KR101497791B1 - 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 생체분자 전달체 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약물 또는 유전자와 같은 생체분자를 효과적으로 전달할 수 있는 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법 및 상기의 방법으로 제조된 나노입자를 포함하는 생체분자 전달체 조성물에 관한 것이다. 이에 따른, 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자는 평균 70 nm 내지 110 nm의 작은 입자 크기, 균일한 기공 크기와 높은 비표면적을 갖음으로써, 생체분자 로딩 및 방출 효율을 향상시키는 효과가 있다.
따라서, 본 발명의 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 포함하는 생체분자 전달체 조성물은, 약물 또는 유전자 등의 생체분자 전달체 또는 시스템에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 생체분자 전달체 조성물{Surface aminated mesoporous bioactive glass nanoparticles, preparation method thereof and biomolecule delivery composition comprising the same}

본 발명은 약물 또는 유전자와 같은 생체분자를 효과적으로 전달할 수 있는 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법 및 상기의 방법으로 제조된 나노입자를 포함하는 생체분자 전달체 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 염기성 분위기에 PEG 또는 CTAB 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체 및 실리카 전구체를 순차적으로 첨가하고 반응시켜 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 제조하는 단계; 및 상기 메조다공성 생체활성유리 나노입자 용액에 아민계 화합물을 첨가하고 환류시키는 단계를 포함하는 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법 및 상기의 방법으로 제조된 나노입자를 포함하는 생체분자 전달체 조성물에 관한 것이다.

1992년 모빌사의 연구그룹이 계면활성제를 템플레이트(Template)로 이용하여 균일한 기공크기와 거대 비표면적을 가지는 나노다공성 실리카 재료의 합성(C.T. Kreage et al., Nature, 710, 359, 1992)을 성공한 이래 나노다공성 재료는 흡착제, 촉매, 센서, 광에너지 디바이스 등 광범위한 분야에서 그 응용이 기대되고 있다. 특히, 최근에는 생체 재료 분야에서 관심을 받고 있으며, 그 대부분이 약물전달시스템 재료로서의 응용이 제안되고 있다(M. Hartmann, Chem. Mater., 4577, 17, 2005; M. Vallet-Regi, J. mater. Chem., 26, 16, 2006).

약물전달 시스템은 1970년대부터 선진국들이 첨단기술을 동원해 활발히 연구하고 있는 분야로, 안정성과 유효성이 입증된 기존 의약품의 부작용을 최소화하고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 제형을 말하는 것으로 기존의 신약개발에 비해 시간과 비용은 줄어드는 반면 안전성과 유효성이 입증된 기존의 약물을 이용함으로써 높은 효과를 얻을 수 있다는 장점이 있다.

약물전달 시스템은 크게 투여 경로에 따라 보통의 약물 복용 방식인 경구형, 패치식으로 피부에 붙일 수 있는 경피형, 그리고 주사형으로 나눌 수 있으며, 용도에 따라 약물의 방출 속도를 늦춤으로써 생체이용률이 낮거나 약물이 지나치게 빨리 체외로 소실되는 등의 문제점을 줄이고자 한 약효 지속형, 표적부위의 농도를 제어함으로써 실제의 치료효과를 조절하는 것을 목적으로 하는 제어방출형, 약물의 불필요한 분포를 억제하여 비표적부위를 보호하고 표적부위로만 약물을 전달하는 표적부위 집중형으로 나눌 수 있는데, 이와 같이 여러 방법이 모두 효과적으로 작용하기 위해서는 각 방법에 맞는 약물 전달체를 필요로 하게 된다.

또한, 약물 전달체는 생체친화적 표면으로 생체적합성을 띠며, 방출속도를 조절할 수 있는 조건을 가지고 있어야 한다. 현재 약물 전달체의 재료로는 리포솜, 나노입자, 임플란트, 하이드로젤 등이 사용되고 있으며, 하이드로젤 중 온도, pH, 외부의 화학적, 물리적 자극에 반응하는 것을 지능형 하이드로젤이라 하며 이런 지능형 소재를 기반으로 많은 연구가 진행되고 있다.

한편, 최근 나노수준의 구조체를 이용한 약물 전달체의 유용성이 대두되면서, 소수성 블록과 친수성 블록을 함께 가지고 있는 다양한 양친성 고분자의 합성을 통해 보다 효과적인 나노 구조체를 제조하려는 연구들이 주목받고 있다. 양친성 고분자는 그 구성블록의 성질에 따라 매우 다양한 성질을 발현할 수 있는 특징이 있는데, 예컨대, 고분자의 분자량, 친수성 또는 소수성의 블록비율, 블록의 강직도, 블록간의 친화력, 블록의 분자구조, 친수성 블록의 전하, 리간드의 도입여부 등에 따라 양친성 고분자가 형성하는 구조체의 성질이 달라진다. 수용액 내에서 이러한 양친성 고분자는 소수성 블록이 시스템의 자유에너지를 낮추기 위해 물을 피해 자기들끼리 회합하려는 성질에 의해 나노입자를 이루고, 친수성 블록이 수용액 내에서 균일하게 용해되기 때문에 수용액 내에서 열역학적으로 안정한 구조체를 유지할 수 있게 된다. 또한, 양친성 고분자의 회합현상에 의해 생성되어진 나노미립구는 일반적인 저분자량의 분자들로 구성된 구조와 비교할 때 고분자 사슬의 얽힘과 결정성으로 인해 보다 안정한 구조를 형성할 수 있어서 생리활성 성분의 전달체로서 보다 효과적으로 사용될 수 있으며, 특히 나노수준에서 균일한 구조를 형성하는 것이 가능하기 때문에 표적지향성 약물 전달 시스템, 난용성 약물의 가용화 및 유전자 전달시스템으로의 활용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

특히, 양친성을 이용한 약물 전달체의 소재와 관련된 기술들 중, 리포좀을 이용한 약물 전달 시스템에 대하여 많은 연구들이 진행되고 있는데, 리포좀 내상에 함입된 생리활성성분이 생체 세포에 높은 효율로 전달되어 활성성분의 효능을 최대한 발휘할 수 있도록 하고자 다양한 리포좀의 구성 성분을 사용하여 약물 전달체를 개발하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 예를 들어, 생체 내 순환 시간을 증대시켜 활성약물의 생체 이용률을 증진시키기 위해 생체적합성 고분자가 도입된 지질을 포함하는 리포좀을 제조하는 것, 펩타이드, 단백질 또는 유전자와 같은 거대 분자량의 약물을 표적 세포에 특이적으로 전달하기 위하여 세포인식 또는 세포점착 분자가 도입된 지질을 포함한 리포좀을 제조하는 것, 또는 세포내 소기관의 특이적 환경에 의해 리포좀의 안정성이 저하되어 리포좀 내 함입된 생리활성성분이 세포내로 방출되도록 디자인한 리포좀 등에 대한 연구가 진행되고 있다.

