CN112057667A

CN112057667A - 一种可降解吸收的生物止血材料

Info

Publication number: CN112057667A
Application number: CN202010732185.0A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Hangzhou Luyang Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Luyang Technology Co Ltd
Priority date: 2020-07-27
Filing date: 2020-07-27
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明公开了一种可降解吸收的生物止血材料，涉及生物医用材料领域。该生物止血材料包括壳聚糖衍生物、丝素蛋白和药用炭，制备方法为：壳聚糖衍生物溶液中加入氯化钙粉末，搅拌混匀；将再生丝素蛋白溶液与药用炭混合，得到药用炭粉末悬浮液后，加入壳聚糖衍生物/氯化钙混合溶液，再加入乙酸，搅拌得到水凝胶；接着加入无水乙醇置换得到有机凝胶；放入超临界体系进行发泡处理，冷冻干燥后得到生物止血材料。本发明制得的生物止血材料具有较高的孔隙率，吸水性能好；具有良好的止血效果，血液凝固所需时间短，且具有良好的抑菌性，有良好的生物相容性和可降解吸收性。

Description

一种可降解吸收的生物止血材料

技术领域

本发明属于医用功能性敷料技术领域，具体涉及一种可降解吸收的生物止血材料。

背景技术

出血是创伤病人死亡的重要原因，尤其是战争及事故中造成死亡的主要原因，因而快速止血处理是应急创伤治疗的首要任务。快速有效的止血是创伤包括手术患者生命安全的必要保障，可迅速较少术区积血，有利于伤口愈合、减少感染等并发症。另外，大量出血或严重创伤是引发凝血系统障碍的主要危险因素，因此对于外科医生来说，快速止血处理也是临床治疗中的一个重要挑战。作为医用止血敷料，不仅要具有良好的止血性能，还要具有良好的机械性能、透水透气性、抑菌性、无毒无刺激性等。目前市场已经开发出多种不同组成和不同机制的止血材料，而这些材料因其不同特性而应用各异。

目前临床上使用的局部止血材料主要有止血纱布、止血纤维、止血绷带等。由于这些材料都不具有被组织吸收，止血时间较长，止血效果较差。与伤口易发生粘连，伤口容易感染等，因不能及时止血、伤口感染而丧生的案例屡见不鲜。快速而有效的止血不仅能减轻伤者的痛苦，甚至关键的时刻能挽救一个人的生命。国内一些新的止血产品如壳聚糖止血贴、明胶海绵、胶原蛋白海绵止血贴等，这些产品还是存在对创伤的粘附性较差、有些适用范围较窄、吸收速率慢、止血时间较长等缺陷。因此，开发出一种具有抗菌功能性和快速止血效果的可吸收性止血材料是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可降解吸收的生物止血材料，该生物止血材料具有较高的孔隙率，吸水性能好；止血效果好，血液凝固所需时间较短，且具有良好的抑菌性，有良好的生物相容性和可降解吸收性。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种可降解吸收的生物止血材料，包括式I所示壳聚糖衍生物、丝素蛋白和药用炭，

其中：800≤n≤1500。壳聚糖能吸附红细胞、激活血小板，具有促进凝血的作用；对壳聚糖进行改性后，其侧链能够插入到血细胞的细胞膜孔隙间，起到交联固定的作用，使得大量血细胞被固定在网络结构中，能显著加速凝血；丝素蛋白具有良好的生物相容性，植入体内后基本不会引起炎症反应，并且能支持细胞的粘附、生长、分化；其内部结晶结构使得丝素蛋白能抵抗外界较强的拉伸力和弹性冲击力；与壳聚糖衍生物复合形成三维网络结构，制得的止血材料具有较好地吸水性，有利于吸附血液中的成分在伤口部位推挤，起到一定的止血作用；药用炭本身具有巨大的比表面积，丰富的孔隙，具有较强的物理吸附性，加入后可提升材料的孔隙率、增加其内部表面积，提升吸水性，有利于封堵止血；同时可以促进丝素蛋白从SilkⅠ向SilkⅡ的构象转变，形成β-折叠的分子链，并以此为交联点与壳聚糖衍生物形成三维网络状结构；更加有利于对血液的吸收，加速凝血。

