KR101684744B1

KR101684744B1 - 생체활성 유리 나노스피어를 포함하는 섬유 스캐폴드, 이의 제조방법, 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101684744B1
Application number: KR1020140182602A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 아메드 엘피키
Original assignee: 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2016-12-08
Also published as: KR20160073811A

Abstract

본 발명은 약물 또는 유전자와 같은 생체분자를 효과적으로 전달할 수 있는 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어에 약물이 탑재되어 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 골 재생용 인공 이식재에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 포함하는 섬유 스캐폴드 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 포함하는 섬유 스캐폴드는 생체분자를 안전하게 로딩 및 지속적으로 방출하는 효과를 제공한다.

Description

생체활성 유리 나노스피어를 포함하는 섬유 스캐폴드, 이의 제조방법, 및 이의 용도 {fibrous scaffolds containing bioactive glass nanosphere, preparation method and use thereof}

본 발명은 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 포함하는 섬유 스캐폴드, 그의 제조방법 및 그의 용도에 관한 것이다.

조직 공학용 스캐폴드는 이식거부, 세포독성, 염증반응 등을 유발하지 않는 생체에 적합한 성질을 가져야 할 뿐만 아니라 세포 주입 및 세포 증식 유도 효율이 높고 물질 전달이 용이한 것이 바람직하다.

이러한 점에서 생체고분자 재질의 3-D 열린 채널이 형성된 스캐폴드는 조직 공학을 위한 유망한 매트릭스 후보물질이다. 뿐만 아니라, 스캐폴드가 생체활성 분자를 전달할 수 있는 능력을 갖추었을 때, 조직 재생에 대한 잠재력은 현저히 향상된다. 줄기세포 또는 전구체 세포와 함께 스캐폴드를 생체 외 배양하는데 있어서, 스캐폴드에 결합된 치료적 분자들은 세포 증식을 향상시키고 계통-특이적 분화를 촉진할 수 있다. 나아가, 인공 스캐폴딩 매트릭스의 줄기세포 보충, 염증성 반응 억제, 신생혈관 형성 및 천연 세포(native cells)의 분화 및 성숙 등을 포함한 생체 내 치료적 기능은 현저히 향상될 수 있다.

폴리락트산(polylactic acid; PLA), 폴리글리콜산(polyglycolic acid; PGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone; PCL) 및 이들의 공중합체를 포함하는 생분해성 고분자는 이들의 상대적으로 낮은 독성, 조절가능한 분해도(controllable degradability) 및 다공성 스캐폴드 형태로 조직 공학 스캐폴드로의 제작의 용이성으로 인해 널리 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 바람직한 세포 및 조직 반응을 유도 또는 촉진하는 관점에서 이들 생분해성 고분자의 생물학적 활성은 잘 알려져 있지 않다. 이들 고분자의 생물학적 활성을 향상시키고자 하는 다양한 노력이 시도되고 있으며, 부착성 단백질과 같은 생물학적 활성 분자로 표면을 개질하는 것이 하나의 예이다. 또한 천연 고분자 또는 생물활성 무기물과 같은 생물활성 물질을 포함하는 조성물이 특히 경조직에 대한 유망한 전략으로 여겨지고 있다.

보다 열린 그리고 유망한 가능성은 고분자 스캐폴드 내에 치료적 분자를 조합 또는 봉입하는 것이며, 이는 최근 지대한 관심을 끌고 있는 분야이다. 합성 고분자는 주로 유기 용매에서 가공할 수 있으므로, 공정 과정 동안 스캐폴드 내에 직접 봉입할 수 있는 생물활성 분자에 대한 선택의 폭은 크게 제한된다. 수가용성 구획에 예컨대, 마이크로/나노입자 내에 생물활성 분자를 선-봉입(pre-loading)하여 간접적으로 결합(incorporation)되도록 하거나, 고분자 스캐폴드의 표면을 적당한 조성의 생물활성 분자로 코팅하는 단계를 포함하는 몇 가지의 방법이 있다. 이러한 방법들은 이들 생물활성 분자를 상당히 조절 가능한 방법으로 봉입하고 방출할 수 있으며, 결과적으로 시험관 내 세포 거동에 대한 및/또는 조직 재생 모델에서 치료 작용을 도출할 수 있음을 보여준다.

본 발명자들은 최근 골 재생을 위한 섬유 형태를 가진 다양한 나노 복합소재 스캐폴드를 개발해왔다. 합성형 또는 천연형과 같은 생체고분자 기질의 종류에 따라, 무기 나노 복합소재의 혼합은 최적화 될 필요가 있다. 최적화는 인시츄(in situ) 침전, 계면활성제-매개 봉입체(inclusion) 및 직접 균질화를 적용하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 나노입자, 생체 활성 유리 나노섬유 및 칼슘 카보네이트 나노입자를 포함하는 사용된 나노 복합소재 형태 중에서, 나노스피어(nanosphere)의 메조다공성 형태는 치료 분자를 로딩하고 그 다음 전달하기 위한 플랫폼으로 사용하는데 특별한 장점을 가진다. 사실, 메조다공성 실리카 나노입자는 미세 조정된 중간공극도(mesoporosity) 및 이에 따라서 약물 전달 능력을 가지는 가장 널리 연구된 나노물질 형태이다. 이를 기반으로, 본 발명자들은 최근 높은 메조다공성을 가진 메조다공성 생체 활성 유리 나노스피어(mBGn)를 개발하였다. 이들의 표면 활성 및 이온(칼슘 및 실리콘) 방출 때문에, mBGn은 적절한 용량에서 세포 반응을 자극하고 무세포성 무기화를 촉진하는 것을 보여왔다. 더욱이, mBGn은 소분자성 항생제, 단백질 및 유전적 분자를 포함하는 치료 분자들을 수용하는데 효과적이며, 이는 우수한 나노스피어 플랫폼으로서 이들의 잠재력을 보여준다.

