CN113058067B - 一种卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料及其制备方法 - Google Patents
一种卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料及其制备方法，属于医疗技术领域。本发明采用黄原胶与壳聚糖这两种生物高分子材料相结合，首先通过卤胺化合物前驱体3‑(2′‑氯乙基)‑5,5‑二甲基海因(CEDMH)与黄原胶(XG)的接枝反应并配合有机氯化制备得到抗菌剂XG/CEDMH‑Cl，其中黄原胶和3‑(2′‑氯乙基)‑5,5‑二甲基海因(CEDMH)的摩尔比为1：1‑6；再将壳聚糖(CS)与XG/CEDMH‑Cl复配制备聚电解质络合物同时添加甘油，产物经干燥即得XG/CEDMH‑Cl&CS复合抗菌敷料，其中壳聚糖和XG/CEDMH‑Cl的质量比为1‑5：1。本发明得到的复合抗菌敷料具有良好的抗菌效果，且生物相容性良好。
Description
技术领域
本发明涉及一种卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料及其制备方法，属于医疗技术领域。
背景技术
伤口是患者的沉重负担，它所带来的痛苦是困扰人类最古老的健康问题，由于组织液的外渗与积聚，伤口很容易被细菌感染，这极大地阻碍了皮肤的愈合进程，延长了恢复所需时间。日常生活中出现的轻微型急性伤口，如小割伤和擦伤通常容易被人们忽视。事实上，由于细菌、真菌等微生物的广泛存在，它们可以迅速生长并在伤口上形成菌落，进一步渗透到更深的皮肤组织层，造成内部感染。因此这些急性伤口存在着转化为慢性伤口的风险。据报道，仅在美国每年就有1100万人遭受急性伤口的折磨，其中约30万人因伤口感染问题需住院治疗。因此，受伤后需要立即使用合适的敷料覆盖伤口以防止进一步的污染或创伤。
由于创面敷料对于生物相容性的高要求，一般通过交联(物理/化学)或物理共混将几种生物型聚合物进行结合。考虑到交联剂残留物可能会带来的毒性风险，许多学者选择将带不同电荷的两种生物高分子材料进行复合。由于静电吸引作用，以及大分子链之间氢键的生成，它们会形成的凝胶状的聚电解质络合物(PEC)，且产物具有良好的溶胀性能，可作为药物释放的载体，用于患处给药。另外，随着“湿性伤口愈合理论”的优势被越来越多的专家与学者所证实，避免使用干性敷料治疗伤口将在很大程度上减轻患者的疼痛感。
发明内容
[技术问题]
目前，抗菌敷料存在以下问题：(1)抗菌效率低，抗菌敷料所用抗菌剂一般为纳米银，然而纳米银需在较长时间内达到抗菌效果，且抗菌效率低，一般纳米银抗菌率为60-80％；(2)抗菌剂易溶出，采用物理沉积、表面吸附等方法制备的抗菌性敷料，抗菌剂易溶出，存在安全隐患。
[技术方案]
为了解决上述至少一个问题，本发明采用黄原胶与壳聚糖这两种生物高分子材料相结合，首先通过卤胺化合物前驱体3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因(CEDMH)与黄原胶(XG)的接枝反应并配合有机氯化制备得到抗菌剂XG/CEDMH-Cl；再将壳聚糖(CS)与XG/CEDMH-Cl复配制备聚电解质络合物同时添加甘油，产物经干燥即得XG/CEDMH-Cl&CS复合抗菌敷料。本发明得到的复合抗菌敷料具有良好的抗菌效果，且生物相容性良好。
本发明的第一个目的是提供一种制备卤胺改性黄原胶抗菌剂的方法，包括如下步骤：
(1)在氢氧化钠的乙醇溶液中加入5,5-二甲基海因(DMH)，进行反应；之后再加入1-溴-2-氯乙烷(BCE)，继续反应；反应结束后除去乙醇、洗涤、分层得到上层溶液，之后去除乙酸乙酯，干燥得到3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因(CEDMH)；
(2)将黄原胶溶液进行碱化，得到碱化的黄原胶溶液；之后将步骤(1)得到的3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因(CEDMH)溶解为溶液，加入碱化的黄原胶(XG)溶液中，进行反应；待反应结束后，干燥、洗涤得到卤胺改性黄原胶(XG/CEDMH)；