나아가 최근에는 전하를 띄는 고분자 물질과 생체 내에서 전하를 띄는 생체활성 물질인 치료용 단백질 또는 유전자를 이온결합을 통해 이온 복합체를 형성하여 이를 통해 약물을 전달하는 연구도 진행되고 있다. 한 예로, 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리-L-리신(poly-L-lysine)의 블록 공중합체와 폴리에틸렌 옥사이드와 폴리-L-아스파테이트(poly-L-aspartate)의 블록 공중합체를 함께 사용하여 서로 다른 전하를 지닌 고분자 간의 이온결합을 이용하여 나노입자를 만드는 폴리온 복합미셀(polyion complex(PIC) micelle)이라는 개념을 제시한바 있으며(A. Harada & Katoaka, Macromolecules, 28, 5294, 1995), 또한 이러한 개념을 활용하여 등전점이 11 정도의 양전하를 지닌 단백질인 라이소자임(lysozyme)을 고분자 미셀 안에 봉입시키는 연구결과를 발표한바 있다(A. Harada & Kataoka, Macromolecules, 31, 288, 1998).

그러나, 지금까지 개발된 종래의 약물 전달체용 고분자 물질 또는 약물 전달체의 경우, 생분해성 및 생체적합성인 특성을 가지고 있으나 체내 투여시 체내의 강한 이온 강도에 의해서 약물 전달체의 안정성이 떨어진다는 문제점이 있다. 따라서, 생체 내의 강한 이온 강도에서도 높은 안정성을 유지할 수 있으며, 생체적합성 및 생분해성이 우수한 새로운 약물 전달체의 개발이 필요한 실정이다.

상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 세포 독성이 없으며 약물 전달 효과가 우수한 생체분자 전달체를 연구하던 중, 초음파 염촉매 졸겔법으로 제조한 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자가 균일한 메조다공 특성 및 높은 비표면적을 갖음은 물론 약물 및 유전자와 같은 생체분자에 높은 로딩 및 방출 효율을 보임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 약물 및 유전자와 같은 생체분자를 효율적으로 전달할 수 있는 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 포함하는 생체분자 전달체 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 PEG 또는 CTAB를 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하고, pH를 9 내지 13으로 조절하는 단계(단계 1); 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계(단계 2); 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계(단계 3); 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 제조하는 단계(단계 4); 상기 제조된 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 용매에 분산시킨 후 아민계 화합물을 첨가하고 교반하여 환류시키는 단계(단계 5)를 포함하는 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법을 제공한다.

상기 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자는 실리카(SiO₂)와 산화칼슘(CaO)을 60:40 내지 95:5의 몰 비율로 포함하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 실리카와 산화칼슘의 몰 비율이 85:15이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 실리카와 산화칼슘의 몰 비율이 85:15일 때 가장 용이하게 구형의 입자를 형성하였다.

상기 단계 1은, 메조기공을 갖는 나노입자를 제조하기 위하여 자기조직화 고분자 템플레이트 용액을 제조하고, pH를 9 내지 13으로 조절하여 염기성 분위기를 형성하는 단계이다. 본 발명의 자기조직화 고분자 템플레이트는 PEG 또는 CTAB가 바람직하며, 상기 템플레이트 용액은 무수 메탄올 용액에 상기 고분자 템플레이트를 용해시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기 pH는 NH₄OH, NaOH, KOH 또는 Tris로 조절하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 단계 2는, 템플레이트 물질에 산화칼슘을 형성시키기 위하여, 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하고 교반하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계이다. 상기 산화칼슘 전구체는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate) 또는 calcium methoxyethoxide인 것이 바람직하다.

상기 단계 3은, 템플레이트 물질에 목적하는 무기물을 형성시키기 위하여, 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계이다. 상기 실리카 전구체 용액은 실리카 전구체를 무수 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로파놀의 알코올 용액에 용해시킨 것이 바람직하며, 상기 실리카 전구체는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyl diethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane) 또는 APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 초음파 처리는 출력 전력 200 W 내지 240 W, 10 s on/ 10 s off 사이클로 15분 내지 25분 동안 수행하는 것이 바람직하다.

상기 단계 4는, 반응 생성물에서 템플레이트를 제거하여 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 수득하기 위하여, 상기 반응 생성물을 4500 rpm 내지 5500 rpm으로 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하는 단계이다. 상기 세척 후에 탈이온수로 세 차례 그리고 무수 에탄올로 두 차례 재분산시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 건조는 65℃ 내지 75℃ 온도범위에서 10시간 내지 14시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 소성은 대기하에서 550℃ 내지 650℃ 온도범위에서 5시간 내지 7시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

상기 단계 5는, 상기 단계 4에서 제조된 메조다공성 생체활성유리 나노입자 표면을 아민 기능기화하여 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 수득하기 위하여, 상기 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 용매에 분산시킨 후 아민계 화합물을 첨가하여 교반하여 환류시키는 단계이다. 상기 아민계 화합물은 APTES(3-aminopropyl triethoxysilane) 또는 AEAPMDMS(N(beta-aminoethyl)gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane)인 것이 바람직하다. 상기 환류는 55℃ 내지 65℃ 온도범위에서 5시간 내지 7시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 환류 후에 세척 및 건조 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 건조는 75℃ 내지 85℃ 온도범위에서 10시간 내지 14시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조된 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 포함하는 생체분자 전달체 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "생체분자(biomolecule)"는, 생물체를 구성하거나 생물의 기능을 담당하는 특수 분자를 의미하며, 핵산, 단백질, 다당류 등이 있다. 본 발명의 생체분자는 화학 약물 또는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자는 평균 70 nm 내지 110 nm의 작은 입자 크기, 균일한 기공 크기와 높은 비표면적을 갖음으로써, 생체분자 로딩 및 방출 효율을 향상시키는 효과가 있다.