그러나, 생체 이식 시 우수한 골 재생 능력과 함께 치료용 약물의 장기간 방출을 통해 골 재생 효과의 극대화를 달성할 수 있는 치료용 스캐폴드의 필요성이 여전히 존재한다.

Rachel A. Caruso et al, ACS Appl. Mater. Interfaces 2013, 5, 10926-10932

이에, 본 발명자들은 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어(mBGn)의 다면적인 잠재력, 즉 우수한 골 재생 능력을 가지면서 골 재생 약물을 장기간 동안 전달할 수 있는 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어 및 생체고분자를 포함하는 치료용 나노 복합소재 섬유 스캐폴드를 제공하는 것을 목표로 하였다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명의 제1양태는 젤라틴 및 PCL을 포함하는 생체고분자; 및 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어(mBGn)를 포함하는 섬유 스캐폴드를 제공한다.

섬유 스캐폴드는 젤라틴 및 PCL을 포함하는 생체고분자 용액에 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 첨가하여 전기 방사 기술을 이용하여 제조될 수 있으며, 상기 젤라틴 및 PCL은 1:3 내지 3:1의 중량비로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 약 1:1의 중량비로 사용될 수 있다.

표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노캐리어는 생체고분자 전체 중량에 대하여 1 내지 15중량%일 수 있으며, 바람직하게는 2.5 내지 10중량%이다. 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노캐리어의 함량이 15 중량%를 초과하는 경우, 섬유 스캐폴드가 너무 부서지기 쉬우며(Brittle) 역학적 물성이 많이 저하될 우려가 있으며, 1 중량% 미만인 경우에는 생체활성 유리 나노스피어의 효과적 역할을 기대하기 어렵다.

상기 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어는 실리카(SiO₂)와 산화칼슘(CaO)을 60~80 : 20~40의 몰 비율로 포함할 수 있으며, 더 바람직하게는 실리카와 산화칼슘의 몰 비율이 약 75:25이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 실리카와 산화칼슘의 몰 비율이 75:25일 때 가장 용이하게 구형의 입자를 형성한다.

상기 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어의 제조방법은

a) 졸-겔 방법을 사용하여 PEG 또는 CTAB를 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계;

b) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;

c) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하여 반응 생성물을 제조하는 단계;

d) 상기 반응 생성물을 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성 유리 나노캐리어를 제조하는 단계; 및

e) 상기 제조된 메조다공성 생체활성 유리 나노캐리어에 아민계 화합물을 첨가하여 표면을 아민기로 관능화시키는 단계를 포함한다.

상기 단계 a)은 메조기공을 갖는 나노스피어를 제조하기 위하여 자기조직화 고분자 템플레이트 용액을 제조하는 단계로서, 졸-겔 방법을 사용하여 PEG 또는 CTAB를 용해시킨다. 상기 단계는 염기성 분위기 하에서 이루어지며, pH를 9 내지 14로 조절할 수 있다. 상기 pH는 NH₄OH, NaOH, KOH 또는 Tris로 조절하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 템플레이트 용액은 무수 메탄올 용액에 상기 고분자 템플레이트를 용해시켜 제조할 수 있다.

상기 단계 b)는, 템플레이트 물질에 산화칼슘을 형성시키기 위하여, 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하고 교반하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계이다. 상기 산화칼슘 전구체는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate) 또는 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide)인 것이 바람직하다.

상기 단계 c)은, 템플레이트 물질에 목적하는 무기물을 형성시키기 위하여, 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하면서 초음파 처리하고 교반하여 반응 생성물을 제조하는 단계이다. 상기 실리카 전구체 용액은 실리카 전구체를 무수 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로파놀의 알코올 용액에 용해시킨 것이 바람직하며, 상기 실리카 전구체는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyl diethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane) 또는 APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 초음파 처리는 출력 전력 200 W 내지 240 W, 10 s on/ 10 s off 사이클로 5분 내지 30분 동안 수행하는 것이 바람직하다.

상기 단계 d)는, 반응 생성물에서 템플레이트를 제거하여 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 수득하기 위하여, 상기 반응 생성물을 4500 rpm 내지 5500 rpm으로 원심분리한 후 세척하고 건조 및 소성하는 단계이다. 상기 세척 후에 탈이온수로 세 차례 그리고 무수 에탄올로 두 차례 재분산시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 건조는 60℃ 내지 80℃ 온도범위에서 10시간 내지 24시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 소성은 대기 하에서 550℃ 내지 650℃ 온도범위에서 1시간 내지 8시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

상기 단계 e)는, 상기 단계 d)에서 제조된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어 표면을 아민 기능기화하여 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 수득하기 위하여, 상기 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 용매에 분산시킨 후 아민계 화합물을 첨가하여 교반하여 환류시키는 단계이다. 상기 아민계 화합물은 APTES(3-aminopropyl triethoxysilane) 또는 AEAPMDMS(N(beta-aminoethyl)gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane)인 것이 바람직하다. 상기 환류는 50℃ 내지 100℃ 온도 범위에서 5시간 내지 20시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 환류 후에 세척 및 건조 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 건조는 70℃ 내지 90℃ 온도범위에서 10시간 내지 30시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제2양태는 1) 트리플루오로에탄올(trifluoroethanol, TFE)에 젤라틴 및 PCL을 혼합하여 생체고분자를 제조하는 단계; 및

2) 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 상기 생체고분자에 첨가하는 단계를 포함하는, 섬유 스캐폴드의 제조방법을 제공한다.

