KR102555251B1 - 신규한 화합물을 포함하는 지혈용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물을 제공한다.
본 발명의 지혈용 조성물은 N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘을 동시에 포함하기 때문에 N,N,N-트리메틸 키토산의 양전하로 인해 지혈 성능을 나타냄과 동시에 포비돈 아이오딘으로 인해 살균 성능을 나타낼 수 있다.
한편, N,N,N-트리메틸 키토산과 포비돈 아이오딘은 아이오딘 음전하를 중심으로 이온 복합체를 형성하므로 안정한 형태로 지혈용 조성물 내에서 아이오딘의 방출 속도를 조절할 수 있다.

Description

신규한 화합물을 포함하는 지혈용 조성물{Hemostasis composition comprising the novel composition}
본 발명은 신규한 화합물을 포함하는 지혈용 조성물에 관한 것이다.
일반적으로, 인간을 포함한 동물은 외과적 수술 및 신체적 외상들에 의해 혈관이 다치면 출혈이 발생한다. 경미한 출혈은 외부의 인위적인 도움 없이 생리학적 혈액 응고 작용에 의해 출혈을 정지시킬 수 있으나, 손상 정도에 따라 신체기능에 치명적 영향을 줄 수 있는 정도의 혈액 손실을 가져올 수 있다. 이러한 중증의 조직손상을 수반하는 과다 출혈은 생명을 순식간에 위태롭게 만들어 사망에 이르도록 만드는 중요한 원인 가운데 하나이며, 응급실 내원 환자 중 다발성 손상 환자의 사망원인 74%가 과다출혈로 인한 저혈량성 쇼크라는 점이 학계에 보고된바 있다.
초기 효과적인 지혈로 혈액손실을 최소화하고 빠른 수술시야 확보로 수술시간을 단축하여 환자의 생존가능성을 크게 높일 수 있기에 수술실, 일반 응급상황, 전장에서 지혈제 사용은 필수적이다.
한편, 상처 관리에 있어서 국소 소독제품은 항생제 내성과 다른 합병증을 불러올 수 있다. 이에 따라 이상적인 살균제품은 병원균을 포함한 광범위한 미생물에 대한 항균성이 있어야 하며, 상처 부분에만 침투도가 높으며 전신 흡수에 대한 영향을 최소화 해야한다. 또한, 미생물이 저항성을 획득할 수 없어 야하고, 상처 치유 촉진을 하며 저비용 및 적용이 용이한 것이 이상적인 제품이라 할 수 있다.
기존에 판매되고 있는 제품 중 포비돈 아이오딘은 넓은 스펙트럼의 항균성과 미생물이 저항성이 없으며, 상처 치유 효과를 방해하지 않으며 유해성보다 유익성이 큰 제품으로 다양한 제형 제품이 존재한다. 특히, 포비돈 아이오딘은 포비돈(폴리비닐피롤리돈) 및 아이오딘이 이온 결합한 형태인데, 아이오딘이 미생물의 미생물의 DNA와 지방, 아미노산을 산화시켜 DNA/RNA 및 단백질을 비활성화시키는 기능을 통해 항균성을 띄며, 포비돈은 아이오딘의 방출을 조절한다.
키토산은 생분해성, 비독성, 항균성의 장점을 갖고 있으며, 살균 및 상처회복을 돕는다는 보고가 다수 존재하였으며, 창상회복제 등 키토산 기반의 제품이 많이 출시되고 있다. 그러나 키토산은 약산성 조건에 용해되어 인체에 사용되기 어렵다는 단점이 존재한다. 이와는 달리, 키토산으로부터 3차례 메틸화된 N,N,N-트리메틸키토산은 중성 상태에서 용해되어 인체에 적용하기에 용이하다는 장점이 존재한다.
이에, 본 발명자들은 상기와 같은 기술적 특징에 착안하여 N,N,N-트리메틸키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물을 개발하였다.
본 발명의 목적은 N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 구현예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 일 구현예에서,
N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물을 제공한다.