따라서, 본 발명의 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 포함하는 생체분자 전달체 조성물은, 약물 또는 유전자 등의 생체분자 전달체 또는 시스템에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)의 (a) BGn1의 SEM 이미지, (b) 및 (c) BGn1의 TEM 이미지, (d) BGn2의 SEM 이미지, (e) 및 (f) BGn2의 TEM 이미지를 통한 나노구조적 형태학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)의 (a) 입자크기 분포 및 (b) 평균 입자 크기 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)의 (a) XRD 패턴 및 (b) EDX 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른 메조다공성 생체활성유리 나노입자인 (a) BGn1 및 (b) BGn2의 질소 흡착-탈착 등온선 및 기공 직경 분포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)와 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 (a) FT-IR, (b) TGA 및 (c) 제타 전위 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따른 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn2(A))의 인산칼슘세라믹 형성능에 대한 (a) XRD, (b) FT-IR, (c) SEM 및 (d) TEM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따른 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 (a) rMSC, (b) MC3T3-E1 및 (c) Hela 세포에 대한 세포 생존능(세포 독성) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따른 표면 아민화 메조다공성 생체활성 유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))를 이용한 Na-ampicillin 로딩 및 방출 실험에 대한 (a) 로딩 최적 시간 분석, (b) 로딩 용량 분석, (c) 방출 용량 및 시간 분석 및 (d) 초기 로딩 양에 대한 방출 비율 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일 실시예에 따른 Na-amicillin 로딩 후 BGn2(A)의 TEM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 siRNA 로딩 및 (b) 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn2(A))의 siRNA 방출 실험 결과 그래프를 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자 전달 확인을 위한 (a) CLSM 및 (b) FACS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 12는, 본 발명의 일 실시예에 따른 (a) HeLa 세포 및 (b) siRNA 로딩된 BGn2(A) 전달(감염) 후의 HeLa 세포의 TEM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은, 본 발명의 일 실시예에 따른 gene silencing 효율(BGn2(A)로부터 전달된 siRNA의 생체 활성) 분석 결과를 나타낸 것이다.

이하, 하기 실시예 및 실험예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 : 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자 제조

실험에 사용된 TEOS(tetraethyl orthosilicate, C₈H₂₀O₄Si, 98%), 질산칼슘(Calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO₃)₂ㆍ4H₂O, 99%), PEG(poly(ethylene glycol), (C₂H₄)nH₂O, Mn: 10,000), CTAB(hexadecetyltrimethyl ammonium bromide, C₁₉H₄₂BrN, ≥98%), 수산화암모늄(NH₄OH, 28.0% NH₃ in water, ≥99.99% metal basis), 무수 메탄올(CH₄O, 99.8%), 무수 톨루엔(C₇H₈, 99.8%), APTES(3-aminopropyl triethoxysilane, C₉H₂₃NO₃Si, ≥98%) 및 ampicillin sodium salt(C₁₆H₁₈N₃NaO₄S)는 Sigma-Aldrich에서 구입하여 정제 없이 사용하였다.

1) 메조다공성 생체활성유리 나노입자 제조

실리카(SiO₂)와 산화칼슘(CaO)이 85 mol%: 15 mol%의 몰비율을 갖도록 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 제조하였다. 템플레이트 고분자 화합물 5 g을 120 ㎖ 무수 메탄올에 넣고 교반하여 완전히 용해시켰다. 이때, PEG 및 CTAB를 각각 템플레이트 고분자 화합물로 사용하였으며, PEG를 템플레이트로 사용한 나노입자는 BGn1으로, CTAB를 템플레이트로 사용한 나노입자는 BGn2로 구분하여 기재하였다. 상기 각 템플레이트 용액에 수산화암모늄을 첨가(약 30 ㎖)하여 pH 12.5로 적정하고, pH가 조절된 각 템플레이트 용액에 0.179 g의 질산칼슘(Ca(NO₃)₂ㆍ4H₂O)을 교반하면서 첨가하여 용해시켰다. 이와 분리하여, 0.895 g의 TEOS(C₈H₂₀O₄Si)를 30 ㎖ 무수 메탄올에 용해시켜 TEOS 용액을 제조하였다. 상기 질산칼슘을 용해시킨 템플레이트 용액 각각을 강하게 교반하면서 상기 TEOS 용액을 한 방울씩 첨가하였다. 이때, LH700S ultra-sonic generator(Ulsso Hitech, South Korea)를 사용하여 20 kHz 초음파 및 700 W 전력으로 10 s on/ 10 s off 사이클에 220 W 출력 전력으로 20분 동안 초음파 처리하였다. 24시간 동안 강하게 교반한 후, 생성된 백색 침전물 각각을 5000 rpm으로 5분 동안 원심분리(Megal17R 원심분리기, Hanil Science, South Korea)하여 분리하고 세척하였다. 그리고 탈이온수에 3차례 재분산시키고 무수 메탄올에 2차례 재분산 시킨 후 70℃에서 12시간 동안 건조하였다. 건조된 각 백색 침전물에서 유기물(템플레이트)과 질산염을 제거하기 위하여 대기 조건하에서 600℃로 가열속도 1 ℃/min으로 5시간 동안 소성하여 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 제조하였다.

2) 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조

상기 실시예 1)에서 제조한 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(PEG 템플레이트) 및 BGn2(CTAB 템플레이트))의 표면을 기능화(functionalize)하기 위하여, 아민프로필계 물질과 후-합성(post-synthesis)하였다. 상기 실시예 1)에서 제조한 각 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2) 100 ㎎을 50 ㎖ 무수 톨루엔에 분산시키고 1 ㎖의 APTES와 함께 60℃에서 6시간 동안 교반하면서 환류시켰다. 상기 환류액을 상온까지 식히고 5000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 각 나노입자를 분리하였다. 분리된 나노입자 각각을 세척하고 톨루엔에 3차례 재분산 시킨 후 80℃에서 12시간 동안 건조시켜 아민-기능기화된 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 제조하였다. 상기 아민-기능기화된 메조다공성 생체활성유리 나노입자는 BGn1(A) 및 BGn2(A)로 구분하여 기재하였다.