상기 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어는 상기 제1양태의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제3양태는 스캐폴드를 포함하고, 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어에 약물이 탑재되어 있는, 약물을 지속적으로 방출하는 골 재생용 인공 이식재를 제공한다.

본 발명의 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어는 생체분자 전달체로서 기능할 수 있으며, “생체분자(biomolecule)”는, 생물체를 구성하거나 생물의 기능을 담당하는 특수 분자를 의미하며, 핵산, 단백질, 다당류 등이 있다. 본 발명의 생체분자는 화학적 약물 또는 유전자인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 본 발명의 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어는 덱사메타손 생체분자의 전달체로서 유효하며, 그 이외에 표면전하가 Negative를 띄고 있는 약물은 모두 본 발명의 생체분자로 사용될 수 있다.

본 발명의 골 재생용 인공 이식재는 초기 24시간 이내에 탑재된 약물양의 약 35%가 빠르게 방출된 후, 탑재된 약물양의 약 35%가 5주간 추가로 지속적으로 방출되는 2단계 약물 방출 패턴을 나타낼 수 있다.

본 발명의 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어는 미세한 입자 크기, 균일한 기공 크기와 높은 비표면적을 가지며, 생체분자를 안전하게 로딩 및 방출하는 효과가 있다.

또한, 본 발명의 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 포함하는 섬유 스캐폴드는 우수한 골 재생 능력과 함께 약물을 지속적으로 일정하게 방출하는 효과를 나타내어 골 재생 효과를 극대화할 수 있다.