(3)将步骤(2)得到的卤胺改性黄原胶(XG/CEDMH)进行氯化处理，得到所述的卤胺改性黄原胶抗菌剂。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的氢氧化钠的乙醇溶液是将NaOH(0.05-0.15mol)加入100mL无水乙醇，混合均匀得到，其中NaOH的浓度为0.05-0.15mol；进一步优选为：将3.99g NaOH(0.1mol)加入100mL无水乙醇，混合均匀得到。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中NaOH、5,5-二甲基海因(DMH)、1-溴-2-氯乙烷(BCE)的摩尔比为1.1-1.3：1：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中在氢氧化钠的乙醇溶液中加入5,5-二甲基海因(DMH)进行反应的条件为90-95℃下反应5-15min；进一步优选为：90℃下反应10min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中加入1-溴-2-氯乙烷(BCE)之前需要将反应温度调整至80-85℃。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中加入1-溴-2-氯乙烷(BCE)之后在80-85℃下反应7-9h；进一步优选为在85℃下反应8h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中除去乙醇是通过80℃旋蒸去除；洗涤是采用乙酸乙酯/水(4/1，v/v)洗涤；分层是静置分层；去除乙酸乙酯是通过80℃旋蒸去除；干燥是45℃真空干燥箱干燥24h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的黄原胶溶液是以水/乙醇溶液(1/1，v/v)为溶剂，配制得到黄原胶(XG)溶液，浓度为0.2-0.3％(w/v)；进一步优选为浓度为0.25％(w/v)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的碱化是在黄原胶溶液中加入氢氧化钠溶液，在室温(20-30℃)下碱化15-25min，其中氢氧化钠溶液的浓度为0.1-1％(w/v)，黄原胶溶液和氢氧化钠溶液的体积比为8-12：1；进一步优选为：碱化时间20min，氢氧化钠的浓度为0.5％，黄原胶溶液和氢氧化钠溶液的体积比为10：1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中黄原胶和3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因(CEDMH)的摩尔比为1：1-6。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中溶解3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因(CEDMH)的溶剂是乙醇，溶解即可。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因(CEDMH)的溶液需要缓慢滴加至碱化的黄原胶(XG)溶液中进行反应；反应条件为室温(20-30℃)下反应5-7h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的干燥是45℃烘箱干燥，洗涤是无水乙醇洗涤。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述的氯化处理是在含有步骤(2)得到的卤胺改性黄原胶(XG/CEDMH)的容器中加入氯化液，密封浸泡，分离、洗涤、抽滤、干燥，得到卤胺改性黄原胶抗菌剂；其中氯化液包括次氯酸叔丁基酯，密封浸泡的时间为2h，分离是采用抽滤分离，洗涤是采用乙醇浸泡洗涤2h，干燥是在45℃下干燥30min。
本发明的第二个目的是本发明所述的方法制备得到的卤胺改性黄原胶抗菌剂。
本发明的第三个目的是提供一种制备卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料的方法，包括如下步骤：
将本发明得到的卤胺改性黄原胶抗菌剂配制为溶液，之后加入甘油混合均匀；再加入壳聚糖(CS)溶液混合均匀，成型、干燥，得到所述的卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料。
在本发明的一种实施方式中，所述的壳聚糖和卤胺改性黄原胶抗菌剂的质量比为1-5：1。
在本发明的一种实施方式中，所述的卤胺改性黄原胶抗菌剂溶液的溶剂为水，卤胺改性黄原胶抗菌剂和水的质量比为0.1-0.2：30，进一步优选为0.15：30。