실험예 1: 물리화학적 특성 분석

1) 모폴로지(morpology) 분석

상기 실시예 1)에서 제조한 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)의 모폴로지(morpology) 분석을 위하여, 전계방사형 주사전자현미경(FE-SEM, TESCAN, MIRA II LMH, Czech Republic)을 측정하였으며, 입자 크기 및 메조다공성 구조는 고분해능 투과전자현미경(HR-TEM, JEM-3010, JEOL, Japan)을 사용하여 측정하였다. 도 1에 분석 결과를 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, FE-SEM 측정 결과(도 1의 a 및 d) 100 nm 크기로 단일 분산된 구형 나노입자를 확인하였으며, HR-TEM 측정 결과(도 1의 b,c,e 및 f) 상기 나노입자 내부 구조가 메조다공성임을 확인하였다.

2) 입자 크기 분석

상기 실시예 1)의 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)의 입자 크기 분포 및 입자 크기를 분석하였다. 입자 크기 분포는 상기 실험예 1-1)의 HR-TEM 측정 결과에서 무작위로 선택하여 분석하였으며, 입자 크기는 DLS(dynimic light scattering, Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, UK)로 분석하였다. 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2a에 나타난 바와 같이, BGn1의 경우 평균 85±15 nm 입자 크기를 나타내었으며, BGn2의 경우에는 평균 95±15 nm의 입자크기를 나타내었다.

도 2b에 나타난 바와 같이, DLS 측정 결과 BGn1은 105 nm 입자 크기를 나타내었으며, BGn2는 115 nm로 측정되었다. 이는, 나노입자의 응집 억제 효과에 의해 입자의 크기가 조금 증가한 것으로 볼 수 있다.

3) 입자 상(phase) 및 성분 분석

상기 실시예 1)의 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)의 결정상(phase)은 CuKα 방사(λ=1.5418 Å)를 적용한 XRD(Ultima IV, Rigaku, Japan)를 사용하여 분석하였다. 이때, X-ray는 40 ㎃ 및 40 ㎸에서 생성하였으며, 데이타는 0.02°step size 및 2 °/min 스캔 속도로 회절각(2θ)4°에서 70°까지 기록하였다. 메조다공 특성은, Rigaku D/Max-2500 diffractometer를 이용하여 0.5°에서 5°의 2θ 범위에서 small angle XRD 분석을 수행하였다. 또한, 상기 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 화학적 조성을 확인하기 위하여, BGn1의 EDX 분석을 실시하였다. 도 3에 결과를 나타내었다.

도 3a에 나타난 바와 같이, XRD 패턴을 통해 상기 두 메노다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)가 비정질상(무정형)인 것을 확인하였으며, small angle XRD 패턴을 통하여 2θ=0.959에서 BGn1은 아무 피크를 보이지 않는 반면 BGn2는 피크가 있음을 확인하였다. 이는, BGn2 내에 메조다공은 정확하지 않으나 균일한 크기인 반면 BGn1은 불균일한 크기를 갖음을 의미하는 것으로 볼 수 있다.

또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, 메조다공성 생체활성유리 나노입자인 BGn1의 화학적 조성이 유리 화학양론과 유사한 atomic ratio에서 Si와 Ca 피크를 나타내었다.

4) 기공 특성 분석

상기 실시예 1)의 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)의 기공 특성을 확인하기 위하여, 비표면적, 기공 부피 및 기공 크기 분포를 질소 흡착-탈착 분석을 기반으로 하여 계산하였다. 질소 흡착-탈착 등온선은 77K에서 Quadrasorb SI automated surface area & pore size analyzer(Zuantachrom Instruments, UK)를 이용하여 얻었다. 상기 나노입자 시료들(BGn1 및 BGn2)은 분석 전에 12시간 동안 300℃에 진공 조건에서 가스를 제거하였다. 비표면적은 Btunauer-Emmett-Teller(BET)법을 통하여 계산하였으며, 기공 크기 분포는 DFT(density functional theory)법을 기반으로, 얻어진 질소 흡착-탈착 등온선의 질소 탈착 부분으로부터 계산하였다. 총 기공 부피는 최대 상대 압력에서 흡착된 총량으로부터 계산하였다. 여기에서 상대 압력(P/P₀)는 흡착하는 기체의 압력(P)를 이 온도에서 흡착하는 물질의 포화증기압(P₀)으로 나눈 값을 의미한다. 분석 결과를 하기 표 1 및 도 4에 나타내었다.

파라미터	BGn1	BGn2
기공 크기(nm)	4.9	3.2
비표면적(m2/g)	54	830
비기공부피(cm3/g)	0.133	0.415

상기 표 1에 나타난 바와 같이, BGn1 및 BGn2의 평균 기공 크기는 각각 4.9 nm와 3.2 nm이었으며, 비기공부피는 각각 0.133 cm³/g과 0.415 cm³/g이었다. 비표면적은 BET 근사치를 기반으로 계산된 것으로, 각각 54 m²/g과 830 m²/g이었다. 이는, BGn2가 BGn1보다 더 균일한 기공 크기 및 높은 비표면적을 갖는 뛰어난 레벨의 기공임을 의미하는 것으로 볼 수 있다.

또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 질소 흡착-탈착 등온선은 IUPAC에 따른 다공성 물질과 관련된 IV형 등온선 특성을 나타내었으며, BGn1 질소 흡착-탈착 등온선에서는 큰 기공의 존재를 의미하는, 탈착 부분의 작은 자기이력곡선(hysteresis loop)을 확인하였다. 한편, BGn2 질소 흡착-탈착 등온선에서는 흡착 공정이 완벽한 가역이었음을 나타내는 자기이력곡선(hysteresis loop)를 보였다. 또한, 기공 크기 분포에서는, BGn2가 좁은 분포와 큰 기공 부피와 함께 단일 크기(mono-sized) 기공을 보이는 반면, BGn1은 넓은 분포와 비교적 낮은 기공 부피와 함께 멀티 크기(multi-sized) 기공을 보였다.