优选地，壳聚糖衍生物、丝素蛋白、药用炭的质量比为1：0.8～1：0.2～0.4。

优选地，壳聚糖衍生物由甜瓜醛对壳聚糖改性获得，壳聚糖与甜瓜醛固液比为1：0.9～1.1 g/mL。

更优选地，壳聚糖衍生物的制备方法为：

将壳聚糖溶于1～2％的醋酸中，加入甜瓜醛，室温搅拌10～12h后，用9～10％NaOH调节 pH至5～6，缓慢加入硼氢化钠(硼氢化钠与壳聚糖的质量比为1：1～1.1)后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至6.8～7.2，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用酒精反复洗涤，除去多余醛，50～55℃下真空干燥得壳聚糖衍生物。

本发明的又一目的，在于提供式I所示壳聚糖衍生物在制备可降解吸收的生物止血材料中的用途。

一种可降解吸收的生物止血材料的制备方法，包括：

S1：壳聚糖衍生物溶液中加入氯化钙粉末，搅拌混匀得到壳聚糖衍生物混合溶液

S2：将再生丝素蛋白溶液与药用炭混合，得到药用炭粉末悬浮液；加入S1中壳聚糖衍生物混合溶液，再加入乙酸，搅拌至充分溶解，得到水凝胶；

S3：向水凝胶中加入无水乙醇，置换得到有机凝胶；

S4：将有机凝胶放入超临界体系进行发泡处理；冷冻干燥后得到生物止血材料。采用超临界流体发泡技术可以制备出多孔复合止血材料，有良好的吸水率和凝血能力；能够避免有机溶剂的使用；传质性能出众，能迅速促进聚合物内部不同材料的均匀分配，多孔结构得到调节。

优选地，步骤S1中氯化钙粉末与壳聚糖衍生物的质量比为1：1.5～2。

优选地，步骤S2中乙酸与壳聚糖衍生物溶液体积比为1：8～10。

优选地，步骤S3中加入的无水乙醇具有一定的浓度梯度，为50％、75％、100％。

优选地，步骤S4中超临界体系的参数设置为：发泡压力为23～27MPa，发泡温度为38～40℃，发泡时间1.8～2.2h。

优选地，生物止血材料的孔隙率≥85％。

优选地，在步骤S2中加入薄荷脑，与药用炭的质量比为0.2～0.4：1。薄荷脑由薄荷的叶和茎中所提取，为无色针状或棱柱状结晶，具有多种生物活性如清凉止痒、消炎等。加入薄荷脑后，可增强材料的抑菌性能；且生物止血材料的吸水性能进一步提升，进而促进血液凝固，降低凝固时间，实现较好的止血效果。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

对壳聚糖进行改性后，与丝素蛋白复合形成三维网络结构，制得的止血材料具有较好地吸水性，有利于吸附血液中的成分在伤口部位推挤，促进血液凝固；加入药用炭后可提升材料的孔隙率、增加其内部表面积，进一步提升吸水性，降低血液凝固时间；同时可以促进丝素蛋白的构象转变，与壳聚糖衍生物形成三维网络状结构更加稳定；有利于对血液的吸收，实现良好的止血效果。薄荷脑的加入，可增强材料的抑菌性能；且对止血材料的吸水性能具有增强作用，加速血液凝固，进一步提升止血效果。同时本发明制备的止血材料具有良好的生物相容性，可被降解吸收。

因此，本发明提供了一种可降解吸收的生物止血材料，该生物止血材料具有较高的孔隙率，吸水性能好；止血效果好，血液凝固所需时间较短，且具有良好的抑菌性，有良好的生物相容性和可降解吸收性。