본 발명의 N,N,N-트리메틸 키토산은 천연 고분자인 키토산에 3차례의 N-메틸레이션을 통해 제조한 양전하 키토산으로, 종래 키토산 자체가 이미 양전하성 고분자로 널리알려져 있으나, 3차례의 N-메틸레이션을 통한 4차아민 양전하를 통해 정전기적 인력을 더욱 강하게 하여 포비돈 아이오딘과의 이온 복합체를 형성할 수 있다. 특히, 본 발명에서 N,N,N-트리메틸 키토산은 중성에서 녹는다는 점에서 약산성에 용해되는 키토산과는 달리 인체에 적용하기 용이하다. 영구적 양전하가 부여된 N,N,N-트리메틸 키토산은 적혈구의 음전하와 활성혈소판을 전하를 통해 끌어당겨 응집과 혈액 응고작용을 보조한다.
본 발명의 포비돈 아이오딘은 폴리비닐피롤리돈과 요오드가 이온결합 상태로 결합되어 있는 화합물로서 외상용 소독제로 널리 알려져 있다. 포비돈 아이오딘의 DNA/RNA뿐만 아니라 단백질을 비활성화시키는 기능을 통해 항균성을 띄며, 포비돈은 아이오딘의 방출을 조절하는 역할을 한다. 아이오딘의 살균기능은 저항성이 없고 강력하나 단시간 다량 노출에는 인체에 문제가 발생할 수 있으므로, 포비돈을 활용하여 방출 속도를 조절한다.
상기 N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘은 지혈용 조성물은 N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘을 0.5:1 내지 2:1의 부피비로 포함할 수 있다. N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘의 부피비가 0.5:1 미만인 경우 N,N,N-트리메틸 키토산의 혈소판 응집효과가 떨어져 지혈 효과가 현저하게 떨어질 수 있다. N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘의 부피비가 2:1을 초과하는 경우 포비돈 아이오딘의 아이오딘 음전하의 양이 부족하여 이온복합체 형성이 원활하지 않을 수 있다.
상기 지혈용 조성물은 하이드로겔, 나노섬유, 에멀젼 및 분말로 이루어진 군에서 선택되는 형태로 제공되는 것일 수 있다.
상기 지혈용 조성물은 포비돈 아이오딘의 존재로 인해 살균 성능을 나타내는 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 지혈용 조성물은 지혈 특성과 동시에 살균 성능을 나타냄에 따라 국소 출혈 부위의 수술, 응급 조치 등에 용이하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물을 제공하는데, 포비돈 아이오딘의 아이오딘과 N,N,N-트리메틸 키토산의 정전기적 인력을 통한 이온복합체 형성을 통해 지혈용 조성물 내에 존재할 수 있다. 상기 이온복합체 형성에 대한 모식도를 도 1에 나타내었다.
또한, 본 발명에서는 상기 지혈용 조성물을 포함하는 지혈제를 제공한다.
본 발명의 지혈용 조성물은 N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘을 동시에 포함하기 때문에 N,N,N-트리메틸 키토산의 양전하로 인해 지혈 성능을 나타냄과 동시에 포비돈 아이오딘으로 인해 살균 성능을 나타낼 수 있다.
한편, N,N,N-트리메틸 키토산과 포비돈 아이오딘은 아이오딘 음전하를 중심으로 이온 복합체를 형성하므로 안정한 형태로 지혈용 조성물 내에서 아이오딘의 방출 속도를 조절할 수 있다.
도 1은 N,N,N-트리메틸키토산과 포비돈 아이오딘의 이온복합체를 나타낸 모식도이다.
도 2는 합성된 N,N,N-트리메틸키토산의 NMR 피크 결과를 나타낸 것이다.
도 3는 (a) 식염수 내에 용해된 N,N,N-트리메틸키토산 (B) 포비돈 아이오딘 내에 용해된 N,N,N-트리메틸키토산 (C) 포비돈 아이오딘 내에 용해된 N,N,N-트리메틸키토산과 대조군의 세포독성 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 포비돈 아이오딘 내에 용해된 N,N,N-트리메틸키토산과 대조군의 박테리아 성장 억제 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 포비돈 아이오딘 내에 용해된 N,N,N-트리메틸키토산과 대조군의 진균 성장 억제 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 6는 포비돈 아이오딘 내에 용해된 N,N,N-트리메틸키토산과 대조군의 in vitro 혈전 응집 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 포비돈 아이오딘 내에 용해된 N,N,N-트리메틸키토산과 대조군의 혈소판 응집 정도를 주사전자현미경으로 확인한 이미지를 나타낸 것이다.