5) 표면 아민화에 따른 특성 비교 분석

표면 아민화에 따른 특성 변화를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1)의 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)와 상기 실시예 2)의 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 FT-IR, TGA 및 제타-전위(zeta-potential) 비교 분석을 실시하였다. FT-IR(Varian, Australia)은 KBr법을 사용하여 4000 cm^-1 - 400 cm^-1 범위에서 해상도 4 cm^-1로 측정하였으며, TGA(TGA N-1500, Scinco, South Korea)는 10 ℃/min 가열 속도 및 40 ㎖/min 질소 플럭스(flux) 조건으로 측정하였다. 그리고, 나노입자의 표면 전위 및 분자 안정성을 확인하기 위하여, Zetasizer Nano ZS laser Doppler electrophosresis(LDE) 장치로 제타 전위 분석을 수행하였다. 상기 나노입자들(BGn1, BGn2, BGn1(A) 및 BGn2(A))은 각각 다른 pH값의 탈이온수에 분산시켜 시료로 사용하였다. 제타 전위는 20 V/cm의 전계강도를 적용하여 25℃에서 5차례 분석하였으며, 평균±표준편차(n=5)를 계산하였다. 전기영동이동도와 제타 전위는 하기 Helmholtz-Smoluchowsky equation에 따라 계산하였다. 분석결과를 도 5에 나타내었다.

상기 식에서, ζ는 제타 전위, U는 전기영동이동도, η는 분광중점도 및 ε는 유전상수이다.

도 5a에 나타난 바와 같이, 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 FT-IR 스펙트라에서 아민(NH²) 기능기의 N-H 진공띠 특성을 확인할 수 있었다.

도 5b에 나타난 바와 같이, BGn1의 경우, 약 250℃ 이하에서 나노입자 표면에 흡착된 물 분자(30℃-120℃) 손실과 표면 실라놀기(120℃-250℃)의 축합에 해당하는 4%의 질량 손실을 보였으며, 250℃-550℃의 범위에서는 PEG 템플레이트 잔여물에 의한 것으로 보이는 1% 질량 손실이 나타났다. BGn2의 경우에는, 250℃ 이하에서 15%의 질량 손실을 보였으며, 250℃-550℃ 범위에서 CTAB 템플레이트 잔여물에 의한 것으로 보이는 2% 질량 손실을 나타내었다. 한편, 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))는 아민화 하지 않은 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2)와 비교하여, 상이한 질량 손실 거동을 나타내었다. BGn1(A)는 250℃-550℃ 범위에서 10%의 질량 손실을 보였으며, BGn2(A)는 같은 온도 범위에서 13% 질량 손실을 나타내었다. 이는, 아민 기능기의 분해에 기인한 것으로 생각할 수 있다.

또한, 도 5c에 나타난 바와 같이, 표면 아민화 후에 표면 전하는 완전히 바뀌는 것을 확인할 수 있었다. pH 7.0에서 아민화 하지 않은 메조다공성 생체활성유리 나노입자인 BGn1과 BGn2의 제타 전위는 각각 -29.0 mV 및 -19.5 mV의 높은 음전하인 반면, 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자인 BGn1(A)와 BGn2(A)의 제타 전위는 측정된 pH 범위(3.0-9.0)내에서 양전하를 띄었다. 특히, pH 7.0에서의 제타 전위는 각각 +28.5 mV 및 +22.5 mV로 높은 양전하를 나타내었다.

실험예 2: In - vitro 인산칼슘세라믹 형성능 분석

상기 실시예 2)의 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn2(A))d의 골 생체활성 효과를 확인하기 위하여, 유사체액을 이용하여 인산칼슘세라믹 형성능 분석을 실행하였다. 유사체액은 탈이온수에 NaCl, NaHCO₃, KCl, K₂HPO₄ㆍ3H₂O, MgCl₂ㆍ6H₂O, CaCl₂ 및 Na₂SO₄를 탈이온수에 용해하고 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄((HOCH₂)CNH₂)과 HCl로 pH 7.4로 버퍼링하여 제조하였다. 나노입자(BGn2(A))는 꽉 막힌 100 ㎖ 폴리에틸렌병(70% 에탄올로 살균하고 탈이온수로 세척) 내에서 1 ㎎/㎖ 농도의 유사체액에 잘 분산시켰다. 상기 병은 최대 28일의 각기 다른 시간(0일, 7일, 14일, 21일 및 28일) 동안 37℃로 조절된 배양기안에 보관하였으며, 유사체액은 주기적으로 갈아주었다. 각 선택된 시간점(0일, 7일, 14일, 21일 및 28일)에, 배양기에서 병을 꺼내어 5000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 입자(시료)를 분리한 후, 세척하고 탈이온수와 순수한 에탄올에 조심스럽게 재분산 시키고 50℃에서 하룻밤 동안 건조하였다. 얻어진 입자(시료)는 미소결정 형성 확인을 위하여 SEM 및 TEM으로 분석하였다. 유사체액 처리된 나노입자(BGn2(A))의 상(phase)와 화학적 결합 구조는 XRD 및 FT-IR을 이용하여 분석하였다. 분석결과를 도 6에 나타내었다.

도 6a에 나타난 바와 같이, 유사체액 담지 후 나노입자(BGn2(A))의 XRD 상 변화는 전형적인 인산칼슘세라믹 피크를 나타내었으며, 주 피크 2θ=32°에서의 세기는 담지 시간(배양시간) 증가에 따라 증가하였다.

도 6b에 나타난 바와 같이, FT-IR 분석 결과 카보네이티드 인산칼슘세라믹과 관련된 밴드(565 cm^-1, 605 cm^-1 및 964 cm^-1에 PO₄ 밴드와 1420 cm^-1 및 1458 cm^-1에 CO₃ 밴드)가 발생되는 것을 확인할 수 있었다.

도 6c에 나타난 바와 같이, SEM 분석 결과, 배양 1일째에는 몇몇의 결정 형성이 시작하는 것을 확인할 수 있었으며, 7일 및 14일 동안의 장기적인 배양 결과 나노입자(BGn2(A)) 구형이 완벽하게 분해될 만큼 인산칼슘세라믹 미소결정이 발생하였다.

