CN111690078A

CN111690078A - 双季铵化壳聚糖衍生物及其合成方法、包含其的复合海绵生物敷料与应用

Info

Publication number: CN111690078A
Application number: CN202010699305.1A
Authority: CN
Inventors: 王伟伟; 刘文帅; 黄平升; 宋会娟; 孔德领
Original assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Biomedical Engineering of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-07-20
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2040-07-20
Also published as: CN111690078B

Abstract

本发明公开了一种双季铵化壳聚糖衍生物及其合成方法、包含其的复合海绵生物敷料与应用，属于生物医用材料领域。本发明既提供一种具有良好水溶性和抗菌活性的双季铵化壳聚糖衍生物又提供一种工艺简单、成本低及综合性能好的聚丙烯酸钠/胶原蛋白/双季铵化壳聚糖复合海绵生物敷料；其中胶原蛋白、双季铵化壳聚糖和聚丙烯酸钠的重量百分比为：胶原蛋白10～80％、双季铵化壳聚糖10～80％、聚丙烯酸钠10～80％。本发明公开制备的复合海绵能够提高复合海绵的抗菌性，增强复合海绵的吸液能力与止血效果；且安全无毒，抗菌性好，吸水率和保水率高，具有良好的生物相容性，有利于伤口创面的修复，易于大量生产，具有很好的应用前景。

Description

双季铵化壳聚糖衍生物及其合成方法、包含其的复合海绵生物敷料与应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种双季铵化壳聚糖衍生物及其合成方法、包含其的复合海绵生物敷料与应用。

背景技术

随着健康中国2030战略的实施，国家大健康产业引导的经济转型，人们越来越关注有关健康方面的问题。由创伤引起的相关医学问题日益成为临床研究的热点。出血和感染是创伤引起的主要症状，其中，细菌感染导致的伤口难以愈合是重大的临床问题。抗生素的滥用导致的细菌耐药性给感染的治疗带来了极大的困难。随着材料学和工程技术的飞速发展，许多新型医用抗菌敷料应运而生，通过物理或化学的方法赋予生物医用材料一定的抗菌性，从而减少细菌的传播，最终减少细菌感染相关疾病的发生。

壳聚糖(chitosan，CS)是甲壳素N-脱乙酰基产物，也是天然存在的唯一碱性多糖，其水溶性较差。但是受其溶解性能差的限制，在应用上受到很大限制，因此对壳聚糖进行化学结构修饰，改善理化性质。季铵化修饰的壳聚糖不仅继承了壳聚糖良好的生物相容性、低毒性、可降解等优点，而且还赋予其新的性能，如良好的水溶性、更强的静电吸附性和抑菌性能，使其在医药等领域具有更广泛的应用。目前，壳聚糖的季铵化改性主要是在-NH₂上进行，而在-OH和-NH₂上同时季铵化改性鲜有报道。引入双季铵盐，不仅增强壳聚糖水溶性，还能够提高物质的抗菌活性。目前制备双季铵盐的方法是，首先采用环氧基季铵盐与壳聚糖反应得到-NH₂季铵化壳聚糖，然后再在-OH上经过多步反应引入吡啶季铵盐，得到双季铵盐壳聚糖；但是环氧基季铵盐的理化性质不稳定，极易吸湿潮解、水解而失活，因此必须现制现用，从而导致其应用受到一定限制，并且需要经过多次反应才能得到双季铵盐壳聚糖，步骤繁琐。

胶原蛋白是细胞外基质的主要结构成分，具有很好的生物相容性、低抗原性、高降解性、良好的止血性能和促进细胞生长和迁移等优良性能。壳聚糖与胶原蛋白材料因具有上述优异特点，特别适合作为创面的护理或治疗材料，在医药行业中应用广泛。现已经开发成止血材料敷料、止血海绵(壳聚糖-类人胶原蛋白海绵)等。然而，由一种材料制备的海绵，性能较为单一，不能满足目前的临床需要。比如，壳聚糖冻干海绵状材料性能呈片层状结构，虽有一定的机械强度但其柔韧性较差，及因其亲水性与抗菌活性差而限制其广泛应用。虽然胶原蛋白海绵具有疏松多孔的纤维网状结构，将胶原蛋白与壳聚糖混合制备冻干海绵可以在一定程度上提高力学强度和柔韧性；但是，海绵的吸液能力仍有待提高。