도 1에서 (a)는 덱사메타손을 로딩한 mBGn이 혼합된 치료용 나노 스캐폴드를 보여주는 도면이고, (b)는 아민화된 mBGn에서 추가적인 질소 피크를 보여주는 TEM 사진이며, (c)는 XPS 분석을 나타낸 것이다.
도 2는 전기 방사에 의해 생산된 다양한 mBGn 성분(0, 2.5, 5 및 10%)이 혼합된 치료용 섬유의 특성을 나타내는 것으로, (a) SEM 및 (b) TEM으로 형태를 관찰하였다. 잘 발달된 섬유 네트워크는 모든 구성에서 나타났고(a), 단일 섬유의 TEM 사진은 섬유 기질 내에 mBGn이 혼합된 것을 보여준다(b). 추가적인 Si-O-Si 띠를 보여주는 표본의 FT-IR 스펙트럼은 mBGn 혼합에서 나타났다(c). (d)는 최초에 혼합된 mBGn 양에 대응하는 잔류 중량을 나타내는, 온도 증가에 따른 중량 감소를 보이는 표본의 TG 분석을 나타낸다.
도 3은 0%, 2.5%, 5% 및 10% mBGn이 혼합된 치료용 섬유 스캐폴드의 장력의 기계적인 특성을 나타내는 것으로서, 스캐폴드 표본의 통상적인 응력 변형 곡선(a), 응력 변형 그래프에 기초하여 장력(b), 탄성력(c) 및 신장 %(d)를 확인하였다. 데이터는 평균 ± S.D로 나타내었고 다섯 개의 반복 표본으로부터 얻었다.
도 4에서 (a)는 mBGn(0%, 2.5%, 5% 및 10%)이 혼합된 치료용 섬유 스캐폴드의 물 접촉각과 물 방울 사진을 그래프로 나타내었다. (b)는 시간에 따른 섬유 스캐폴드의 가수분해를 28일까지의 기간 동안 PBS에서 측정하여 나타내었다. (c) 및 (d)는 ICP-AES 분석에 의해 정량화한 노출된 mBGn 및 10% mBGn 섬유 스캐폴드로부터의 Si 및 Ca 이온 방출 프로파일을 각각 나타낸다.
도 5는 간단하게 래트 치주인대 유래 줄기세포(rPDSC)를 이용해 평가한, 다른 구성으로 생산된 섬유 스캐폴드의 세포 적합성을 나타낸다. 스캐폴드에서 배양 14일 후, 세포의 SEM(a) 및 형광(b) 사진을 나타내었다.
도 6은 약물 로딩 및 방출 실험을 나타낸 것으로, (a) mBGn에 덱사메타손 로딩양은 고정된 mBGn 함량에서 덱사메타손 농도를 변화시켜 기록하였다. 로딩 포화는 mBGn mg당 ~0.61mg 덱사메타손으로 관찰되었다. (b) mBGn에 덱사메타손 로딩을 보이는 표본의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것으로, 특징적인 덱사메타손 띠를 화살표로 표시하였다. (c) 24시간 내에 빠른 방출을 보이는, mBGn으로부터 덱사메타손 방출 프로파일을 나타낸 것이다. (d) 일주일에서 한달 이상의 고도의 지속가능한 방출을 보이는 두 단계의 방출 양상을 가진 2.5% mBGn 섬유 스캐폴드로부터의 덱사메타손 방출을 나타낸 것으로, (e)에서 재구성하였다. 덱사메타손 로딩 곡선은 랭뮤어 등온선 구성(그래프에서 파라미터로 보여짐)에 잘 부합한다. 덱사메타손 방출 데이터는 또한 리트거-페파스(Ritger-Peppas) 모델을 참조하여 구성하였으며, 2차 체제(2^nd regime)는 선형성에 잘 부합할 수 있다.
도 7은 섬유 스캐폴드에 대한 in-vitro rPDSC 반응을 나타낸 것으로, (a) 세포 부착 수준, (b) CLSM에 의한 세포 부착 형태, (c) 세포 증식 수준 및 (d) CLSM에 의한 세포 증식 형태를 나타낸다.
도 8은 ALP 활성 수단에 의해 대표적으로 평가된, rPDSC의 골 생성에서의 효과를 나타낸다. (a) 7일 및 14일 동안 스캐폴드 표본에서 배양한 직접 실험, 및 (b) 나노 복합소재 섬유 스캐폴드로부터 방출된 덱사메타손의 치료 효율을 확인하기 위해 수행된, 추출물을 이용한 간접 실험이다. 처음 7일 세포 결핍(1^st-7 일) 또는 그 다음의 7일(2^nd- 7일) 동안 세포가 없는 배양액에 삽입된 섬유 스캐폴드로부터 제조한 추출물과 함께 세포를 접종하였고, 세포의 ALP 활성을 배양 7일 후에 평가하였다(*p < 0.05, **p < 0.01, n = 3, ANOVA 다음으로 피셔 포스트-혹(Fisher post-hoc)).
도 9는 래트 피하 모델에서 덱사메타손이 있거나 없는 스캐폴드의 조직 접합성을 나타낸 것으로, 이식 4주 후, 조직 표본에 H＆E 및 MT 염색을 하고 사진을 찍었다.
도 10는 래트 두개골 모델에서 평가된 덱사메타손을 방출하는 치료용 섬유 스캐폴드의 인비보 골 재생 능력을 나타낸 것이다. 이식 6주 후, (a) 마이크로-CT 사진을 분석하고, (b) 골 부피 및 (c) 골 표면 밀도를 분석하였다(*p < 0.05 vs. 대조군, ^#p < 0.05 vs. 0%, ⁺p < 0.05 vs. 2.5%, n = 3, ANOVA 다음으로 피셔 포스트-혹).
도 11은 두개골 결함에 이식된 표본의 조직학적 사진을 H＆E 염색 후 가시화하였다. 어두운 화살표는 결함 공간을 가리킨다. 약어는 종래 골(OB), 새로운 골(NB), 골아세포(Ob), 골세포(Oc) 및 잔기둥(T)이다. 2.5mBGn+덱사메타손 군은 통상적인 신생 골 구조를 보여주기 위해 확대하였다.

본 발명은 하기 실시예에 의하여 보다 구체화될 것이고, 하기 실시예는 본 발명의 구체적인 예시에 불과하며 본 발명의 보호범위를 한정하거나 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어 및 나노 복합소재 섬유 스캐폴드의 제조

나노 캐리어 및 스캐폴드를 위한 재료로서, 테트라에틸 오쏘실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS, C₈H₂₀O₄Si, 98%), 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate, Ca(NO₃)₂·4H₂O, 99%), PEG(poly(ethylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, (C₂H₄)_nH₂O, M_n=10000), 수산화암모늄(ammonium hydroxide, NH₄OH, 28.0% NH₃ 수용액, ≥ 99.99% 금속 기반), 무수 메탄올(methanol anhydrous, CH₃OH, 99.8%), 젤라틴 (겔, 우피(bovine skin) 유래 타입 B), APTES(3-aminopropyl triethoxysilane, 3-아미노프로필 트리에톡시실레인, C₉H₂₃NO₃Si, ≥ 98%), 무수 톨루엔(anhydrous toluene, C₇H₈, 99.8%), PCL(poly (ε-caprolactone), 폴리 ε-카프로락톤, M_n = 70,000 -90,000), TFE(2,2,2-trifluroethanol, 2,2,2-트리플루오로에탄올, CF₃CH₂OH, ≥ 99%), 유사 생체 용액(simulated body fluid, SBF), 트리스 하이드록시메틸 아미노메탄(tris(hydroxymethyl aminomethane, Tris-buffer), 1N 염산 및 인산완충용액(PBS) 정제는 모두 시그마-알드리치로부터 구입하였으며 어떤 추가 정제 없이 구입한 상태로 사용하였다.

덱사메타손 21-인산 다이소듐염 (DEX, C₂₂H₂₈FNa₂O₈P, ≥ 98%, Sigma-Aldrich)은 모델 약물로서 사용하였다. 초고순도 탈염수(18.2 MΩ.cm, Millipore Direct-Q system)를 전반적으로 사용하였다.

