶液中，其中，GelMA-DA浓度为15W/V％，季铵化壳聚糖的浓度为3W/V％，甘油的浓度为2V/V％，搅拌均匀；紫外灯固化3min；冷冻干燥24h，制得GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料。
对比例1
商用明胶海绵止血材料，购买自南昌沪士达医疗器械科技有限公司。
对比例2
商用壳聚糖海绵止血材料，购买自河南健康广济生物技术有限公司。
对止血材料相关性能测试：
一、吸水率测试
对本发明的实施例1～9的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料进行吸水率测试及正交试验分析。
1.测试方法：
称取实施例1～9制得的止血材料的初始质量，分别浸泡在50mL去离子水(37℃)中60秒后取出称重。计算浸水后与浸水前材料的质量比。
2.测试结果：
如图4(a)所示，其中实施例1的吸水率为4789.65±194.11％，实施例2的吸水率为1494.84±97.97％，实施例3的吸水率为230.57±32.04％，实施例4的吸水率为4114.56±100.45％，实施例5的吸水率为1564.65±50.98％，实施例6的吸水率为370.00±43.41％，实施例7的吸水率为4916.97±91.43％，实施例8的吸水率为384.51±14.16％，实施例9的吸水率为256.75±21.97％。
结果表明，GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料具有优异的快速吸水能。
同时，通过图4(b)的正交试验分析可以看出，GelMA-DA对吸水率的影响较大，季铵化壳聚糖和甘油的含量对吸水率的影响较小。具体地，随着GelMA-DA的浓度升高，吸水率明显下降。随着季铵化壳聚糖浓度增加，吸水率下降幅度较小。而随着甘油浓度的增加，吸水率增加。这可能是因为GelMA-DA的浓度梯度跨度比季铵化壳聚糖和甘油的浓度梯度跨度更大，因此影响更为显著。同时，在复合海绵的制备过程中，GelMA-DA通过I2959光引发剂形成交联网络结构，随着GelMA-DA浓度升高，海绵内部的交联网络更加复杂，孔隙率下降，导致吸水率下降。而甘油常被用做增塑剂，有利于高分子链的运动，吸水率增大。
二、降解测试
对本发明的实施例1～9的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料进行体外48小时后的降解测试及正交分析。
1.测试方法：
取质量相同的实施例1～9制得的止血材料预先称重，重量标记为m1。将样品浸泡在含有2.5U/mL溶菌酶的PBS中。37℃振荡孵育48h后取出，用去离子水冲洗干净，冷冻干燥后称重，记冻干后的重量为m2。
2.测试结果：
如图5(a)所示，其中实施例1的剩余质量分数为11.26±1.51％，实施例2的降解率为19.91±6.67％，实施例3的降解率为54.90±1.78％，实施例4的降解率为33.72±5.35％，实施例5的降解率为41.43±9.13％，实施例6的降解率为50.04±11.10％，实施例7的降解率为35.50±2.32％，实施例8的降解率为36.67±1.53％，实施例9的降解率为52.06±5.04％。
结果表明，GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料能够实现降解速率可控，降解速率随着GelMA-DA、季铵化壳聚糖和甘油的浓度改变而改变。
通过图5(b)的正交试验分析可以看出，GelMA-DA对降解度的影响最为显著，这可能是由于浓度为15％的GelMA-DA形成了更加密集的交联互穿网络。
三、体外凝血测试
对本发明的实施例1～9的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料进行体外凝血测试。
1.测试方法：
在实施例1～9制得的止血材料表面滴加200μL的新鲜兔血，孵育5分钟后用5mL去离子水浸泡五分钟，测量溶液在540nm处的吸光度。按照未加材料的空白对照组的吸光度换算成数值为100，实施例1～9的BCI是实施例1～9在540nm吸光度值与空白组吸光度值的比值乘100。BCI的值越低表明止血效果越好。
2.测试结果：
如图6(a)所示，其中实施例1的BCI值为18.60±0.27，实施例2的BCI值为60.89±1.17，实施例3的BCI值为35.86±0.49，实施例4的BCI值为11.05±0.02，实施例5的BCI值为9.28±0.28，实施例6的BCI值为30.44±0.83，实施例7的BCI值为5.89±0.13，实施例8的BCI值为9.83±0.19，实施例9的BCI值为9.78±0.21。