附图说明

图1为本发明试验例1中壳聚糖衍生物红外吸收光谱示意图；

图2为本发明试验例2中孔隙率测试结果对比示意图；

图3为本发明试验例2中吸水性测试结果对比示意图；

图4为本发明试验例2中全血凝固时间测试结果对比示意图；

图5为本发明试验例3中抑菌性能测试结果对比示意图；

图6为本发明试验例4中降解性能测试结果对比示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：

本发明实施例所使用的壳聚糖为市购，外观为白色粉末，脱乙酰度＞85％。

实施例1：

一种壳聚糖衍生物的制备：

将2g壳聚糖粉末溶于1％醋酸配置成1％的壳聚糖-醋酸溶液，加入2mL甜瓜醛，室温搅拌12h后，用10％NaOH调节pH至5，缓慢加入1.9g硼氢化钠后继续搅拌2h，再次用NaOH溶液调节pH至7，待沉淀析出后，过滤洗涤至中性，再用酒精反复洗涤，除去多余醛，50℃下真空干燥得壳聚糖衍生物。

再生丝素蛋白溶液的制备：

桑蚕丝在100℃的NaHCO₃(0.5wt％)水溶液中脱胶40min，2次；将脱胶丝于清水中清洗干净，真空烘箱烘干(45℃，2d)，干燥后的脱胶丝；将脱胶丝于60℃条件下溶于9.3mol/L 的LiBr水溶液当中，60min后经八层医用纱布过滤，除去未溶解的蚕丝及其它不溶杂质；以去离子水对得到的再生丝素蛋白盐溶液透析(透析袋的截流分子量12000～14000Da)3d，期间不断换水，逐渐除去溶液中的LiBr；将透析液经八层医用纱布过滤，弃去少量不溶杂质，对滤液在7000rpm的条件下离心8min，取所得的上清液即为再生丝素蛋白溶液，于4℃冰箱中保存备用。标定：所制备的再生丝素蛋白溶液通过称重法标定浓度，初始浓度为4％。

一种可降解吸收的生物止血材料的制备：

S1：称取壳聚糖衍生物溶于1％的醋酸溶液中，加入氯化钙粉末(氯化钙与壳聚糖衍生物的质量比为1：1.5)，搅拌混匀得到壳聚糖衍生物混合溶液；

S2：将质量分数为4％的再生丝素蛋白溶液与药用炭混合(再生丝素蛋白与药用炭质量比为1：0.3)，得到药用炭粉末悬浮液；加入步骤S1中壳聚糖衍生物混合溶液(壳聚糖衍生物与丝素蛋白质量比为1：1)，再加入等体积的乙酸，置于磁力加热搅拌器上搅拌过夜至充分溶解，得到均一、透明的水凝胶；

S3：向所述水凝胶中加入一定浓度梯度的无水乙醇，通过置换得到有机凝胶；采用浓度梯度为50％、75％、100％的酒精，将材料放入其中浸泡20min，充分脱水；

S4：将所述有机凝胶放入超临界体系，利用SC-CO₂发泡技术进行发泡处理；工艺条件设置：发泡压力25MPa，发泡温度40℃，发泡时间2h；冷冻干燥除去超临界体系中未除干净的酒精及可能存在的水分后，得到生物止血材料。

实施例2：

壳聚糖衍生物、再生丝素蛋白溶液的制备与实施例1相同。

一种可降解吸收的生物止血材料的制备：

与实施例1不同之处在于：步骤S2中，再生丝素蛋白与药用炭质量比为1：0.2；壳聚糖衍生物与丝素蛋白质量比为1：0.8。

实施例3：

壳聚糖衍生物、再生丝素蛋白溶液的制备与实施例1相同。

一种可降解吸收的生物止血材料的制备：

与实施例1不同之处在于：步骤S2中，再生丝素蛋白与药用炭质量比为1：0.4；壳聚糖衍生物与丝素蛋白质量比为1：0.9。

实施例4：

壳聚糖衍生物、再生丝素蛋白溶液的制备与实施例1相同。

一种可降解吸收的生物止血材料的制备：

S1：称取壳聚糖衍生物溶于1％的醋酸溶液中，加入氯化钙粉末(氯化钙与壳聚糖衍生物的质量比为1：1.5)，搅拌混匀；

S2：将质量分数为4％的再生丝素蛋白溶液与药用炭、薄荷脑混合(再生丝素蛋白、药用炭、薄荷脑质量比为1：0.3：0.1)，得到药用炭粉末悬浮液；加入S1中壳聚糖衍生物混合溶液(壳聚糖衍生物与丝素蛋白质量比为1：1)，再加入等体积的乙酸，置于磁力加热搅拌器上搅拌过夜至充分溶解，得到均一、透明的水凝胶；