도 8은 포비돈 아이오딘 내에 용해된 N,N,N-트리메틸키토산과 대조군의 in vivo 간 천자 모델을 통한 출혈시간 분석 실험결과를 나타낸 것이다.
실시예
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
재료
실시예 1. N,N,N-트리메틸키토산을 포함하는 분말 조성물의 제조
키토산(10% w/v)과 요오드 나트륨(20% w/v)을 NaOH(15% w/v) 수용액에 녹였다. 그 후 메틸요오드(1:8)와 1-메틸-2-피롤리딘(1:6) 용액을 각 비율로 넣고 60℃ 수조에서 90간 섞었다. 그후 에탄올을 첨가하고 4℃, 100,000 x g로 30분간 원심분리하였다. 원심분리 후 침전된 N-메틸키토산 요오드를 모은 후 60℃로 가열하여 에탄올을 제거하였다. N-메틸키토산 요오드에 요오드 나트륨과 NaOH 수용액(15% v/v), 메틸요오드를 넣고 60℃에서 60분간 섞었다. 섞어주는 동안 요오드를 치환하기 위해 NaCl 수용액(10% v/v)을 넣었다. 그 후 에탄올을 첨가하고 4℃ 10,000 x g로 30분간 원심분리하였다. 침전된 N,N-디메틸키토산(DMC)을 모았다. 그후 드라이 오븐에서 에탄올을 제거하였다. DMC를 요오드 나트륨과 NaOH 수용액(15% v/v), 메틸 요오드를 넣고 60℃에서 60분간 섞었다. 섞어주는 동안 요오드를 치환하기 위해 NaCl 용액 (10% v/v)을 넣었다. 그 후 에탄올을 첨가하고 4℃ 10,000 x g로 30분간 원심분리하였다. 침전된 N,N,N-트리메틸키토산(TMC)을 모은다. 그 후 동결 건조를 진행하여 분말을 얻었다.
실시예 2. N,N,N-트리메틸키토산의 화학 구조 분석
N,N,N-트리메틸키토산의 원활한 합성 여부를 확인하기 위해 1H NMR 분석을 수행하였다. 분석기기는 Bruker 사의 AVANCE 600(600MHz)를 사용하였으며, 용매는 중수(Deuterium Oxide)를 사용하였다. 샘플은 약 2.9% (0.02g/0.7ml) 농도로 사용하였다. 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 질소에 부착된 3개의 메틸기를 확인하여 N,N,N-트리메틸키토산이 원활하게 합성되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. N,N,N-트리메틸키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물의 제조
키토산 유도체 N,N,N-트리메틸 키토산(TMC)을 탈이온수에 용해하여 0.05 내지 20% 중량의 N,N,N-트리메틸 키토산 수용액을 수득하였다. 그 후 PVPI(povidone-iodine) 컴플렉스를 탈이온수에 용해하여 0.1 내지 12 중량%의 요오드가 존재하는 포비돈 요오드 용액을 준비하다. 상기 PVPI와 TMC 용액을 혼합하여 PVPI : TMC의 2:1, 1:1, 1:0.5의 부피 비의 균일한 조성을 형성하였다. N,N,N-트리메틸키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 혼합물은 0.1 내지 10 중량%의 TMC 및 1 내지 10 중량% PVPI(povidone-iodine) 컴플렉스 였다.
실시예 4. N,N,N-트리메틸키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물의 세포 독성 평가
실시예 3에서 제조한 지혈용 조성물의 세포독성 결과를 실험하고 이를 도 3에 나타내었다.
구체적으로 Human fibroblast cells (BJ, ATCC® CRL-2522™)는 Eagle’s minimal essential medium (EMEM), 10% fetal bovine serum albumin (FBS), 1% 페니실린 스트렙토마이신(PS)으로 구성된 배지를 이용하여 배양하였다. 세포를 culture plate에 배양하고, 배양 배지에 혼합된 TMC 용액으로 처리하였다. TMC의 최종 농도는 0.5, 1.0, 2.0, 5.0%이었다. MTT 검사에 의한 24시간 생존 후에 TMC의 잠재적인 세포독성을 결정하기 위해 수행하였다.
그 결과, MTT 검사를 통한 광학 밀도 측정 결과 TMC 처리군과 대조군 사이에서 유의미한 차이가 발견되지 않았다. 이는 TMC에 대해 Human fibroblast cells 에 대한 유의미한 세포독성이 관찰되지 않았음을 의미한다.