通过图6(b)的正交试验分析可以看出，季铵化壳聚糖的含量对BCI的值起决定性作用。季铵化壳聚糖的含量越高，BCI的值越低，表明凝血效果越好。研究表明，季铵化壳聚糖上的氨基和季铵基团带有正电荷，可以聚集带有负电荷的血小板，促进血栓的形成，起到止血的作用。
四、压缩模量测试
对本发明的实施例1～9的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料，将样品剪裁成圆柱体(直径为15mm，高为5mm)。使用万能试验机测试样品的压缩性能。以1mm/min的位移速率压缩样品，记录样品的应力和应变之间的关系并计算压缩模量。
测试结果：
如图7(a)所示，其中实施例1的压缩模量为51.15±15.08kPa，实施例2的压缩模量为97.31±41.30kPa，实施例3的压缩模量为97.31±41.30kPa，实施例4的压缩模量为58.90±12.25kPa，实施例5的压缩模量为137.36±33.87kPa，实施例6的压缩模量为765.81±193.99kPa，实施例7的压缩模量为23.04±5.34kPa，实施例8的压缩模量为683.28±93.51kPa实施例9的压缩模量为1070.29±99.42kPa。
结果表明，GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料的压缩模量能够实现可控。
通过图7(b)的正交试验分析可以看出随着壳聚糖和GelMA-DA的含量增加，海绵的压缩模量显著增加。甘油的添加明显地降低了止血海绵的模量，增加了海绵的柔顺性，进而使材料能够更加紧密地贴合各种不规则伤口，减少细菌滋生地空间，促进伤口愈合。
五、粘结性能测试
对本发明的实施例7的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料进行粘结性能测试。
测试结果：
如图8所示，GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵能够很好的粘结在猪皮表面，最大粘结强度可以达到128.6kPa，这得益于GelMA-DA的邻苯二酚基团以及季铵化壳聚糖上带正电荷的氨基和季胺基。
六、细胞相容性测试
对本发明的实施例7的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料进行细胞相容性测试。
1.测试方法：
在活/死染色实验中，将L929细胞在实施例7的浸提液中培养。空白对照采用完全培养基。在培养1天和5天后，采用材料活/死染色试剂盒对细胞进行染色，观察细胞的存活状态；在细胞粘附实验中，将L929细胞种植在实施例7表面，空白对照组不接种细胞。培养24小时后，脱水干燥处理并通过扫描电子显微镜观察。
2.测试结果：
如图9(a)所示，活细胞被染成绿色，并且随着培养时间变化，绿色荧光越来越密集。这表明在实施例7浸提液培养的细胞具有良好的生长繁殖能力，与未加材料的空白对照组相当。进一步说明实施例7具有良好的细胞相容性。
同时，将L929细胞种植在实施例7表面，正如图9(b)中的细胞粘附试验所示。培养24小时后，在不同的放大倍数下均可以观察到大量L929细胞粘附在实施例7的表面。
结果表明，实施例7可以提供大量的细胞粘附位点，促进细胞在材料周围生长繁殖，进而促进伤口愈合。
七、抗菌性能测试
对本发明的实施例7的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合多孔海绵止血材料与对比例1～2的商用材料进行抗菌性能测试。
1.测试方法：
将对比例1～2和实施例7剪裁成同样的大小，放置在带有菌液的琼脂板上培养24小时。随后观察琼脂板上的抑菌圈大小。另外，将大小相同的对比例1～2和实施例7分别浸泡在细菌悬液中。培养一段时间并计算细菌存活率。
2.实验结果：
在图10中可以观察到，对比例2和实施例7对金球菌抑菌圈明显，其中实施例7组的细菌存活率降到了0.2％。同时，对比例1～2对于大肠杆菌的抑菌圈均不明显。但实施例7组仍出现明显抑菌圈，且细菌存活率降到了6.2％。
结果表明，实施例7的抑菌效果大于对比例2。对比例1的抑菌圈和抑菌率最小，抑菌效果最差。
综上所述，实施例7具有优异的抑菌能力，能够抑制细菌生长繁殖。
八、体内凝血性能测试
对本发明的实施例7的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵与对比例1～2的商用材料的体内凝血性能进行测试。
1.测试方法：
采用SD鼠作为动物实验对象，以小鼠的尾部创伤作为实验模型。具体操作如下：在鼠尾直径为5毫米处剪断鼠尾。待血液流出后，贴上止血材料。空白对照组划伤后不做处理。记录止血时间及失血量。
2.测试结果：