因此，开发一种安全无毒、抗菌性好，吸水率和保水率高且利于伤口创面修复的聚丙烯酸钠/胶原蛋白/双季铵化壳聚糖复合海绵生物敷料成为了本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的第一个目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种具有良好水溶性和抗菌活性的双季铵化壳聚糖衍生物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种双季铵化壳聚糖衍生物，所述双季铵化壳聚糖衍生物为N,O-二(N-甲基-N-(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-硫代烷基)-N-羟乙基-N-乙基溴化铵)-壳聚糖，即QAS-CS，结构式为：

本发明第二个目的在于提供一种如上所述的双季铵化壳聚糖衍生物的合成方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

如上所述的双季铵化壳聚糖衍生物的合成方法，包括如下步骤：

1)异氰酸酯化的壳聚糖的合成

将壳聚糖用DMF溶解，随后加入二异氰酸酯和催化剂反应后，用非极性溶剂沉淀得到中间产物；

2)季铵化壳聚糖的合成

将步骤1)得到的中间产物溶解在DMF中，并加入季铵盐和催化剂反应，随后用非极性溶剂沉淀得到季铵化壳聚糖；

3)季铵化壳聚糖的精制

将步骤2)得到的季铵化壳聚糖溶于水中，并用超纯水透析24h后，冷冻干燥，最终得到精制的所述双季铵化壳聚糖衍生物。

上述双季铵化壳聚糖衍生物的合成路线如下：

进一步地，所述季铵盐为N-甲基-N-(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-硫代烷基)-N,N-二羟乙基溴化铵，且所述壳聚糖、季铵盐和二异氰酸酯的摩尔比为1：(2.4～4):(2.4～4)。

进一步地，所述步骤1)与所述步骤2)中的反应时间均为24～48h，反应温度为40℃～70℃。

进一步地，所述步骤3)中的冷冻干燥时间为24～72h。

更进一步的，所述极性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或六甲基磷酰胺；所述非极性溶剂为乙醚、苯、甲苯、环己烷或石油醚；所述催化剂为二丁基锡二月桂酸酯、辛酸亚锡、二醋酸二丁基锡、二(十二烷基硫)二丁基锡中的任意一种，且所述催化剂的用量为反应物总质量的0.1～5％。

与现有技术中的合成思路相比，本申请避免了2,3-环氧丙基三甲基氯化铵现用现制的问题，降低季铵盐本身的毒性，同时又在壳聚糖的活性基团上同时引入季铵盐，因季铵盐具有良好的生物相容性，能够改善壳聚糖的溶解性，提高壳聚糖的抗菌活性。

本发明的第三个目的在于提供一种工艺简单，成本低，综合性能好的聚丙烯酸钠/胶原蛋白/双季铵化壳聚糖复合海绵生物敷料及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种复合海绵生物敷料，所述生物敷料是由聚丙烯酸钠、胶原蛋白及如权利要求1所述的双季铵化壳聚糖复合而成，且按照重量百分比计，所述生物敷料的组成为：胶原蛋白10～80％、双季铵化壳聚糖10～80％、其余部分为聚丙烯酸钠。

值得说明的是，复合海绵中各个组份不是简单的物理混合，三种组份的高分子链之间有多重氢键、静电相互作用，以增强海绵的力学强度和柔韧性；其中，三种组分的性质如下所述：

聚丙烯酸钠，其是一种化学合成并具有大分子链相互缠绕形成的物理交联网络结构的高分子，含有许多可以离子解离的羧酸钠基团(-COONa⁺)，以提供超强的吸水性能，进而显著提高复合海绵的吸水率和止血效果，使其适合大面积和血管丰富组织的创伤修复；

以及，本发明中使用无毒及具有良好抗菌活性与生物相容性的噁二唑季铵盐，并将其连接到壳聚糖分子上，不仅可以解决环氧基季铵盐现制现用的问题，还能提高壳聚糖的抗菌活性，并能同时保留壳聚糖本身的优良性能。