在本发明的一种实施方式中，所述的甘油和水的体积比为1-3：30，进一步优选为2：30。
在本发明的一种实施方式中，所述的壳聚糖溶液的溶剂为醋酸水溶液，醋酸水溶液的质量浓度为0.5-1.5％，进一步优选为1％。
在本发明的一种实施方式中，所述的壳聚糖溶液的质量浓度为0.5-2.5％。
在本发明的一种实施方式中，所述的壳聚糖溶液和水的体积比为1：5。
在本发明的一种实施方式中，壳聚糖溶液是加入到高速搅拌的卤胺改性黄原胶抗菌剂溶液中。
在本发明的一种实施方式中，所述的成型是成膜，具体是将溶液倒入模具成膜即可。
本发明的第四个目的是本发明所述的方法制备得到的卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料。
本发明的第五个目的是一种包含本发明所述的卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料的创可贴。
本发明的第六个目的是本发明所述的卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料在处理日常浅表皮伤口中的应用。
[有益效果]
(1)本发明制备得到的XG/CEDMH-Cl氯含量在0.06％以上，可以达到0.14％。
(2)本发明制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS复合膜BCI值达到23以上，具备作为止血敷料的应用潜力；水蒸气透过率在156g/m2·h、溶胀率在100～900％之间，用于作为伤口敷料；具有良好的抗菌性能，在与细菌接触5min后即杀灭66.31％(0.47log)的金黄色葡萄球菌和56.10％(0.35log)的大肠杆菌；且30min内分别杀灭了98.57％(1.84log)的金黄色葡萄球菌和94.95％(1.29log)的大肠杆菌；对红细胞的溶血率均低于2％，说不发生溶血现象；不具有细胞毒性，有望作为创面敷料。
(3)本发明制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS复合膜不存在抗菌剂溶出现象，安全性好。
附图说明
图1为实施例1中制备卤胺改性黄原胶抗菌剂的方法流程图。
图2为实施例1中得到的产物表征，其中A为XG/CEDMH的红外表征；B为XG/CEDMH-Cl进行碘/淀粉显色反应结果。
图3为实施例3中制备卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料的方法流程图。
图4为实施例3、4制备得到的不同XG/CEDMH-Cl和壳聚糖的质量比的XG/CEDMH-Cl&CS敷料混合物和对照例1的混合物的状态；其中A为1：0；B为5：1；C为4：1；D为3：1；E为2：1；F为1：1。
图5为实施例3、4制备得到的不同XG/CEDMH-Cl和壳聚糖的质量比的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜和对照例1的膜的氯含量测试结果。
图6为实施例3、4制备得到的不同XG/CEDMH-Cl和壳聚糖的质量比的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜和对照例1的膜的BCI值测试结果；其中A为1：0；B为5：1；C为4：1；D为3：1；E为2：1；F为1：1。
图7为实施例3制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜和对照例1、2的膜的水蒸气透过率测试结果。
图8为实施例3制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜的溶胀性能。
图9为实施例3制备的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜和对照例2得到的壳聚糖膜的抗菌性能测试结果；其中A为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌与CS样品和XG/CEDMH-Cl&CS样品接触30min后再接种到琼脂盘上各细菌的生长情况(a1和a3分别代表CS膜与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接触后，XG/CEDMH-Cl&CS与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌接触后)；B为CS和XG/CEDMH-Cl&CS进行了抑菌圈测试结果(a1和a3分别代表CS样品帖附在涂布了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的琼脂盘中，a2和a4分别代表XG/CEDMH-Cl&CS帖附在涂布了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的琼脂盘中)。