相比于对比例1～2，实施例7能够快速有效地控制住小鼠尾部的血液流失。图11(a)展示了空白组、对比例1、对比例2以及实施例7的止血效果，可以看到对比例1～2以及实施例7均具有良好的止血效果。图11(b-c)统计了失血量和止血时间，可以看出，对比空白对照组，实施例7能够将失血量从0.757g降低到0.116g，将凝血时间从119秒降低到50秒，显著控制了受损后的血液流失。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1. 一种GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（ⅰ）甲基丙烯酸化明胶的合成
将明胶溶解在磷酸盐缓冲液中，再滴加甲基丙烯酸酐，搅拌反应，反应完成后，透析，冷冻干燥，得到甲基丙烯酸化明胶；
（ⅱ）多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶的合成
将甲基丙烯酸化明胶溶解于混合溶液中，溶解完全后，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，再加入多巴胺盐酸盐，反应后，透析，冷冻干燥，得到多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶；
所述混合溶液为磷酸盐缓冲液和N,N-二甲基甲酰胺按照体积比1：1组成；
（ⅲ）季铵化壳聚糖的合成
将壳聚糖溶解到乙酸水溶液中，加入季铵盐，搅拌反应，反应完成后，透析，冷冻干燥，得到季铵化壳聚糖；
（ⅳ）光引发剂溶液的配置
将光引发剂溶解到溶剂中，得到光引发剂溶液；
（ⅴ）海绵的制备
将步骤（ⅱ）所得多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶、步骤（ⅲ）所得季铵化壳聚糖和甘油加入到光引发剂溶液中，紫外灯固化、冷冻干燥后得到多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料。
2. 根据权利要求1所述的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（ⅰ）中加入的甲基丙烯酸酐与明胶的体积质量比为（0.4~2）mL：1g。
3. 根据权利要求1所述的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（ⅰ）中搅拌反应时长为60 min~120 min；所述步骤（ⅲ）中的搅拌反应时长为15 h~20 h；所述步骤（ⅰ）、（ⅱ）和（ⅲ）的透析均在去离子水中进行，透析时长均为72 h~96 h；所述步骤（ⅰ）、（ⅱ）、（ⅲ）和（ⅴ）的冷冻干燥时长均为12 h~24 h；所述步骤（ⅴ）中紫外灯固化时长为3 min。
4. 根据权利要求1所述的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（ⅱ）中甲基丙烯酸化明胶与溶剂的质量体积比为1 g：（7~9） mL；所述N-羟基琥珀酰亚胺与甲基丙烯酸化明胶的质量比为（0.5~1）：1；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与甲基丙烯酸化明胶的质量比为（1~2）：1；所述多巴胺盐酸盐与甲基丙烯酸化明胶的质量比为（0.5~2）：1。
5.根据权利要求1所述的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（ⅲ）中的季铵盐为四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、氯化十二烷基二甲基苄基铵、2,3-环氧丙基三甲基氯化铵或者超支化吉米奇季铵盐中的任意一种；所述季铵盐与壳聚糖的质量比为（1~2）：1。
6.根据权利要求1所述的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，其特征在于：所述乙酸水溶液由乙酸和去离子水按照体积比2:1混合而成。
7. 根据权利要求1所述的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，其特征在于：所述光引发剂为Irgacure2959、LAP或Eosin Y中的任意一种；所述步骤（ⅳ）中的溶剂为去离子水；所述光引发剂溶液的浓度为0.5 W/V%~2 W/V%。
8. 根据权利要求1所述的GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（ⅴ）中多巴胺改性甲基丙烯酸化明胶的浓度为5 W/V%~15 W/V%；所述季铵化壳聚糖的浓度为1 W/V%~3 W/V%；所述甘油的浓度为1 V/V %~3 V/V%。
9.一种GelMA-DA/季铵化壳聚糖/甘油复合止血海绵材料，其特征在于：所述复合止血海绵材料通过权利要求1~8之一所述方法制备。
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