本发明选用具有天然三股螺旋结构的海洋鱼皮胶原蛋白，其与血液、陆生动物来源的胶原蛋白相比，可大大降低传播人畜共患疾病的风险。

因此，综合上述分析可知，本发明公开制备的复合海绵兼具抗菌、止血、促进组织修复的性能，是一种新型多功能伤口修复敷料。

进一步地，所述胶原蛋白为海洋鱼皮胶原蛋白，分子量为100～250KDa，既具有天然三股螺旋结构又具有典型的α1、α2、β和γ肽链，属于I型胶原。

进一步地，一种上述的复合海绵生物敷料的制备方法，将聚丙烯酸钠溶液、胶原蛋白溶液和双季铵化壳聚糖溶液混合后冷冻干燥即得到所述复合海绵生物敷料；其中，所述聚丙烯酸钠溶液的浓度为0.5～1.5％，所述胶原蛋白溶液的浓度为0.5～1.5％，所述双季铵化壳聚糖溶液的浓度为0.5～1.5％；且所述冷冻干燥温度为-60℃～-30℃，冷冻干燥时间为24～72h。

本发明第四个目的在于提供所述复合海绵生物敷料在医用器械中的应用。

与现有技术相比，本发明公开提供的双季铵化壳聚糖衍生物及其合成方法、包含其的复合海绵生物敷料与应用，优点在于：

1、本发明公开采用新型双季铵化壳聚糖(无毒，含氮杂环双季铵盐壳聚糖)为抗菌材料，具有良好的抗菌活性和广谱抗菌效果，对耐药菌同样具有良好的抗菌效果；以及采用胶原蛋白，该物质具有很好的生物相容性，引入复合海绵，对皮肤的损伤具有较好的修复作用；并将聚丙烯酸钠作为海绵组份，显著增强海绵吸水性能，可以快速吸收大量血液、募集血细胞和组织渗出液，明显提高海绵止血性能；

2、本发明公开制备的复合海绵生物敷料，制备方法简单，成本低，易于大量生产；且吸水率高，安全无毒，抗菌性良好；及壳聚糖和胶原蛋白有利于伤口创面的修复，加速愈合。

因此，综上所述，本发明公开制备的聚丙烯酸钠/胶原蛋白/双季铵化壳聚糖复合海绵可以作为一种新型安全、无毒，抗菌、止血和组织修复三方面性质都非常优良的高性能伤口敷料。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为壳聚糖和双季铵化壳聚糖的¹H NMR核磁图谱。

图2为壳聚糖和双季铵化壳聚糖的红外图谱。

图3为复合海绵的数码照片图。

图4为复合海绵表面和截面的扫描电镜照片。

图5为复合海绵2的凝血指数。

图6为复合海绵2对HUVECs细胞的毒性。

图7为各组材料对兔背部皮肤感染创伤的愈合情况。

图8为各组材料对兔背部皮肤感染创伤修复的病理学检测。

具体实施方式

下面将结合说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。

实施例1

一种双季铵化壳聚糖衍生物的合成方法，包括以下步骤：

1)异氰酸酯化的壳聚糖的合成

将1g壳聚糖原料用10mLDMF溶解，加入过量的二异氰酸酯，加入催化剂二丁基锡让月桂酸酯，摩尔比为1：2.4：0.005，40～70℃条件下反应24～48h，用乙醚等非极性溶剂沉淀得到中间产物，纯化三次；

2)双季铵化壳聚糖的合成

将上述得到的固体溶解在DMF中，加入季铵盐，并加入催化剂二丁基锡二月桂酸酯，摩尔比为1：2.4：0.005，40～70℃条件下反应24～48h，加入乙醚等非极性溶剂沉淀得到淡黄色固体季铵化壳聚糖；

3)双季铵化壳聚糖的精制

将上述得到的固体溶于水中，放入透析袋中，用超纯水透析24h，除去未反应的季铵盐，冷冻干燥干燥24～48h，得到精制的双季铵化壳聚糖。

如图1、图2所示，本发明通过红外光谱、核磁共振H谱方法证明其结构的正确性，以验证通过本发明公开的方法能够成功的合成双季铵化壳聚糖。

1)双季铵化壳聚糖合成的条件

表1

2)¹HNMR分析

原料壳聚糖和五个双季铵化壳聚糖的¹H NMR采用重水为溶剂，Bruker400的仪器上进行测试。如图1所示，化学位移3.76～3.59、3.02、1.86ppm是壳聚糖的质子峰。本发明的五个季铵化壳聚糖上均包含上述质子峰，只是化学位移值稍有变化。在化学位移4.02、3.58ppm处是乙醇胺上亚甲基(N-CH₂CH₂-O)的质子峰，化学位移3.23ppm对应N-CH₃的质子峰。另外，化学位移7.92、7.55ppm处的峰分别是苯环的质子峰。并且季铵盐部分的质子峰与现有技术文报道的季铵盐的质子峰基本符合。以上分析证明了本发明双季铵化壳聚糖结构的正确性。