실시예 5. N,N,N-트리메틸키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물의 박테리아 성장 억제 실험
실시예 3에서 제조한 지혈용 조성물의 세포독성 결과를 실험하고 이를 도 4에 나타내었다.
구체적으로 박테리아 성장 억제 및 살균 효과를 측정하기 위해 Inhibition zone assay를 수행하였다. 사용된 균주는 그람 양성균에서 methicillin sensitive Staphylococcus aureus (MSSA, KCCM :40881, ATCC 29213), multidrug-resistant Staphylococcus aureus (KCCM : 11256, ATCC 25923)를 사용하였다. 50ml LB broth에 0.5g 아가로스를 넣고 전자렌지를 이용하여 녹인 후, 60℃이하가 되었을 때 각 균을 흡광도(OD600) 값이 0.01되도록 희석 후 400ul를 넣고 페트리 디쉬에 8ml씩 넣고 응고시켰다. 그 후 약 2mm 구멍을 뚫고 각 용액을 4 ul씩 처리 후 37℃에서 24h 배양하였다. 배양 후 클리어 존을 확인 하기 위해 MTT 용액을 30분간 처리 후 결과를 확인하였다.
그 결과 (A) MSSA에서는 TMC농도 5, 10%에서 대조군과 비교하였을 때, 모두 유의한 차이를 확인하였으며, 5%와 10% 농도 사이에서도 유의한 차이가 있음을 확인하였다. (B) Multidrug-resistans S. aureus에서는 5, 10% 모두 대조군과 비교하였을 때, 유의한 차이가 있었으나, 5%와 10% 농도 사이에서는 유의한 차이가 없었다(* P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001).
실시예 6. N,N,N-트리메틸키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물의 진균 성장 억제 실험
실시예 3에서 제조한 지혈용 조성물의 세포독성 결과를 실험하고 이를 도 5에 나타내었다.
구체적으로, 진균 성장 억제 및 살균 효과를 측정하기 위해 Inhibition zone assay를 수행하였다. 사용된 균주는 Candida albicans(KCCM : 11282, ATCC: 10231)를 사용하였다. 50ml LB broth에 0.5g 아가로스를 넣고 전자렌지를 이용하여 녹인 후, 60℃이하가 되었을 때 각 균을 흡광도(OD600) 값이 0.01 되도록 희석 후 400ul를 넣고 페트리 디쉬에 8ml씩 넣고 굳힌다. 그 후 약 2mm 구멍을 뚫고 각 용액을 4ul씩 처리 후 37℃에서 24 시간 배양하였다. 배양 후 clear zone을 확인 하기 위해 MTT 용액을 30분간 처리 후 결과를 확인하였다.
그 결과 C. albicans에서 TMC농도 5, 10%에서 대조군과 비교하였을 때, 모두 유의한 차이를 확인하였으며, 5%와 10% 농도 사이에서도 유의한 차이가 있음을 확인하였다(****P ≤ 0.0001).
실시예 7. N,N,N-트리메틸키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물의 지혈 성능 실험
실시예 3에서 제조한 지혈용 조성물의 지혈 성능 실험을 확인하여 이를 도 6의 (A)에 나타내고, 혈액응고 효과를 관찰하였다(B).
그 결과, 트리메틸키토산을 처리할 경우 대조군에 비해 혈액 응고 시간이 대조군보다 유의하게 빠르다는 것을 확인할 수 있었다.
In vitro 혈액 응고 검사는 구연산 혈액을 사용하여 수행하였다. 4:1의 비율로 0.109M 시트르산 나트륨이 함유된 주사기를 사용하여 스프래그 돌리(SD) 쥐의 복부 정맥에서 전혈을 채취했다. 배양 플레이트의 웰당 PVPI에 다양한 농도의 TMC(0.5, 1.0, 2.0 또는 5%)를 녹인 시료를 넣었다. PVPI는 제어 역할만 했다. 구연산 혈액은 0.1M 염화칼슘(CaCl2)과 혼합하여 응고를 개시하고 TMC 용액을 함유한 웰에서 1:1 부피비로 분배하였다. 혈액은 용액과 접촉할 수 있도록 허용되었고 매 30초마다 관찰되었다. 혈전을 방해하지 않고 웰 속에 탈이온수나 식염수를 넣어 반응을 멈췄다. 혈전을 형성하는 데 걸리는 시간을 기록했고 광학 현미경 사진을 매 분마다 찍었다.