(1) 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어의 제조

잘 발달된 구형 형태 및 메조 다공성 구조를 갖는 메조 다공성 생체 활성 유리 나노스피어(mBGn)는 종래 기술된 것처럼 초음파 보조 염기 촉진 졸-겔 방법(ultra-sound assisted base-catalyzed sol-gel method)을 이용하고 PEG를 템플레이트로 하여 제조하였다. 유리 제조를 위해 75% SiO₂/ 25% CaO (mol%) 구성을 이용하였다. 통상적인 합성으로 5g의 PEG를 120ml의 무수 메탄올에 자석 교반으로 용해시키고 용액의 pH는 NH₄OH를 첨가하여 12.5로 조정하였다. 다음으로, 0.299g의 Ca(NO₃)₂·4H₂O를 첨가하고 격렬하게 교반하여 용해시켰다. 독립된 유리병(vial)에 0.793g의 TEOS를 30ml의 무수 메탄올에 희석시키고, 20분 동안 격렬하게 교반시키는 동시에 고전력(high power) 초음파에 적용하는 동안 pH가 조정된 용액에 드롭 방식으로 첨가하였다. 24시간 격렬한 자석 교반 후 얻어진 백색 침전물을 분리하고 물/에탄올을 이용하여 5000rpm으로 5분간 원심분리하고 다시 녹이는 방식으로 세 번 반복하여 세척한 후, 70°C에서 밤 새 건조시켰다.

PEG 템플레이트를 제거하기 위하여, 건조 분말을 1°C/min의 가열 속도 및 최종 온도 600°C 조건으로 공기 중에서 5시간 동안 600°C에서 가열하였다. 가열한 나노 분말은 나중에 사용하기 위해 진공 상태로 보관하였다. 다음으로 가열한 나노 분말은 -NH₂ 그룹으로 표면을 관능화시켰다. 간략하게, 100mg의 나노 입자를 50ml의 무수 톨루엔에 녹이고 80°C에서 12시간 동안 1ml의 APTES로 교반하는 조건에서 환류시켰다. NH₂로 관능화된 나노 입자는 그 후 원심분리로 수거하고 80°C 진공 상태로 24시간 최종 건조하기 전에 톨루엔으로 세척하였다.

(2) 나노 복합소재 섬유 스캐폴드의 제조

섬유 스캐폴드는 전기 방사(electrospinning) 기술을 이용하여 제조하였다. 생체고분자 섬유를 위해, TFE에 10 중량%의 젤라틴 또는 10 중량%의 PCL 용액을 40°C, 자석 교반 조건에서 각각 제조하였고, 그 후 두 용액을 1:1 중량비로 섞어 완전히 균질화되도록 상온에서 잘 교반하였다. mBGn-첨가된 섬유를 위해서, 생체고분자 중량에 대해 2.5, 5 및 10 중량%의 mBGn을, TFE에서의 10 중량% 젤라틴 및 10 중량% PCL 용액에 각각 먼저 분산시키고, 상기 두 혼합물을 자석 교반 조건에서 잘 균질화시켰다.

제조된 복합 고분자 용액을 23-게이지 니들 팁(gauge needle tip)을 가진 10ml 플라스틱 주사기에 도입하고 고전압 DC 전원 장치(30 kV)를 사용하여 10.5kV로 작동하는 전기 방사 기계의 주사 펌프(1ml/hr의 주사 속도로 조정된)에 부착시켰다. 전기 방사섬유는 주사 바늘 팁으로부터 14.5cm거리에 위치한 회전 실린더(220 rpm)에 부착된 알루미늄 호일 시트(sheet) 위에 수집하였다. 마지막으로, 제조된 전기 방사섬유 시트(sheet)에서 어떤 잔류 TFE도 남지 않도록 완전히 증발시키고 나중에 사용하기 위해 진공 상태로 보관하였다.

PCL-젤라틴 성분에 다양한 함량(0, 2.5, 5 및 10%)의 mBGn을 첨가하여 제조된 섬유 스캐폴드의 SEM 사진(도 2의 (a) 참조)은 짠 것이 아니고(non-woven), 단일형태이며 비드가 없는 부드러운 표면을 가진 섬유 망을 명확하게 보여주었다. 스캐폴드의 TEM 사진은 중합체 기질에 잘 분산된 mBGn의 나노 입자로 된 형태를 보여준다(도 2의 (b) 참조). 섬유 스캐폴드의 FT-IR 스펙트럼은 mBGn에 관련된 특징적 띠를 보여주는데(455 cm^-1 및 1060 cm^-1 의 띠), 이는 mBGn 함량이 증가함에 따라 증가되었다(도 2의 (c) 참조). 상기 스캐폴드의 TG 분석은 PCL-젤라틴 유기 기질이 600°C 이하에서 어떠한 잔기도 남기지 않고(0% 남음) 완전히 타버린다는 것을 보여주었다. 하지만, mBGn-첨가된 스캐폴드는 ~400 °C 이후에 남은 중량을 보였다. 상기 남은 중량은 설계된 mBGn 함량이 증가함에 따라 증가되었다. 이러한 결과는 10% mBGn 까지는 전자회전 섬유 형태에 영향을 미치지 않고 PCL-젤라틴 기질에 첨가될 수 있다는 것을 증명한다.