3)红外光谱分析

图2所示为原料壳聚糖和双季铵化壳聚糖的红外广谱，采用KBr压片，在NicoletMAGNA-IR 550型红外光谱仪上测得。从图中能够看到3500-3300cm^-1之间的宽峰是氨基和羟基的伸缩振动吸收峰。3000-2800cm^-1是-CH₃和-CH₂-的伸缩振动峰。1625、1380cm^-1为壳聚糖的特征吸收峰，1150、1068cm^-1是壳聚糖和季铵化壳聚糖中C-O的伸缩振动峰。与壳聚糖相比，本发明中的双季铵化壳聚糖在1471、1415cm^-1出现新的吸收峰，是季铵基团的特征吸收峰。另外，本发明中754、705cm^-1是双季铵化壳聚糖中苯环的特征吸收峰。

为了进一步证明本发明的有益效果以更好地理解本发明，下面通过以下测定试验进一步阐明本发明所述双季铵化壳聚糖具有的性质及应用性能，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的其他测定实验得到的产品性质及根据上述性质进行的应用，也视为落在本发明的保护范围内。

实验例1

对双季铵化壳聚糖抗菌性能测试：

采用二倍稀释法对其抗菌活性进行了测定，对不同菌群的最低抑菌浓度如下表2所示。

表2最低抑菌浓度MIC的测定结果(ppm)

实验例2

双季铵化壳聚糖的细胞毒性

为研究本发明中双季铵化壳聚糖细胞毒性，本发明中采用CCK-8法检测了它们对3T3细胞的细胞毒性。将其溶解在H-DMEM培养基中，细胞用其溶液作用24h，然后用CCk-8溶液(20μL，5mg/mL)作用4h。然后在450nm处测定吸光度，得到对细胞的毒性。如下表3所示，为不同化合物对3T3细胞的iC50值，由此可以看出随着碳链的增长，其细胞毒性有一定程度的增加，但是其数值明显小于MIC值。因此后续实验中选用其细胞毒性最小的C2QAS-CS用于复合海绵的制备。

表3季铵化壳聚糖对3T3细胞的细胞毒性

实施例2

一种复合海绵生物敷料的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)称取一定量的PAAS粉末，溶于去离子水中，室温下磁力搅拌均匀溶解成PAAS溶液，待完全溶解后，离心脱泡，制备的质量分数为1％；

(2)称取一定量的胶原蛋白，溶于去离子水中，低温搅拌溶解成胶原蛋白溶液，待完全溶解后，离心脱泡，制备的质量分数为1％；

(3)称取一定量的季铵化壳聚糖(C2QAS-CS)，溶于去离子水中，室温下搅拌溶解，制备成季铵化壳聚糖溶液，离心脱泡，制备的质量分数为1％；

(4)将三种不同的溶液按照一定比例混合，并使溶液总体积为10mL，充分搅拌均匀，然后倒入模具中，将其放在-20℃的环境中冷冻24h，然后冷冻干燥24-48h，最终得到复合海绵(图3)，样品编号及组成见表4(其中m_PAAS:m_QAS-CS:m_COL表示复合海绵样品中3组分的质量比)，并用SEM观察其微观结构，如图4。

表4复合海绵样品的编号及组成

为了进一步证明本发明的有益效果以更好地理解本发明，下面通过以下测定试验进一步阐明本发明所述复合海绵具有的性质及应用性能，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的其他测定实验得到的产品性质及根据上述性质进行的应用，也视为落在本发明的保护范围内。

实验例3

对复合海绵吸水率和保水率的测试：

为了避免创面分泌液的过度积累和脱水，理想的伤口敷料应该能够控制水分流失比率，这就要求伤口敷料必须有一定的吸水和保水能力。较高的吸水性不仅能避免分泌液的过度积累导致伤口感染发炎，同时可以作为营养物质的传输通道给细胞提供营养，从而有利于细胞的迁移和生长，加速伤口的愈合。经测定，复合海绵2(PCQC2)的吸水率可达到3552％，保水率44.8％。