图10为实施例3制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS敷料混合物、黄原胶、壳聚糖进行溶血性能测试结果。
图11为体外细胞毒性的测试结果；其中A为经不同样品提取液培养后NIH-3T3成纤维细胞的细胞存活率；B为经样品提取液培养24h(上)，48h(下)后的细胞形态及细胞活力；(a)为CS，(b)为XG/CEDMH-Cl，(c)为XG/CEDMH-Cl&CS。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
测试方法：
1、氯含量的测试：
采用碘量/硫代硫酸盐滴定法测定了XG/CEDMH-Cl&CS复合敷料(膜)的氯含量。取不同膜样品(尺寸：2.54cm×2.54cm)放入20mL的去离子水中，加入0.3g碘化钾和2mL质量分数为1％的淀粉溶液，室温搅拌30min后溶液显深蓝色，用硫代硫酸钠溶液滴定，直至蓝色消失。用以下公式(1)计算了所制备的膜的含氯量(膜表面的氯的含量)：
其中，N为滴定所用的硫代硫酸钠溶液的当量浓度(equiv/L)，V为消耗硫代硫酸钠溶液的体积(mL)，S为膜样品的面积(cm2)，每种样品测三次，取平均值。
2、体外全血凝血指数的测定
将新鲜的兔血与抗凝枸橼酸葡萄糖(ACD)以体积比为9:1复配得抗凝处理的血液。准备XG/CEDMH-Cl&CS样品(1cm×1cm)放入玻璃培养皿中，并放置于37℃恒温箱预处理5min。向每个样品上滴加100μL经抗凝处理的全血(ACD)后立即加入0.2M的氯化钙溶液(10μL)，然后放置于37℃的环境中5min。再取25mL的去离子水小心地沿边缘加入到装样品的培养皿中，接着在37℃的摇床上(设置为30rpm)摇晃10分钟。用去离子水溶血，以收集未粘附在样品上的红细胞。用紫外分光光度计测定各样品用去离子水处理后所收集的去离子水中血红蛋白在540nm处的吸光度(记为样品的As)。用ACD血液(100μL)在25mL去离子水中于37℃摇晃10分钟作为阴性对照(空白样Ab)。按以下公式(2)计算样品的血液凝固指数(BCI)：
其中BCI为样品的凝血指数，Ab为空白样品在540nm处的吸光度，As为试验样品在540nm处的吸光度。
3、力学性能测试：
根据ASTM D3039标准测定了XG、CS和XG/CEDMH-Cl&CS的力学性能。通过拉伸试验测定了膜的拉伸强度和在断裂点的伸长率。将实验样品裁剪成一个长方形(30mm×100mm)，并以5mm/min的拉伸速度进行测试。每种样品测试三次，取平均值，拉伸强度和断裂伸长率的计算方法如下：
Nbreak和Asample分别为使膜拉断时所需的力(N)和试样截面面积(mm2)。Lbreak为膜断裂点长度增加量(mm)，Loriginal为原始长度。
4、水蒸气透过率的测试
按照ASTM(2010版标准)方法测定了几种膜(XG，CS和XG/CEDMH-Cl&CS)的水蒸气透过率。取上口直径30mm的小烧杯，烧杯里装有30mL蒸馏水，将膜裁剪成直径稍大于30mm的圆形并盖住烧杯口，用橡皮圈固定密封好。然后将试管放入30℃、相对湿度(RH)为50±5％的培养箱中，每24h称重一次，将水的重量损失记录为时间的函数。用该函数中线性回归方程的斜率除以小烧杯的口面积来计算水蒸气透过率，计算公式如下：
其中：S为线性回归方程的斜率(g/h)，A为小烧杯的口面积(m2)。
5、溶胀情况
采用增重法测定了XG/CEDMH-Cl&CS在磷酸盐缓冲液(PBS)中的溶胀情况。取样品于45℃烘箱中干燥1h后称量。然后将样品别浸泡在PBS中，实验环境维持在37℃，在预定的时间点取出溶胀的样品，滤纸吸去表面多余液体后立即称重(Ws)。样品分别测定三次，用公式(6)计算。
其中，Wd表示样品的干重，Wt代表溶胀后一定时间后的样品质量。
6、抗菌性能测试