또한, 도 6d에 나타난 바와 같이, TEM 분석 결과 또한 1일 및 7일째에 나노입자의 표면에 미소결정이 발생하는 것을 확인하였다.

실험예 3: In - vitro 세포독성 분석

상기 실시예에서 제조한 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 생체분자 전달 시스템으로서의 활용 가능성을 확인하기 위하여, 세포독성 분석을 실시하였다. 세포독성 분석은 Hela cell line, preosteoblastic MC3T3-E1 cell 및 rat bone marrow mesenchymal stem(rMSCs) 세포를 이용하여 분석하였다. 각 세포는 37℃, 5% 이산화탄소 대기 조건 하에 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함한 Dulbecco's modifed Eagle's 배지 내에서 보관하였다. 1×10⁵ ㎖^-1 밀도로 제조된 세포 100 ㎕를 각 96 well plate에 놓고 24시간 동안 배양한 후 다양한 농도(0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 및 100 ㎍/㎖)의 상기 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))를 함유한 배지로 갈아주었다. 24시간 동안 추가 배양한 후, 세포는 수집하고 CCk-8 세포 계량 키트를 사용하여 세포 생존능을 측정하였다. 반응 배지를 각 well에 첨가하고 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양한 후 각 세포 배양 상청액 100 ㎕를 수집하고 iMark microplate reader를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였으며, 데이타는 3차례 시험하여 평균을 계산하였다. 분석 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, rMSCs의 경우 BGn1(A) 및 BGn2(A)의 농도에 의존적으로 세포 생존능 변화를 나타내었다. 낮은 농도(<20 ㎍/㎖)에서 상향 조절된(up-regulated) 세포 생존능이 높은 농도에서 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 낮은 농도에서 상향조절(특히, BGn2(A))은 MC3T3-E1 cell에서 더 확연하였다. 한편, Hela cell line의 경우에는 상기 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 모든 농도에서 높은 생존능을 나타내었다.

실험예 4: 약물 로딩 및 방출 분석

상기 실시예에서 제조한 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2) 및 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 약물 전달체로서의 활용 가능성을 확인하기 위하여, 화학 약물, 단백질 및 유전자 로딩 및 방출 분석 실험을 수행하였다.

1) Sodium ampicillin 로딩 및 방출(화학 약물)

Na-ampicillin(Sodium apmicillin)을 항생제의 로딩 및 방출 시험용 약물로 사용하였다. 우선, 표면 아민화하지 않은 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1 및 BGn2) 내부에 Na-ampicillin을 로딩하였으나, 효과적인 로딩을 보이지 않았다. 이는, 음전하인 Na-ampicillin과 상기 나노입자(BGn1 및 BGn2)가 서로 밀어내는 영향에 의한 것으로 보인다. 따라서, 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))에 Na-ampicillin 로딩을 실시하였다. 5 ㎎ 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 또는 BGn2(A))를 Na-ampicillin 용액(1 ㎎, 5 ㎎ 및 15 ㎎)에 완전히 용해시킨 후 37℃에서 최대 4시간 동안 배양하였다. 각 선택된 시간점에서, 각 용액 1 ㎖를 뽑고 10,000 rpm으로 3분 동안 원심분리(5415D 원심분리기, Eppedorf, Germany) 하였다. 분리된 상청액을 UV-vis 분광분석기를 사용하여 Na-ampicillin 농도를 분석하였다. 상기 시료용액과 같은 pH의 맹검액을 레퍼런스로 사용하였다. Na-ampicillin 로딩을 위한 최적 시간점을 측정하였다. 그리고 Na-ampicillin이 로딩된 상기 각 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))는 방출 실험을 위하여 증류수로 세척하고 37℃에서 하룻밤 동안 건조하였다. Na-ampicillin 총량은 depletion method(감소법)으로 측정하였다. depetion method(감소법)은 로딩 공정 전후 로딩 용액내 Na-ampicillin 농도 차이를 나타낸다. Na-ampicillin은 Libra S22 장치(Biochrom, UK)를 사용하여 230 nm 파장에서 흡광도 변화 관찰을 통해 UV-vis 분광법으로 분석하였으며, Beer-Lambert law에 따른 선형 검량선(r²=0.99)을 얻기 위하여 표준 Na-ampicillin 용액(탈이온수에 용해, 10 ㎍/㎖-100 ㎍/㎖)을 제조하였다. 상기 Beer-Lambert law는 A=abc로, a는 흡광계수, b는 cell bath length, c는 농도를 나타낸다.

Na-ampicillin 방출 시험은 PBS(pH 7.4)를 사용하여 측정하였다. Na-ampicillin이 로딩된 각 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A)) 5 ㎎을 10 ㎖에 분산시키고 용액을 최대 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. 각 선택된 시간점에서, 각 배양용액 1 ㎖를 뽑고 3분 동안 10,000 rpm으로 원심분리하였다. PBS를 맹검액으로 이용하여, UV-vis 분광분석기로 분리된 상청액의 Na-ampicillin 농도를 분석하였다. Na-ampicillin 로딩 및 방출 분석 결과를 도 8에 나타내었으며, 도 9에 Na-ampicillin이 로딩된 BGn2(A)의 TEM 측정 결과를 나타내었다. 또한, 하기 표 2에 Na-ampicillin 로딩에 따른 상기 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 기공 구조 변화를 나타내었다.

파라미터	BGn1(A)			BGn2(A)
	로딩 전	로딩 후	변화율(%)	로딩 전	로딩 후	변화율(%)
기공크기(nm)	4.9	3.78	22.9	3.20	2.94	8.1
비표면적(m2/g)	54.0	42.9	20.5	830	487	41.3
비기공부피(cm3/g)	0.133	0.080	38.8	0.415	0.282	32.0

상기 표 2에 나타난 바와 같이, Na-ampicillin을 로딩한 후 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 비표면적 및 기공크기가 감소하였다. 특히, 로딩 후 비기공부피가 각각 32% 및 38.8%로 현저하게 감소하였으며, 이는 상기 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))의 메조다공 구조 내에 Na-ampicillin 분자가 결합하였음을 나타낸다.