实验例4

对复合海绵的孔隙率、透气性及力学性能进行测定：

(1)众所周知，生物材料的孔隙率对细胞的黏附于增殖有很大的影响，对组织修复具有很大影响。因此，保证合适的孔隙率大小也是决定伤口敷料促进愈合的重要条件。对样品的孔隙率进行测定，PCQC2的孔隙率最大可达到98.5％。

(2)透气性是衡量伤口敷料好坏的重要指标，良好的透气性可以保证伤口表面通畅的气体交换，有利于表皮细胞的黏附、增殖、生长和迁移，同时有利于伤口渗出液的挥发，减少伤口发炎的几率。

由上述测试可知，PCQC2的吸水率和保水率最高，分别达到3552％、44.8％；并对其进行透气性测试，其测试方法参照国标YY/T 0471.2-2004，透气率可达到1584.5g·m^-2·24h^-1，可以满足伤口敷料的透气性要求。

(3)拉伸强度也是多孔海绵敷料的一个重要指标，拉伸强度的高低决定了其组织工程、伤口敷料等领域的应用广度。太低的抗拉强度不能保证伤口敷料的形貌，容易破损，不利于伤口的愈合。通过本发明制备的复合海绵的最大应力为0.128±0.021MPa，而现在商品化的明胶海绵的最大应力为0.105±0.017MPa，略大于明胶海绵的最大应力。

实验例5

对复合海绵的体外凝血进行测定：

在止血机理的研究中，血小板的黏附、聚集及形成血栓是极其重要的内容。胶原蛋白不仅能够给血小板提供多种附着位点，同时能诱导血小板颗粒内容物的释放，刺激机体产生凝血酶因子，进而生成凝血蛋白，包括血小板和红细胞，形成血栓以堵住伤口破损处。

壳聚糖的止血机理与胶原不同，它的止血机理不是依赖常规的血小板和凝血因子的基质。壳聚糖的止血机理中，最重要的是依靠与红细胞发生黏附聚集，进而使血液快速凝固达到止血的目的。

按照ShihM F的试验方法，采用全血凝血指数BCI对于体外凝血性进行评价，具体操作规程如下：

首先，用含有肝素钠的采血管收集新鲜兔血备用，将样品裁成0.5×0.5×0.5cm³规格，随后将其置于50mL离心管中并保证样品表面与管口平行，待将离心管放入37℃恒温摇床孵育5min后，将20μL的新鲜抗凝兔血滴加到样品上，随即加入20μL 0.2M的CaCl₂溶液，然后在37℃恒温摇床孵育10min后，缓缓地加入25mL的去离子水于离心管中，37℃恒温摇床振摇5min，转速50rpm/min；取出部分溶液，用紫外分光光度计在波长545nm处测吸光度，另取20μL的新鲜抗凝兔血于离心管中，最终加入25mL的去离子水稀释，在同样的波长下测其吸光度，并将其设定为参考值。

具体的BCI计算方法如下公式：

BCI＝A样品/A空白×100％

实验结果如图5所示，通过本发明公开制备的复合海绵BCI值为15％，具有很好的止血效果。

实验例6

对复合海绵的生物相容性进行测试：

(1)复合海绵的体外细胞毒性评价

细胞毒性是衡量伤口敷料生物相容性的重要指标之一。低细胞毒性的伤口敷料有利于细胞在表面黏附、增值、生长和迁移，加快伤口愈合的速度。

参照GB/T 16886《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品》中规定的浸提比1.25cm²/mL制备海绵浸提液。将海绵剪成长2.5cm，宽1cm的长方形，置于无菌EP管中，向EP管中加入2mL ECM培养基(10％血清)。在37℃恒温水浴箱中孵育24h，离心取上清液，过滤除菌。