对比例1：

再生丝素蛋白溶液的制备与实施例1相同。

一种可降解吸收的生物止血材料的制备：

与实施例1的不同之处在于：用壳聚糖替代壳聚糖衍生物。

对比例2：

壳聚糖衍生物的制备、再生丝素蛋白溶液的配置与实施例1相同。

一种可降解吸收的生物止血材料的制备：

与实施例1的不同之处在于：步骤S2中不加药用炭。

对比例3：

壳聚糖衍生物的制备与实施例1相同。

一种可降解吸收的生物止血材料的制备：

S1：称取壳聚糖衍生物溶于1％的醋酸溶液中，加入氯化钙粉末(氯化钙与壳聚糖衍生物的质量比为1：1.5)，接着加入药用炭(壳聚糖衍生物与药用炭质量比1：0.3)，搅拌混匀；再加入等体积的乙酸，置于磁力加热搅拌器上搅拌过夜至充分溶解，得到均一、透明的水凝胶；

S2：向所述水凝胶中加入一定浓度梯度的无水乙醇，通过置换得到有机凝胶；采用浓度梯度为50％、75％、100％的酒精，将材料放入其中浸泡20min，充分脱水；

S3：将所述有机凝胶放入超临界体系，利用SC-CO₂发泡技术进行发泡处理；工艺条件设置：发泡压力25MPa，发泡温度40℃，发泡时间2h；冷冻干燥除去超临界体系中未除干净的酒精及可能存在的水分后，得到生物止血材料。

对比例4：

再生丝素蛋白溶液的制备与实施例1相同。

一种可降解吸收的生物止血材料的制备：

S1：向4％的再生丝素蛋白溶液中，加入氯化钙粉末(氯化钙与丝素蛋白的质量比为1： 1.5)，接着加入药用炭(丝素蛋白与药用炭质量比1：0.3)，搅拌混匀；再加入等体积的乙酸，置于磁力加热搅拌器上搅拌过夜至充分溶解，得到均一、透明的水凝胶；

试验例1：

红外光谱测定(FT-IR)

将样品在恒温干燥箱中除水处理后，取少量样品与溴化钾在玛瑙研钵中混合均匀、研磨和压片后，放置在TENSOR 27型红外光谱仪上进行测试，其中扫描波数范围为4000～500cm^-1，扫描分辨率为6cm^-1，扫描次数为18。

对实施例1中制备得到的壳聚糖衍生物进行红外测试，结果如图1所示。从图中分析可知，壳聚糖的谱图中，3440cm^-1为糖类高聚物的-OH基团振动峰，2910cm^-1、2870cm^-1处的弱峰为甲基和亚甲基的伸缩峰，1656cm^-1、1590cm^-1、1319cm^-1三处分别为酰胺I谱带、-NH₂弯曲振动和C-N对称振动峰，是壳聚糖的三个典型振动峰。在壳聚糖衍生物的图谱中，在2910cm^-1和2850cm^-1附近峰强度明显增强，分别为-CH₂烷烃和-CH₃的反对称伸缩，且在2810 cm^-1～2720cm^-1间未出现醛基-CHO的伸缩峰，说明烷基杂质已完全除去，-CH₂和-CH₃的伸缩峰并不是由杂质引入，而是在壳聚糖上接枝后形成；1560cm^-1～1660cm^-1氨基混合谱带出现明显分峰，1590cm^-1处氨基吸收峰减弱，而1560cm^-1附近的N-H键吸收峰明显增强，说明氨基已经与醛基发生了反应；同时在3050cm^-1附近出现双键的C-H伸缩振动特征峰；以上表明甜瓜醛成功接枝到壳聚糖上。