用改进的AATCC 100-2004标准对XG/CEDMH-Cl&CS复合膜进行抗菌效果测试，以XG和CS膜作为对照组。采用的细菌为革兰氏阴性金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和革兰氏阳性大肠杆菌(ATCC 8099)，用移液枪吸取25μL的细菌悬浮液添加到膜样品(2.54cm×2.54cm)中心，再盖上另一片样品，为使样品与细菌充分接触，将灭菌后的砝码放置在上面。当接触时间达到5，10，30min后，将样品转移至含有5mL经高温灭菌后的硫代硫酸钠溶液的离心管中，以淬灭样品中的活性氯。涡旋2min后，将离心管中溶液取适量，依次用磷酸缓冲溶液稀释10，100，1000倍，并分别取100uL接种至琼脂盘上。再转移至37℃培养箱，孵育24h后，记录菌落数并计算杀菌结果。
此外，采用琼脂扩散法测试了XG/CEDMH-Cl&CS膜的抑菌圈。将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的悬浮液均稀释至约106CFU/mL，分别取100μL用涂布棒均匀分布到琼脂盘表面。再将直径为1.5cm的圆形薄膜贴附在琼脂盘中心，转移至培养箱37℃孵育24h，记录抑菌圈情况。
7、溶血性能测试
取5mL经抗凝处理的兔血加入到含10mL PBS溶液的离心管中，以5000rpm离心10min并重复操作三次，用于收集红细胞。再将所得红细胞用50mL PBS溶液配制成悬浮液。待测样品先用PBS溶液配成一定浓度的溶液，放置在37℃环境中24h。然后取2mL红细胞悬浮液添加到8mL的样品/PBS溶液中。所有样品均放置在37℃摇床上以120rpm摇晃1h，再将混合溶液于1500rpm离心10min，取上部液体用紫外分光光度计分别检测其在545nm处的吸光度。另外取2mL红细胞悬浮液添加到8mL的去离子水和PBS溶液中，分别作为阳性(pc)和阴性(nc)对照组。每组样品做三次平行实验，结果取平均值，并用以下公式计算溶血率：
8、体外细胞毒性实验
细胞用含10％胎牛血清的DMEM(高葡萄糖)培养基进行培养，样品浸泡在培养基中24h以制备提取液。细胞的接种密度为5.0×103个细胞/孔，在含5％CO2，温度为37℃的培养箱中培养24h。实验组将DMEM培养基替换为样品提取液(100μL/well)，对照组更换培养基。继续培养24、48h后采用MTT法测定细胞存活率。在预定的时间点每孔加入10μL MTT溶液，37℃继续培养4h。吸出经MTT的孵育后的培养基，加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，放置在摇板上摇动15-20min，以溶解紫色甲赞晶体。用分光光度计测定溶液在540nm处的OD值(ODsample)。以DMEM培养基培养细胞的OD值作为对照(ODcontrol)，按下式计算细胞存活率：
实施例1
一种制备卤胺改性黄原胶抗菌剂的方法，包括如下步骤：
(1)称取3.99g NaOH(0.1mol)于含100mL乙醇溶液的圆底烧瓶中，加入12.81g 5,5-二甲基海因(DMH，0.1mol)，于90℃回流10min；再将温度调节至85℃，加入14.34g 1-溴-2-氯乙烷(BCE，0.1mol，)继续冷凝回流反应8h，可见溶液中出现白色颗粒(钠盐)，80℃旋蒸除乙醇后，再用乙酸乙酯/水(4/1，v/v)洗涤，将混合溶液转移至分液漏斗，静置10min待其分层，分液保留上层溶液，于60℃旋蒸除去乙酸乙酯。将所得产物趁热倒入烧杯中(可以观察到产物随着温度降低溶解度降低析出)，将烧杯放入45℃真空干燥箱干燥24h后保存备用。产物3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因(CEDMH)为白色固体，产率为80％。
(2)以水/乙醇溶液(1/1，v/v)为溶剂，配制200mL 0.25％(w/v)的黄原胶(XG)溶液；之后在搅拌条件下缓慢加入20mL NaOH(0.5％，w/v)溶液，于室温碱化20min；碱化结束后转移至85℃油浴锅中继续搅拌；以适量乙醇(溶解即可)为溶剂将步骤(1)得到的卤胺前驱体CEDMH完全溶解并缓慢加入上述溶液，其中XG与CEDMH摩尔比为1:5；滴加完毕后继续冷凝回流反应6h，反应产物呈溶液状，冷却后呈果冻状。将产物置于45℃烘箱，待其完全干燥后，用无水乙醇浸泡洗涤、抽滤数次，烘干即得XG/CEDMH。保存备用。
(3)对步骤(2)得到的XG/CEDMH进行氯化处理，在通风橱中向装有XG/CEDMH的小烧杯中加入适量次氯酸叔丁基酯(氯化液)，密封浸泡2h后将粉末抽滤分离出来，再用大量乙醇浸泡洗涤2h(除去次氯酸叔丁基酯)、抽滤并在45℃烘箱干燥30min，即得XG/CEDMH-Cl。