为了研究发明中水凝胶的细胞毒性，本发明采用CCk-8法检测复合海绵对脐静脉内皮细胞(HUVEC)杀伤作用，具体操作规程如下：

将对数生长期的脐静脉内皮细胞(HUVECs)用1mL0.2％胰酶消化后，再加入等量的ECM培养基(含10％FBS)终止消化，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入新鲜的培养基轻轻吹打待细胞均匀悬浮在培养基中。调节细胞的浓度约5.0×10⁴个/mL，然后每孔100μL接种于96孔板上，孔板周围一圈设置为空白组，加PBS溶液，阴性对照组只加培养液不加细胞。在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃掉原培养液，加入100μL浸提液继续培养24h。然后吸出原培养基，每孔中加入含有10μLCCK-8试剂的新鲜培养基，放入培养箱中再孵育4h，用酶标仪于450nm波长下测吸光度，并按照如下的公式计算细胞相对增值率：

(RGR)：RGD＝OD(实验组)/OD(对照组)×100％。

结果如图6所示，复合海绵的细胞相对增殖率为90％，参考《GB/T16886.5-2003，医疗器械第5部分：体外细胞毒性实验》，由实验结果可知，水凝胶对细胞的增值率大于75％，细胞毒性为I级，具有良好的细胞相容性。

(2)复合海绵的溶血性评价

根据《GB/T 16886.4-2003/ISO 10993-4:2002，医疗器械生物学评价第4部分：与血液相互作用试验选择》中的要求，按照溶血率＝(试验组OD-阴性组OD)/(阳性组OD-阴性组OD)×100％，计算复合海绵的溶血性。

通过吸光度测定法检测材料与新鲜血液作用后红细胞释放的血红蛋白来评价材料对血液的安全性。实验结果显示，复合海绵的溶血率为1.5％，小于5％的合格判定标准，符合医疗器械使用要求，说明本发明公开制备的复合海绵具有良好的生物相容性。

实验例7

对复合海绵的抗菌活性测试

将测试样品剪成0.6cm的圆形，置于紫外灯下照射2h，充分灭菌处理。在无菌台中，将灭菌后的样品置于24孔培养板中，用生理盐水完全浸泡，然后加上100μL的菌悬液，于室温下静置培养12h；取100μL的液体在LB固体培养基上涂布均匀，培养0.5h，倒置，继续在37℃的恒温培养箱中培养24h。

试验结果显示，复合海绵对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、甲型链球菌、乙型链球菌)、革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌、)和真菌(白色念珠菌、黑曲霉)的抑菌率达到了100％，对耐药菌(MRSA)的抑菌率也达到了100％，证明本发明公开制备的复合海绵具有很好的抗菌活性。

实验例8

体内止血试验

兔耳动脉创伤模型主要特点是出血量大，血流有一定压力。一般而言，在实际活动中，对于动脉的创伤，由于出血量大，一般要采取缝扎的方法封闭出血血管，属于较大的机械外力强力止血，难免会对出血创面造成一定的损伤，还涉及到一些术后的处理，给患者带来二次痛苦，因此本发明通过兔耳动脉模型，炎症复合海绵对动脉出血的止血效果。复合海绵、阳性对照组明胶海绵以及阴性对照组纱布均能在一定时间内成功对动脉完成止血。

此外，肝脏是整个机体中血管最为密布的器官，出血后不宜采取机械性的止血方式，只能选择合适的止血敷料处理创面。主要作为体内脏器出血的模型，其止血时间和出血量如表5所示。

表5不同止血材料对兔耳动脉、肝脏的止血效果

实验例9

体内细菌感染皮肤创伤修复试验

将新西兰大白兔进行全身麻醉，背部手术区域备皮后，固定于手术台上，在背部用剪刀制造直径为1cm的开放性全层皮肤缺损的圆形创面，至筋膜深层，创建全层皮肤创伤模型。然后用MRSA感染，试验分为三组：纱布组、复合海绵组、壳聚糖生物海绵敷料；观察不同时间点的创伤愈合情况。如图7所示，实验组的创伤面积4、8、16天均明显减小，愈合率逐渐提高。实验组在同一时间点的创面愈合率优于对照组。

上述结果说明，本发明公开制备的复合海绵对MRSA具有较好的抗菌活性，并且可以促进伤口愈合。且由图7所示，16天后，实验组已经痊愈，创面上皮化，痂皮脱落，创面基本愈合，形成瘢痕组织，创面基本被毛发覆盖，证明真皮层已经基本恢复其功能。