试验例2：

1、孔隙率的测定

比重瓶法：将样品切成规格为0.2cm×0.2cm×0.3cm的块状，称样品质量为W_s；将对材料溶解性较好的生理盐水充满比重瓶，称其总质量为W₁；将所需测样品放入瓶中，基于材料自有的吸水效果，溶液会部分进入材料，放置2h后，再将生理盐水装满整个比重瓶，称其重量记为W₂；然后用镊子将材料取出，称量比重瓶和生理盐水的质量，记为W₃，由比重瓶法公式计算材料的孔隙率：

ε＝V_ρ/(V_s+V_ρ)＝(W₂-W₃-W_s)/(W₁-W₃)

对实施例1、实施例2、实施例3、对比例2、对比例3、对比例4的样品进行上述孔隙率的测试，结果如图2所示。从图中可以看出，实施例1制得的生物止血材料的孔隙率要明显好于对比例，表明壳聚糖衍生物与丝素蛋白复合并加入药用炭可以提升生物止血材料的孔隙率。且实施例制得样品的孔隙率均大于85％，实施例1的效果要好于实施例2～3。

2、吸水率的测定

吸水率的测定参考国际生物医疗器械相关标准GB/T0471.2-2004第三部分：

由于材料作用于伤口表面后，从伤口表面流出的液体为人体组织液，因此对材料吸水率的测定采用类似与人体的组织液成分的液体。配置主要含有钙离子和钠离子的液体，依据人体组织液的浓度，将相应重量的氯化钙和氯化钠称量出来置于容量瓶中用去离子水定容。

将规格为0.2cm×0.2cm×0.3cm的材料称量质量后，冷冻干燥，确保材料内部绝对干燥，将人体模拟液加热至类似人体温度后以材料与溶液的比例为1：50混合，材料对模拟液吸收充分后，将材料取出，称其质量，每组材料重复5次，取平均值；每次制作的样品必须经过烘箱内的循环干燥风完全干燥，干燥后质量记为m₁，加入实验测量吸水率所需的试验液后质量记为m₂，依据下列公式计算吸收率：

吸水率＝(m₂–m₁)/m₂×100％

对实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例2、对比例3、对比例4制得的样品进行上述吸水率的测试，结果如图3所示。从图中分析可得，实施例1制得样品的吸水率明显高于对比例，且实施例制得样品的吸水率均大于90％。实施例4与实施例1相比，吸水率有提升，表明薄荷脑的加入对材料吸水性能具有促进作用。

3、体外凝全血凝固时间测定

实验小白鼠经心脏取血后，将血液和抗凝剂枸橼酸钠以9：1的比例均匀混合，制成抗凝全血。将20mg样品放入试管中，37℃预温5min，加入1mL抗凝鼠血后37℃继续孵育3min，然后加入500μL CaCl₂溶液(浓度25mmol/L)后开始计时，每隔10s取出试管倾斜，观察血液是否流动，直至血液完全凝固，倾斜90℃也无血流时，记录血液凝固的时间，即为全血凝固时间BCT。

对实施例1、实施例4、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4制得的样品进行上述测试，实验结果如图4所示。从图中可以看出，实施例1制得样品的全血凝固时间明显低于对比例，且小于100s。表明利用甜瓜醛改性壳聚糖及加入药用炭可以加速血液的凝固，且壳聚糖衍生物与丝素蛋白复合材料要好于单一材料。同时，实施例4制得样品的全血凝固时间要稍低于实施例1，表明薄荷脑的加入对止血材料的凝血性能具有促进作用。

试验例3：

抑菌性测定

选取大肠杆菌作为革兰氏阳性菌代表、金黄色葡萄球菌作为革兰氏阴性菌代表，进行抑菌性试验。本实验菌种：ATCC 25923、ATCC 25922，采用纸片扩散法测试材料的抑菌性能。

首先取规格统一干净滤纸，叠放整齐，用直径6mm打孔器将进行打孔，取打孔所剩小圆纸片作为材料扩散用纸片，放入西林瓶密封打包在灭菌锅高压蒸汽灭菌。

菌种活化：于超净台中使用接种环挑取一定量的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落，涂布于琼脂培养基中，置于30℃恒温培养箱培养24h；采用浊管法配置一定细菌浓度的菌悬液：使用接种环挑取活化后菌种的菌落，置于10mL无菌水中震荡，通过与浊管对比浊度确定菌悬液浓度，配制得到0.5麦氏浓度的菌悬液。