도 8에 나타난 바와 같이, BGn1(A) 및 BGn2(A)의 두 나노입자 모두 약 120분에서 Na-ampicillin 로딩 포화상태를 나타내었으며, 최대 로딩은 각각 BGn1(A) 그램당 약 180 ㎍ Na-ampicillin, BGn2(A) 그램당 약 300 ㎍ Na-ampicillin로 BGn2(A)가 현저히 높은 로딩양을 나타내었다. 이는, BGn2(A)의 높은 비기공부피 및 비표면적이 ampicillin 로딩 용량을 증가시킬 수 있는 것으로 생각할 수 있다. 한편, 상기 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))로부터 ampicillin 방출 패턴은 초기 몇 시간 동안 선형적으로 급속한 방출 속도를 보였으며, 이후 방출속도가 감소하여 약 12시간에서 방출 포화 상태를 보였다. BGn1(A) 및 BGn2(A)의 방출 패턴이 유사함에도 불구하고, 동일한 시간 동안 ampicillin 방출 총량은 현저히 상이하였다. 이는 초기 로딩 총량에 차이가 있었기 때문으로 생각된다.

또한, 도 9에 나타난 바와 같이, Na-ampicillin 로딩 후 나노입자(BGn2(A))의 메조기공이 도 1f의 TEM 이미지와 비교하여 현저히 사라진 것을 확인할 수 있었다.

2) siRNA 로딩 및 방출(유전자)

상기 실시예 2)의 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))에 siRNA 로딩 시험은 FITC(fluorescein isothiocyanate) 결합 siRNA를 사용하여 수행하였다. 먼저, siRAN의 최대 로딩 효과를 위한 최적 혼합 비율을 찾기 위하여, 10 ㎍ FITC-siRNA를 1 ㎖의 방출 배지(RNase-free TE buffer)와 함께 다양한 양(10, 20, 50 및 100 ㎍)의 각 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))와 혼합하였다. 이때, 결과물의 RNA와 나노입자의 비율은 1:1, 1:2, 1:5 및 1:10이었다. 시험결과 1:5의 비율이 가장 높은 로딩 효율이 있음을 확인하여, 다음 시험에 사용하였다. 10 ㎍의 siRNA를 상온에서 50 ㎍ 나노입자(각각 BGn1(A) 및 BGn2(A))와 다양한 시간(30분, 1시간 및 2시간) 동안 혼합하였다. 로딩양 분석을 위하여, siRNA-나노입자 혼합물을 4℃에서 10,000 rpm으로 원심분리하고 상청액을 수집하였다. 수집한 상청액은 SpectraMax M2e multi-detection microplate reader(Molecular devices, USA)를 사용하여 210 nm 흡광도에서 siRNA 양을 분석하였다.

한편, siRNA 방출 확인을 위하여, 상기 siRNA를 로딩한 각 나노입자(siRNA-BGn1(A) 및 siRAN-BGn2(A))를 10 ㎖ 방출 배지(Rnase-free TE buffer)에 분산시키고, 37℃에서 다양한 시간점(최대 포화점까지) 동안 저장하였다. 10,000 rpm에서 원심분리하여 상청액을 수집한 후 multi-detection microplate reader로 분석하였다. 상기 로딩 및 방출 분석 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10a에 나타난 바와 같이, 각 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A))에 siNRA 로딩 시작 후 약 2시간 지난 시점에서 siRNA 최대 로딩 양을 나타내었으며, siRNA 최대로딩 양은 각 나노입자(BGn1(A) 및 BGn2(A)) 50 ㎍ 당 1.93 ㎍(초기 로딩의 ~19%) 및 2.59 ㎍(초기 로딩의 ~26%) 이었다. 각 나노입자의 로딩 효율은 BGn1(A)는 3.86%이었으며, BGn2(A)는 5.18%으로 나타났다. 상기의 분석 결과로부터 확인된 로딩 조건(siRNA:나노입자=1:5, 로딩 시간=2시간)을 이후 유전자 전달 및 세포 연구에 사용하였다.

또한, 도 10b에 나타난 바와 같이, BGn2(A)로부터 siRNA 방출은 3일째까지 선형 증가 패턴을 보였으며, 방출 양은 초기 로딩 총량의 약 45%에 해당하였다. 이 방출 프로필은 siRNA 전달에서 BGn2(A) 시스템의 잠재적인 가치와 적어도 이 기간 동안의 유전자 조절을 할 수 있음을 의미한다.

3) siRNA 전달 시스템

상기 실시예 2)에서 제조한 나노입자의 유전자 전달체로서의 이용 가능성을 확인하기 위하여, 상기 실험예 4-2) 결과 siRNA의 높은 로딩 효과를 보인 BGn2(A)를사용하여 siRNA-나노입자 세포 이입 분석과 gene silencing 기능적 활성을 확인하였다.