制备示意图如图1所示。
将步骤(2)得到的XG/CEDMH进行红外表征，结果如图2中A，从图2中A可以看出：XG/CEDMH在1570cm-1和1047cm-1处分别出现了新的吸收峰，分别归属于-NH-面内弯曲振动与C-N键特征峰，由于产物已经乙醇充分洗涤，且黄原胶分子中不含这两种基团，因此可验证产物XG/CEDMH的成功制备。即通过黄原胶与卤胺前驱体CEDMH之间的取代反应，CEDMH接枝到黄原胶上。
将步骤(3)得到的XG/CEDMH-Cl进行碘/淀粉显色反应，结果如图2中B，从图2中B可以看出：溶液显深蓝色，进一步验证了XG/CEDMH-Cl的成功制备
实施例2 XG与CEDMH摩尔比优化
调整实施例1中XG与CEDMH摩尔比为1：1、1：2、1：3、1：4、1：6，其他和实施例1保持一致，得到XG/CEDMH-Cl。
将得到的XG/CEDMH-Cl进行性能测试，测试结果如表1：
从表1可以看出：当XG与CEDMH摩尔比为1:1时产物XG/CEDMH-Cl氯含量较低，约为0.06％。增加CEDMH的用量可逐渐提高其对XG的接枝率，体现为所得XG/CEDMH-Cl氯含量逐渐增加，但当XG与CEDMH摩尔比超过1:5时，氯含量增幅不大。因此，选择XG与CEDMH摩尔比为1:5的方案制备XG/CEDMH-Cl。
表1实施例1和2的测试结果
实施例3
一种制备卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料的方法，流程如图3，包括如下步骤：
将0.15g实施例1得到XG/CEDMH-Cl加入30mL水中溶解；之后加入2mL甘油继续搅拌；以1％CH3COOH水溶液为溶剂配制浓度为0.5％的壳聚糖(CS)溶液(0.03g壳聚糖配制6mL壳聚糖溶液)；使用注射器加蓝色针头(型号22G)将6mL CS溶液注入高速搅拌的XG/CEDMH-Cl溶液中，混合均匀，之后将混合物倒入培养皿中，在37℃下干燥，得到卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料(XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜)。
实施例4
调整实施例3中“XG/CEDMH-Cl和壳聚糖的质量比2：1”为1：1、3：1、4：1、5：1，其他和实施例3保持一致，得到卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料(XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜)。
对照例1
将0.15g实施例1得到XG/CEDMH-Cl加入30mL水中溶解，制备得到XG/CEDMH-Cl的水溶液，之后倒入培养皿中，在37℃下干燥，得到膜；其中XG/CEDMH-Cl和壳聚糖的质量比为1：0。
将实施例3、4得到的卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料(XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜)和对照例1得到的膜进行性能测试，测试结果如下：
图4为实施例3、4制备得到的不同XG/CEDMH-Cl和壳聚糖的质量比的XG/CEDMH-Cl&CS敷料混合物和对照例1的混合物的状态；其中A为1：0；B为5：1；C为4：1；D为3：1；E为2：1；F为1：1。从图4可以看出：当XG/CEDMH-Cl与CS的质量比为5：1时，可见复合物中出现白色絮状物，两组分均匀性差；当提高CS的质量占比后，XG/CEDMH-Cl&CS复合物状态趋向均匀，且有大量凝胶或凝珠状产物，如图4中B-E。当XG/CEDMH-Cl与CS的质量比为1：1时，由于壳聚糖与黄原胶间的静电作用与氢键作用较强，复合物中出现白色纤维状物质，且易凝固化，不利于转移至培养皿中；此外图4中C、D复合物中气泡较多。
图5为氯含量测试结果。从图5可以看出：随着XG/CEDMH-Cl与CS的质量比的变化，即复合敷料中壳聚糖的质量占比逐渐增加，其氯含量缓慢下降，归因于复合敷料中XG/CEDMH-Cl的相对含量有所减少。
根据图4和图5，选择XG/CEDMH-Cl和壳聚糖的质量比为2：1。