실험예 1: 물리화학적 특성 분석

상기 실시예 1에서 제조한 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어(표본)의 표면 구성을 단색(monochromatic) Al K_α 자원(1486.6 ev)으로 진공, 약 10^-10토르 압력 조건에서 엑스선 광전자 분광계(XPS; ESCA 2000, V.G. 마이크로테크, UK)로 표면 아민화 전 및 후에 조사하였다. 표본의 표면 전하는 레이저 도플러 전기영동(LDE) 장비(제타사이저 나노 ZS, 맬버른 인스트럼먼트, UK)를 이용하여 ζ 표면 포텐셜 측정에 의해 조사하였다. 나노 입자의 메조 다공성은 N₂ 흡수-방출 측정 장치(쿼드라솝 SI, 퀀타크롬 인스트럼먼트, USA)로 확인하였다. 특정 표면 면적은 브루나우어-에메트-텔러(Brunauer-Emmett-Teller, BET) 방법에 따라 계산하였고, 기공 크기 분포는 비-지역 밀도 기능 이론(non-local density functional theory, NLDFT) 방법을 기반으로 상기 얻어진 N₂ 흡수-방출 등온선의 N₂ 방출 분기점으로부터 확인하였다.

상기 제조된 섬유 스캐폴드의 형태는 스캐닝 전자 현미경(SEM, JSM-6510, JEOL, 일본)에 의해 관찰하였다. 상기 표본의 나노규모의 형태는 에너지-분산 엑스선 분광계(EDX, 옥스포드 인스트럼먼트)를 장착한 고해상도 투과 전자현미경(HR-TEM, JEM-3010, JEOL, 일본)으로 관찰하였다. 표본의 상(phase)은 2°/min의 스캔 속도로 CuKα 방사선(λ = 1.5418A)을 이용하여 엑스선 회절(XRD, 리가쿠, 울티마 IV, 일본)로 분석하였다. 표본의 화학적 결합 구조는 GladiATR 다이아몬드 크리스탈 액세서리(PIKE 테크놀로지, USA)를 이용하여 4cm^-1의 해상도로 희석된 전체 반사율-Fourier 변환 적외선 스펙트라(attenuated total reflectance-Fourier transform infrared spectra, ATR-FTIR; 바리안 640-IR, 호주)로 조사하였다. 표본의 열반응은 10°C/min 가열 속도 및 40ml/min 질소 유속에서 열무게 분석(thermogravimetric analysis, TGA; TGA N-1500, 신코, 대한민국)으로 관찰하였다.

(1) 접촉각 및 분해 시험

섬유 스캐폴드의 표면 친수성은 벤치탑 피닉스 접촉각 측정 시스템(PHX300, SEO, 대한민국)을 이용하여 정적법(sessile drop method)으로 상온에서 물 접촉각 측정과 함께 평가하였다. 섬유 스캐폴드를 표본 고정 스테이지에 두고 주사 펌프에 연결된 니들로부터 자동적으로 전달된 탈이온수(2 μL) 한 방울을 표본 표면에 떨어뜨렸다. 물방울 사진은 비디오 카메라 시스템(CCD camera)을 이용하여 15초 이내에 기록하였으며 표면 접촉각은 좌우 접촉각의 수치를 제공하는 이미지 XP 소프트웨어를 이용하여 상기 사진을 기초로 계산하였다. 시험된 표본의 평균 접촉각 값을 사용하였다.

제조된 섬유 스캐폴드의 in-vitro 분해능은 인산완충용액(PBS, pH=7.4), 37°C에서 시험하였다. 정밀하게 무게를 잰 섬유 표본을 3일에 한번 PBS 용액으로 정기적으로 교체하면서 28일까지 각기 다른 기간으로 10ml의 PBS에 담궜다. 표본을 미리 결정된 시점에 추출하고, 탈이온수로 헹구고, 마지막으로 상온에서 공기 중에 잘 건조시켰다. 분해의 백분률은 담그기 전 및 후의 건조 중량으로부터 계산하였고, 담그기 전 표본의 건조 중량으로 표준화하였다. 섬유 스캐폴드 각 군의 세 개의 표본을 평가하고 평균값을 기록하였다.

물과의 접촉 각도 측정을 통하여, 섬유 스캐폴드의 친수성을 확인하였으며, 결과를 도 4a에 나타내었다. 물 접촉 각도는 mBGn 함량이 증가하면서 24.4°에서 15.7°로 점차 감소하였다. mBGn의 전하를 띈 친수성의 성질은 스캐폴드의 친수성을 향상시켰다.

스캐폴드의 가수분해를 4주까지의 기간 동안 PBS 용액에서 시험하여 그 결과를 도 4b에 나타내었다. 분해는 모든 구성에서 시간에 따라 점차 발생하였으나, 분해 속도는 mBGn 함량이 증가함에 따라 증가하였다. 결과적으로, 4주 후, 순수한 중합체 스캐폴드는 ~21%가 분해되었으나, 10% mBGn 스캐폴드는 ~31%가 분해되었다. 상기 나노 복합소재의 분해는 증가된 친수성과 그에 따른 수분 침투 및/또는 mBGn 자체의 직접 용해 때문에 향상된 것일 수 있다.