抑菌实验：

配制复合材料原液，将灭菌后的纸片放入复合材料液，轻微震荡，使纸片完全没入材料液内，一段时间后将纸片取出，于超净工作台中风干待用。

将配制的菌悬液稀释后，用移液枪转移200μL稀释至10⁶CFU/mL的菌悬液到固体琼脂培养基，使用L型涂布器涂布均匀，之后将负载有复合材料的扩散纸片贴于培养基表面，注意保持各纸片之间的适当距离，将培养基置于30℃恒温箱培养，一段时间后观察材料周围抑菌圈出现情况，通过抑菌环直径大小来对止血材料的抑菌性进行评价。

对实施例1、实施例4制得的样品进行上述抑菌性能测试，结果如图5所示。从图中可以看出，实施例4制得样品的抑菌性能要好于实施例1，表明加入薄荷脑可以提高止血材料的抑菌性能。

试验例4：

降解性测试

用失重法测定生物止血材料的降解性。首先配制一定量的磷酸盐缓冲液(PBS)备用，称取一定质量的溶菌酶微粒，分散溶解到PBS溶液中形成符合材料降解液。称取一定质量的止血材料，置于70℃干燥箱中干燥至恒重，称重记为M₁。取统一规格西林瓶编号并称重记为M₂，将材料置于盛有一定体积降解液的西林瓶中，缓慢摇动，使得材料与降解液充分接触。将西林瓶(含降解液及材料)置于37℃恒温培养箱降解，及时更新西林瓶内降解液。并加入等体积去离子水进行洗涤，重复洗涤几次，烘干称重记为M₃。每隔一定时间取样测试记录。材料的失重率用以下公式进行计算：

失重率(％)＝[M₁-(M₃-M₂)]/M₁×100％

对实施例1、实施例4制得的样品进行上述降解性能测试，结果如图6所示。从图中可以看出，试验例1和试验例4制得样品在第一周降解较为迅速，之后降解速率略低但仍降解较快，四周后可降解90％以上，表明本发明试验例制得的生物止血材料具有较好的降解性，且降解速率适宜。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种可降解吸收的生物止血材料，包括式I所示壳聚糖衍生物、丝素蛋白和药用炭，

其中：800≤n≤1500。

2.根据权利要求1所述的一种可降解吸收的生物止血材料，其特征在于：所述壳聚糖衍生物、丝素蛋白、药用炭的质量比为1：0.8～1：0.2～0.4。

3.根据权利要求1所述的一种可降解吸收的生物止血材料，其特征在于：所述壳聚糖衍生物由甜瓜醛对壳聚糖改性获得，壳聚糖与甜瓜醛固液比为1：0.9～1.1g/mL。

4.式I所示壳聚糖衍生物在制备可降解吸收的生物止血材料中的用途。

5.权利要求1～3任一项所述的一种可降解吸收的生物止血材料的制备方法，包括：

S1：壳聚糖衍生物溶液中加入氯化钙粉末，搅拌混匀得到壳聚糖衍生物混合溶液；

S3：向所述水凝胶中加入无水乙醇，置换得到有机凝胶；

S4：将所述有机凝胶放入超临界体系进行发泡处理；冷冻干燥后得到生物止血材料。

6.根据权利要求5所述的一种可降解吸收的生物止血材料的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中氯化钙粉末与壳聚糖衍生物的质量比为1：1.5～2。

7.根据权利要求5所述的一种可降解吸收的生物止血材料的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中乙酸与壳聚糖衍生物溶液体积比为1：8～10。

8.根据权利要求5所述的一种可降解吸收的生物止血材料的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中超临界体系的参数设置为：发泡压力为23～27MPa，发泡温度为38～40℃，发泡时间1.8～2.2h。

9.根据权利要求5所述的一种可降解吸收的生物止血材料的制备方法，其特征在于：所述生物止血材料的孔隙率≥85％。