PVPI-TMC 용액은 대조군에 비해 체외 혈액 응고 시간을 크게 단축했다. 그러나 농도 간 유의한 차이가 관찰되지 않아 0.5% TMC의 최소 농도가 In vitro 혈액 응고를 유도하기에 충분했음을 의미하였다.
실시예 8. N,N,N-트리메틸키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물의 혈소판 응집 성능 확인
실시예 3에서 제조한 지혈용 조성물의 혈소판 응집 성능을 확인하기 위해 혈액 내에 지혈용 조성물과 대조군을 첨가한 후 주사전자현미경으로 각각 2000배율, 10000 배율 촬영하여 이를 도 7에 나타내었다.
구체적으로, 혈소판 활성화 검사는 0.109M 시트르산 나트륨이 함유된 주사기를 사용하여 4:1의 비율로 혈액을 채취하여 실시하였다. 고농도 혈소판 용액을 분리하기 위해 전혈을 2500rpm에서 5분간 원심분리하고 혈소판 풍부 혈장(platelet rich plasma, PRP)를 적혈구에서 분리해 5분간 2500rpm에서 추가로 원심분리해 rich plasma pellets을 확보했다. 배양판의 well(24-웰)에 놓인 여과지(50ul)에 TMC 용액이나 식염수(제어기)를 떨어뜨렸다. 펠릿은 PBS로 1:4 비율로 희석한 후 TMC 용액이 적재된 각 여과지(50ul)에 첨가했다. 37°C에서 20분간 배양한 후 각 드레싱을 제거하고 PBS에서 2% 글루타알데히드 또는 4% 파라포름알데히드로 고정했다. 전자현미경(SEM, JSM-6701F, JEOL, 일본)에서 활성화된 혈소판이 관찰되었다.
그 결과, SEM 현미경 관찰결과 TMC가 혈소판의 접착을 지원하고 혈소판을 제어 또는 식염수에 대해서만 활성시키는 거승로 나타났다. 즉, 대조군은 혈소판이 활성화가 되지 않은 반면, 본 발명의 지혈용 조성물은 혈소판 활성화가 되어 위족형태의 가지모양으로 뻗어 있는 것을 확인할 수 있다.
실시예 9. N,N,N-트리메틸키토산 및 포비돈 아이오딘을 포함하는 지혈용 조성물의 지혈 성능 실험
실시예 3에서 제조한 지혈용 조성물의 지혈 성능을 실험하고 이를 도 8에 나타내었다.
구체적으로 마취된 스프래그 돌리 쥐를 바늘을 이용해 스티로폼 보드에 고정시켜 약 45도로 기울였다. 복부 절개 후 간 좌측 측엽이 노출시켰다. 그리고 상처 부위의 그것 이외의 혈액 흡수를 막기 위해 파라필름 5 × 5 cm2를 간엽 아래에 두었다. 상처는 4mm 생검 펀치를 이용해 로브 중간에 생겼다. 자유출혈을 5초간 허용하였다. 출혈이 많은 동안 TMC 용액을 왼쪽 간엽에 바르고 간 아래에 여과지를 두었다. 60초마다 여과지를 교체하고 즉시 젖은 여과지의 무게를 재어 총 출혈량과 응고 시간을 파악했다. 급성 지혈 출혈은 5분 전에 출혈이 정지된 것으로 정의하였다.
그 결과, 대조군 대비 본 발명의 지혈용 조성물을 처리할 경우 출혈시간이 감소하는 것을 확인 할수 있으며, 이로써 본 발명의 지혈용 조성물의 지혈 성능이 우수함을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 0.1 내지 10 중량%의 N,N,N-트리메틸 키토산; 및 1 내지 10 중량%의 포비돈 아이오딘;을 포함하는 지혈용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 N,N,N-트리메틸 키토산은 포비돈 아이오딘에 용해되는 것인, 지혈용 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 지혈용 조성물은 살균 성능을 갖는 것인, 지혈용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, N,N,N-트리메틸 키토산 및 포비돈 아이오딘은 이온 복합체 형태로 지혈용 조성물 내에 존재하는 것인, 지혈용 조성물.
  6. 제1항에 따른 지혈용 조성물을 포함하는 지혈제.
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