(2) 기계적 특성

나노 섬유 스캐폴드 장력의 기계적인 특성은 500N 로드 셀(load cell)을 이용한 테이블탑 유니액시얼 시험 장치(tabletop uniaxial testing machine, INSTRON 5966, USA)를 사용하고 대기 조건, 10mm/min의 크로스-헤드(cross-head) 속도 조건에서 확인하였다. 모든 표본은 60mm x 10 mm x 0.5 mm(두께) 크기로 측정된 직사각형 모양에서 디지털 마이크로미터(미츠토요, 일본)를 이용하여 제조하였다. 나노 섬유망의 장력 시험은 40mm 게이지 길이로 수행하였으며 각 표본 군에서 적어도 다섯 개의 표본을 가지고 시험하였다. 응력-변형 곡선(stress-strain curve)을 기록하였고, 탄성률, 장력 및 신장%는 곡선을 기반으로 결정하였다. 다섯 번의 반복 측정을 수행하고 이의 평균을 구하여, 도 3에 나타내었다.

본 발명의 나노 복합소재 섬유 스캐폴드는 다른 스캐폴드들의 전형적인 응력 변형 곡선(stress-strain curve)과 유사한 양상, 즉 초반 탄성 지역(압력 < 0.05)을 보였고, 다음으로 유연한 변형을 보이다가 파괴(failure)되었다(도 3의 (a) 참조).

본 발명의 나노 복합소재 섬유 스캐폴드의 유연률은 mBGn 함량이 증가함에 따라 1.7 MPa에서 5.9MPa까지 증가하였다(도 3의 (b) 참조). 또한, 장력은 mBGn 함량이 5%까지 증가함에 따라 0.44MPa에서 0.66MPa까지 증가하였으며, 그 이상에서 상기 값은 급격히 감소하였다(0.3MPa)(도 3의 (c) 참조).

신장 %는 mBGn 함량이 증가함에 따라 76.1%에서 28.3%까지 점진적으로 감소하였다(도 3의 (d) 참조). mBGn의 첨가와 관련된 이러한 기계적 양상은 단단한 나노미립자를 가진 유연하지만 약한 중합체 기질의 나노 복합소재에서 보통 관찰되어왔다. 신장의 감소를 수반하는 단단함과 강함의 증가는 특히 단단한 조직 재생의 목적을 위해 이점으로 생각될 수 있다.

(3) 이온 방출

나노 복합소재 섬유 스캐폴드로부터 이온(칼슘 및 실리콘)의 방출을 ICP-AES로 4주까지의 기간동안 분석하여 도 4의 (c) 및 (d)에 나타내었다. 나노 입자 20mg 또는 섬유 스캐폴드 표본 200mg을 10ml의 트리스-염산 완충액으로 pH7.4에 맞춰진 탈이온수에 37°C 에서 28일까지 담궜다. 미리 결정된 시점에, 표본을 얻어 15000rpm에서 15분 동안 원심분리하고 고주파 유도 결합형 플라즈마 발광 분석법(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry, ICP-AES; OPTIMA 4300 DV, 퍼킨-엘머, USA)으로 특성 확인을 위해 상층액을 수집하였다. 표본은 세 번 반복하여 평가하였고 평균 값을 기록하였다.

대조군으로, 노출된(bare) mBGn으로부터의 이온 방출 또한 기록하였다. 노출된 mBGn로부터 이온 방출은 첫째 날 동안 매우 빠르고, 이후 방출양이 점차 증가하였다. 결과적으로, 약 6.2mM의 Si 이온 및 17.7mM의 Ca 이온은 4주 이상 방출되었다. 동일한 양의 mBGn(20mg)을 포함하는 스캐폴드 표본으로부터, 이온 방출은 노출된 mBGn으로부터 방출되는 것보다 훨씬 적었다: 4주 이상의 기간 동안 약 2.1mM의 Si 및 약 2.9mM의 Ca 이온. 주목할만한 것은, 초반에 다량이 방출되는 효과는 스캐폴드와 함께인 경우 관찰되지 않았는데, 이는 스캐폴드 표본으로부터 두 이온 모두 지속적으로 장기간 방출됨을 증명하는 것이다. mBGn이 PCL-젤라틴 기질에 들어갔을 때, 이온 방출은 노출된 mBGn으로부터 직접적으로 방출되는 것만큼 높지 않을 것이다. 상기 중합체 기질은 기질과 mBGn 표면 사이의 반응인 일련의 이온 방출 과정, 즉 기질로 물 분자의 확산을 느리게 한다. 하지만, Ca 및 Si 이온은 4주까지 꾸준하게 방출되었으며, 이는 mBGn이 느리기는 하지만 계속하여 용해된다는 것을 의미한다. 여기서, 방출된 Ca 및 Si 이온 모두의 농도가 수 mM이기 때문에 방출된 Ca 및 Si 이온이 일부 생물학적 효과를 가질 수 있다는 것에 주목해야 하고, 상기 농도 범위는 종래 Hench 등에 의해(Maeno S 등, 2005; Hench 등, 2009) 여러 골분화 유전자를 상당히 상향 조절하는 것으로 제안되어왔다. 다시 말해서, 첨가된 mBGn은 세포에서 골 형성을 위한 치료 역할을 가질 수 있다.

(4) 이온 적합성

본 발명자들은 나노 섬유 스캐폴드에서 세포 적합성을 간단하게 평가하였다. 도 5a 및 b는 각각 SEM 및 CLSM에 의해 14일째에 촬영한 대표적인 세포 성장 형태를 보여준다. 모든 스캐폴드에서, 세포는 섬유 구조를 따라 고도로 신장하는 세포골격 과정과 함께 잘 자라는 것을 보였고, 이는 모든 구성에서 세포 적합성이 바람직하다는 것을 나타낸다.