图6为BCI值测试结果。敷料的BCI值越低，其止血活性越高。从图6可以看出：当XG/CEDMH-Cl与CS的质量比发生变化，所得XG/CEDMH-Cl&CS复合膜的BCI值随之变化；随着CS的质量占比由1/6增大到1/2，XG/CEDMH-Cl&CS复合膜的BCI值由76下降到19。XG/CEDMH-Cl与CS以质量比为2：1所制备的敷料的BCI值为23，显示其具备作为止血敷料的应用潜力。
对照例2
省略实施例3中的XG/CEDMH-Cl，直接将壳聚糖溶液倒入培养皿，干燥形成膜，即：壳聚糖膜(CS膜)。
表2为实施例3制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜和对照例1、2的膜的力学性能测试结果，从表2可以看出：XG/CEDMH-Cl&CS的厚度较XG/CEDMH-Cl与CS明显增加；且拉伸强力与断裂伸长率均高于XG/CEDMH-Cl膜，但略低于CS膜。表明纯XG/CEDMH-Cl膜力学性能欠佳，但通过与CS复合可得到提高。CS的掺入减少了复合膜中XG/CEDMH-Cl的含量，且两组分之间存在离子键作用，故力学性能略有增强。
表2不同膜的力学性能测试结果
图7为实施例3制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜和对照例1、2的膜的水蒸气透过率测试结果。从图7可以看出：CS和XG/CEDMH-Cl两种膜的水蒸气透过率(WVTR)分别为103g/m2·h和108g/m2·h，主要归因于CS和XG良好的亲水性；而XG/CEDMH-Cl&CS膜的WVTR值进一步提高(156g/m2·h)，这是因为聚合物结构中大量氢键的形成增加了膜的亲水性，从而提高了膜的水蒸气透过率。WVTR值越高，伤口干燥速度越快。虽然创面敷料的WVTR没有一个确切的理想值，但这个值不宜太高，因为它会导致创面干燥。另一方面，如果WVTR值过低，则会造成渗出物的积累，可能导致愈合过程的中断，增加细菌生长的风险12。据目前市面上敷料的WVTR在33～208g/m2·h之间，所以XG/CEDMH-Cl&CS敷料WVTR值适中，适用于作为伤口敷料。
图8为实施例3制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜的溶胀性能。伤口敷料应具备适当的溶胀特性使其能吸收伤口表面的液体和渗出物，据报道理想的伤口敷料应具有100～900％的溶胀能力。从图8可以看出：XG/CEDMH-Cl&CS复合膜浸泡在PBS溶液中快速吸水溶胀，5min溶胀率即达482％；且随着时间的推移，溶胀率进一步增加；当浸泡30min后，样品的溶胀率约550％，接近最大溶胀率。即：XG/CEDMH-Cl&CS复合膜溶胀率在100～900％之间，符合伤口敷料应用需求。
表3为实施例3制备的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜和对照例2得到的壳聚糖膜的抗菌性能测试结果。抗菌性能测试所选细菌分别为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，每组样品接种的细菌浓度分别为4.75×106(6.67log)CFU/样品和9.50×105(5.97log)CFU/样品。从表3可以看出：CS膜具有一定的抗菌性能，在30min内杀灭了48.02％(0.28log)的金黄色葡萄球菌和27.04％(0.13log)的大肠杆菌；XG/CEDMH-Cl&CS敷料的抗菌效果显著提高，在与细菌接触5min后即杀灭66.31％(0.47log)的金黄色葡萄球菌和56.10％(0.35log)的大肠杆菌；且30min内分别杀灭了98.57％(1.84log)的金黄色葡萄球菌和94.95％(1.29log)的大肠杆菌，具有良好的抗菌效果。
表3.CS与XG/CEDMH-Cl&CS膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌测试结果
a接种细菌浓度:4.75×106(6.67log)CFU/样品；b接种细菌浓度:9.50×105(5.97log)CFU/样品。
图9为实施例3制备的XG/CEDMH-Cl&CS敷料膜和对照例2得到的壳聚糖膜的抗菌性能测试结果。从图9可以看出：XG/CEDMH-Cl&CS敷料对两种细菌良好抗菌效果；XG/CEDMH-Cl&CS样品在两种细菌盘中都没有出现抑菌圈，表明XG/CEDMH-Cl&CS中的抗菌活性成分为非溶出型，卤胺化合物与基材之间是以化学键方式结合。