인간 bcl-2 mRNA로 FITC 결합된 AccuTarget Validated siRNA 종(Bioneer, South Korea)을 이용하였다. 음성 대조군으로, 동일한 뉴클레오티드(nucleotide)를 비유전자 화합 형성을 위하여 스크램블하고 FITC와 결합시켰다(scRNA). siRNA 형질주입 혼합물로, Opti-MEM(Invitrogen, USA) 내에 siRNA(bcl-2-siRNA 또는 scRNA) 로딩된 BGn2(A) 10 ㎍을 사용하였다. HeLa 세포를 6-well plate의 well에 주입(1×10⁵ cells)하고 형질주입 혼합물(bcl-2 siRNA-BGn2(A) 또는 scRNA-BGn2(A))을 각 well에 첨가하였다. 그리고 4시간 동안 배양하였다. 음성 대조군으로, free siRNA(나노입자에 로딩하지 않은 siRNA) 1 ㎍/㎖을 형질주입으로 사용하였다. siRNA 형질주입 후, 세포를 수집하고 다음 실험에 사용하였다. bcl-2 mRNA 발현 정량화를 위하여, 감염된 HeLa 세포를 α-MEM에서 배양하고 24시간 후에 수집하였다. 수집한 세포는 코팅 슬라이드 유리 위에 30분 동안 4% 파라폼알데하이드용액으로 고정한 후 4℃의 차가운 PBS로 세척하고 커버 유리 위에 마운팅하였다. 공초점 레이져 현미경(CLSM, model LSM 510, Carl Zeiss, Germany)으로 형광이미지를 관찰하고 분석하였다. 세포는 세포의 nucleus를 관찰하기 위하여 PI(propidium iodide, Invitrogen, USA) 대비 염색제로 착색하였다. 형질주입 효율 정량화를 위하여, 세포는 형광활성화세포분류-Calibur 세포 분류기(FACS-Calibur 세포 분류기, BD Biosciences, USA)를 사용하여 분석하였다. 각 샘플에서 10,000 세포의 데이터를 얻고 CellQuest Prosoftware(BD biosciences, USA)로 분석하였다. 상기 scRAN-BGn2(A) 복합체 및 bcl-2 siRNA(bcl-2 표적 유전자 siRNA)-BGn2(A) 복합체와의 비교실험을 위하여 대조군으로 비첨가(w/o), siRNA only(siRNA) 및 BGn2(A) only(BGn2(A))도 분석하였다. 분석결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 시험군인 scRNA-BGn2(A) 또는 siRNA(bcl-2 siRNA)-BGn2(A)의 경우, 상당수의 세포가 세포핵 특정 염료 PI에 대한 양성(붉은색) 착색 뿐 아니라 형광 FITC 염료에 대한 양성(초록색)으로도 착색되었음을 확인하였다. 그러나, 대조군인 w/o, siRNA 또는 BGn2(A)에서는 형광 FITC 염료에 대한 어떠한 반응(착색)도 보이지 않았다. 또한, FACS 분석 결과(도 9b), siRNA(bcl-2 siRNA)-BGn2(A) 또는 scRNA-BGn2(A) 복합체는 다른 대조군(<1%)과 비교하여 세포 내부로 상당한 형질주입 용량을 나타내었다(약 80%).

또한, 세포의 초미세구조를 측정하기 위하여, bcl-2 siRNA 로딩된 BGn2(A)로 감염된 세포를 수집하고 pH 7.2에 0.2 M PBS와 2% 파라폼알데하이드 및 2.5% 글루타알데하이드 혼합용액 내에서 8시간 동안 고정시켰다. 후-고정(post-fixation)은 1% 4산화오스뮴(osmium tetroxide)를 함유한 PBS 내에서 2시간 수행하였다. 그 후, 고정된 세포는 증가하는 농도(70%, 80%, 90%, 95% 및 100%)의 에탄올로 탈수소화하고 프로필렌옥사이드로 EMbed 812 수지(EMS, USA)에 내장시켰다. 그 후, ultramicrotome(Leica, USA)를 이용하여 초박절편을 얻고 우라닐아세테이트와 시트르산납으로 이중 염색하였다. 절편을 그리드 위에 착색시키고 80 kV 가속전압 H7000 TEM(Hitachi, Japan)으로 분석하였다. 분석결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타난 바와 같이, 100 nm 이하 크기의 많은 전자 밀집 나노입자가 골지체 및 조면소포체를 포함하는 세포내 조성물 주변의 세포질에 눈에 띄게 나타났으며, 아포토시스와 괴사와 같은 나노물질의 세포내 흡수와 관련된 세포의 긴장은 나타나지 않았다.

또한, gene silencing 효율 분석을 위하여, bcl-2 siRNA 로딩된 BGn2(A)로 처리된 세포내의 bcl-2 발현을 RT-PCR로 확인하였다. first strand cDNA는 RT-PCR용 SuperScript first strand 합성 시스템을 이용하여 총 RNA(2 ㎍)로부터 합성하였다. 반응 혼합물은 최대 50 ㎕까지 만들었다. RT-PCR은 SYBR GreenER qPCR SuperMix reagents(Invitrogen, USA)와 Bio-Rad iCycler를 이용하여 수행하였다. 상대적 전사물 양은 글리세르알데하이드-3-인산디히드로게나아제(GAPDH, endogenous reference gene)로 △△Ct법을 이용하여 계산하였다. 분석 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타난 바와 같이, 대조군(siRNA(89%), BGn2(A)(79%), scRNA-BGn2(A)(90%))과 비교하여, 15%까지 다운 조절된 현저한 효과를 나타내었다.

상기 실험예의 결과값은 평균±표준편차로 나타내었으며, 통계학적 분석은 ANOVA를 통해 수행하였으며 p<0.05를 유의적인 것으로 고려하였다.

Claims (11)

1) 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 헥사데실트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB)를 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하고, pH를 9 내지 13으로 조절하는 단계;
2) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;
3) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계;
4) 상기 반응 생성물을 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 제조하는 단계;
5) 상기 제조된 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 용매에 분산시킨 후 아민계 화합물을 첨가하고 교반하여 환류시키는 단계를 포함하며,
상기 산화칼슘 전구체는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate), 및 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물이고,
상기 실리카 전구체는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane) 및 APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물이고,
상기 아민계 화합물은 APTES(3-aminopropyl triethoxysilane) 및 AEAPMDMS(N(beta-aminoethyl)gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물인,
산화칼슘(CaO) 및 실리카(SiO2)를 포함하는 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 pH는 NH₄OH, NaOH, KOH 또는 Tris로 조절하는 것을 특징으로 하는,
표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법.

삭제

제1항에 있어서, 상기 단계 3)의 실리카 전구체 용액은 실리카 전구체를 무수 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올의 알코올 용액에 용해시킨 것인 것을 특징으로 하는,
표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법.

삭제

제1항에 있어서, 상기 단계 4)의 초음파 처리는 출력 전력 200 W 내지 240 W, 10 s on/ 10 s off 사이클로 15분 내지 25분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는,
표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법.

제1항에 있어서, 상기 단계 4)의 소성은 대기하에서 550℃ 내지 650℃ 온도범위에서 5시간 내지 7시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는,
표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법.

삭제

제1항에 있어서, 상기 나노입자는 실리카(SiO₂)와 산화칼슘(CaO)을 60:40 내지 95:5의 몰 비율로 포함하는 것을 특징으로 하는,
표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자의 제조방법.

제1항, 제2항, 제4항, 제6항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, 산화칼슘(CaO) 및 실리카(SiO2)를 포함하는 표면 아민화 메조다공성 생체활성유리 나노입자를 포함하는 약물, 유전자, 또는 단백질 전달용 조성물.

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