此外，本发明取材研究皮肤的修复情况，H&E染色和Masson染色(图8)结果表明，第4天的时候，实验组创面上皮细胞基本结构胶原纤维丰富，炎性细胞较少。第8天时，实验组的上皮和结缔组织高度均匀，形成较多的成纤维细胞和上皮细胞。第16天时，实验组的创面表皮完整，胶原纤维结构完整，与正常皮肤组织基本一致。说明复合海绵具有很好抗菌效果，对MRSA具有强烈的杀伤作用，并且促进皮肤组织修复。

综上所述，采用冷冻干燥法制备的复合海绵具有明显的抗菌、止血、促进组织修复的疗效。相比于传统敷料，其具有较高的比表面积、高孔隙率、高通透性等特性，且具有较好的生物相容性，是一种综合性能良好的复合海绵生物敷料。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种双季铵化壳聚糖衍生物，其特征在于，所述双季铵化壳聚糖衍生物为N,O-二(N-甲基-N-(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-硫代烷基)-N-羟乙基-N-乙基溴化铵)-壳聚糖，即QAS-CS，结构式为：

2.一种如权利要求1所述的双季铵化壳聚糖衍生物的合成方法，其特征在于，采用N-甲基-N-(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-硫代烷基)-N,N-二羟乙基溴化铵和壳聚糖为原料，合成制备季铵化壳聚糖衍生物；所述合成方法具体包括如下步骤：

1)异氰酸酯化壳聚糖的合成

将壳聚糖用极性溶剂溶解，随后加入二异氰酸酯和催化剂反应后，用非极性溶剂沉淀得到中间产物；

2)季铵化壳聚糖的合成

将步骤1)得到的中间产物溶解在极性溶剂中，并加入季铵盐和催化剂反应，随后用非极性溶剂沉淀得到季铵化壳聚糖；

3)季铵化壳聚糖的精制

3.根据权利要求2所述的一种双季铵化壳聚糖的合成方法，其特征在于，所述季铵盐为N-甲基-N-(5-苯基-1,3,4-噁二唑-2-硫代烷基)-N,N-二羟乙基溴化铵，且所述壳聚糖、季铵盐和二异氰酸酯的摩尔比为1：(2.4～4):(2.4～4)。

4.根据权利要求2所述的一种双季铵化壳聚糖的合成方法，其特征在于，所述步骤1)与所述步骤2)中的反应时间均为24～48h，反应温度为40℃～70℃。

5.根据权利要求2所述的一种双季铵化壳聚糖的合成方法，其特征在于，所述步骤3)中的冷冻干燥时间为24～72h。

6.根据权利要求2～5任一所述的一种双季铵化壳聚糖的合成方法，其特征在于，所述极性溶剂为N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或六甲基磷酰胺；所述非极性溶剂为乙醚、苯、甲苯、环己烷或石油醚；所述催化剂为二丁基锡二月桂酸酯、辛酸亚锡、二醋酸二丁基锡、二(十二烷基硫)二丁基锡中的任意一种，且所述催化剂的用量为反应物总质量的0.1～5％。

7.一种复合海绵生物敷料，其特征在于，所述生物敷料是由聚丙烯酸钠、胶原蛋白及如权利要求1所述的双季铵化壳聚糖复合而成，且按照重量百分比计，所述生物敷料的组成为：胶原蛋白10～80％、双季铵化壳聚糖10～80％、其余部分为聚丙烯酸钠。

8.根据权利要求7所述一种复合海绵生物敷料，其特征在于，所述胶原蛋白为海洋鱼皮胶原蛋白，分子量为100～250KDa，既具有天然三股螺旋结构又具有典型的α1、α2、β和γ肽链，属于I型胶原。

9.一种如权利要求7所述的复合海绵生物敷料的制备方法，其特征在于，将聚丙烯酸钠溶液、胶原蛋白溶液和双季铵化壳聚糖溶液混合后冷冻干燥即得到所述复合海绵生物敷料；其中，所述聚丙烯酸钠溶液的浓度为0.5～1.5％，所述胶原蛋白溶液的浓度为0.5～1.5％，所述双季铵化壳聚糖溶液的浓度为0.5～1.5％；且所述冷冻干燥温度为-60℃～-30℃，冷冻干燥时间为24～72h。

10.一种如权利要求7或8所述的复合海绵生物敷料在医用器械中的应用。