血液相容性是评价新材料生物相容性的重要指标之一，可以通过溶血测试来评估样品的血液相容性。根据ASTM F756-00标准，样品溶血率超过5％、在2～5％范围内以及小于2％分别被认定为会产生溶血现象、轻微溶血和无溶血现象。将实施例3制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS敷料混合物、黄原胶、壳聚糖进行溶血性能测试，测试结果如图10，从图10可以看出：当样品/PBS溶液浓度达50ppm时，CS、XG和XG/CEDMH-Cl&CS三种样品对红细胞的溶血率均低于2％，说明它们不发生溶血现象；此外对于XG/CEDMH-Cl样品，其溶血率随着样品/PBS溶液浓度的增加而减小。
根据国际标准ISO10993-5，选用NIH-3T3成纤细胞，用不同的样品提取液孵育细胞，并以用培养基培养的细胞作为对照组评估样品的间接细胞毒性。将实施例3制备得到的XG/CEDMH-Cl&CS敷料混合物和对照例1的XG/CEDMH-Cl、对照例2的壳聚糖溶液的体外毒性的测试，结果如图11，从图11可以看出：细胞经CS溶液和XG/CEDMH-Cl&CS样品提取液培养24h后细胞存活率与空白对照组(水溶液)无明显差异，且细胞存活率在培养48h后分别增加至128％和129％左右，表明它们均具有优异的细胞相容性，且不会影响细胞的正常增殖活动；对于XG/CEDMH-Cl，经24h的培养后，细胞存活率为78％，48h后升高至91％；以上结果表明通过将CS与XG/CEDMH-Cl组分结合，可使最终产物的细胞相容性明显提高。进一步使用光学显微镜分别对培养24h和48h后各组的细胞形态进行拍摄与观察，可见各组48h后细胞数量较24h均明显提高，且细胞形态大多数也保持良好的纺锤形；此外，XG/CEDMH-Cl&CS的细胞数量相对于XG/CEDMH-Cl和CS组更多，这与MTT法测试结果一致。综合来看，所制XG/CEDMH-Cl&CS样品不具有细胞毒性，有望作为创面敷料。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种制备卤胺改性黄原胶抗菌剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在氢氧化钠的乙醇溶液中加入5,5-二甲基海因，进行反应；之后再加入1-溴-2-氯乙烷，继续反应；反应结束后除去乙醇、洗涤、分层得到上层溶液，之后去除乙酸乙酯，干燥得到3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因；
(2)将黄原胶溶液进行碱化，得到碱化的黄原胶溶液；之后将步骤(1)得到的3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因溶解为溶液，加入碱化的黄原胶溶液中，进行反应；待反应结束后，干燥、洗涤得到卤胺改性黄原胶；
(3)将步骤(2)得到的卤胺改性黄原胶进行氯化处理，得到所述的卤胺改性黄原胶抗菌剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中黄原胶和3-(2′-氯乙基)-5,5-二甲基海因的摩尔比为1：1-6。
3.权利要求1或2所述的方法制备得到的卤胺改性黄原胶抗菌剂。
4.一种制备卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求3得到的卤胺改性黄原胶抗菌剂配制为溶液，之后加入甘油混合均匀；再加入壳聚糖溶液混合均匀，成型、干燥，得到所述的卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖和卤胺改性黄原胶抗菌剂的质量比为1-5：1。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的甘油和水的体积比为1-3：30。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖溶液的质量浓度为0.5-2.5％。
8.权利要求4-7任一项所述的方法制备得到的卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料。
9.一种包含权利要求8所述的卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料的创可贴。
10.权利要求8所述的卤胺改性黄原胶/壳聚糖复合抗菌敷料在处理日常浅表皮伤口中的应用。
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