데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하고, 통계 분석은 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)를 이용해 수행한 다음 피셔 포스트-혹 시험(Fisher post-hoc test)을 하였다. 통계적 유의성은 p<0.05로 고려되었다.

하기 표 1은 표면 제타-포텐셜(zeta-potential) 값뿐 아니라 BET법으로 분석한 아민화 전 또는 후에 mBGn의 기공 특성(기공 크기, 특정 표면 면적 및 기공 부피)을 나타낸 것이다.

[표 1]

실험예 2: mBGn에 덱사메타손 로딩

다른 농도의 덱사메타손(5, 10, 15, 20, 25 및 30mg/ml)을 함유하는 증류수에 10mg/ml 농도로 나노스피어를 녹여 표면 아민화된 mBGn에 덱사메타손 약물의 로딩 수용력을 조사하였다. 덱사메타손 로딩양은 UV-vis 분광계(리브라 S22, 바이오크롬, UK)를 이용하여 확인하였다. 일련의 표준 덱사메타손 용액을 제조하고 덱사메타손의 검정 곡선을 람버트와 비어의 법칙(Lambert and Beers’ law)에 따라 0에서 100 μg/ml의 덱사메타손으로부터 얻었다:

A₂₄₂ = 0.027 C + 0.0437 (R² _DEX= 0.999)

여기서 A는 λ_max에서 흡광도이며 C는 농도(μg/ml)이다. 덱사메타손의 로딩 등온선은 다음의 질량보존식(mass balance equation)에 따라 덱사메타손이 흡수된 양으로부터 얻었다:

q _e = (C ₀ -C _e ) x (V/W)

여기서 q _e 는 mBGn mg 당 흡수된 덱사메타손의 양(mg)이며, C ₀ 및 C _e 는 각각 덱사메타손의 최초 및 평형 농도(mg/ml)이며, V는 용액의 부피(ml), 그리고 W는 사용된 mBGn 표본의 질량(mg)이다.

덱사메타손을 로딩한 mBGn나노스피어의 일 실시형태에 따른 모습을 도 1의 (a)에 나타내었으며, (b)는 고도의 메조 다공성 구조를 갖는 잘 발달된 나노스피어와 62.7nm ± 12.3nm(n = 350)의 평균 크기를 TEM 사진으로 나타낸 것이다. TEM-EDS 분석은 Si/Ca의 원자 비율 = 74/26 인 것을 보여주는데, 이는 최초 설계된 구성(Si/Ca = 75/25)의 Si/Ca 비율에 거의 부합한다. 나노스피어의 XPS 와이드 캐닝(canning)은 Si (2p: 104 eV, 2s: 155 eV), Ca (2p: 347 eV, 2s: 439 eV), O (1s: 530 eV) 및 C (1s: 285 eV)의 특징적 피크를 보여준다. N 1S의 결과로 나타나는 400eV에서 추가적 피크는 아민화된 나노스피어에서 확인되었고, 이는 표면 아미노 군의 존재를 나타낸다(도 1의 (c) 참조).

도 6의 (a)는 mBGn에 덱사메타손의 로딩 등온선을 보여준다. 덱사메타손 로딩양은 사용된 덱사메타손 농도가 5에서 15mg/ml일 때 0.286에서 0.627mg(mBGn 1mg 당)으로 점차 증가하였으며, 그 이후에는 정체기를 보였다. 상기에서 얻어진 로딩 등온선은 다음의 공식을 따른 변형된 랭뮤어(Langmuir) 등온선 모델에 부합한다:

q _e = q _m KC _e /(1+KC _e )

여기서 q_m은 최대 로딩양(mg/mg)이고, C _e 는 평형 농도이며, K는 속도 상수이다. 상기 실험 데이터는 R² = 0.976, K = 0.235 및 q _m = 0.707 mg/mg인 랭뮤어 모델에 매우 잘 부합한다(그래프 내에서도 보여줌). 표본들(순수한 덱사메타손 분말, 덱사메타손 결핍 mBGn 및 덱사메타손-로딩된 mBGn)의 FT-IR 스펙트럼은 덱사메타손-로딩된 mBGn에서 약 890 및 1668 cm^-1의 특징적인 띠를 보였다(도 6의 (b) 참조).

실험예 3: 약물(덱사메타손) 방출 실험

노출된(bare) mBGn으로부터 덱사메타손의 in-vitro 방출은 탈이온수에서 수행하였으며, 방출양은 덱사메타손 검정곡선을 이용하여 242nm UV 측정에 의해 정량화하였다. 0.286mg/mg 덱사메타손(28.6% DEX)을 로딩한 10mg의 mBGn을 50ml DW에 녹이고 각기 다른 기간 동안 37°C에 방치하였다. 미리 결정된 시점에, 덱사메타손 분석을 위해 방출 배지로부터 1ml을 덜어내었다. 그 후, 섬유 스캐폴드 표본으로부터 덱사메타손 방출을 수행하였다. 이를 위해, 섬유 스캐폴드에 대하여 5 중량% 농도의 덱사메타손을 로딩한 mBGn(mBGn 1mg 당 0.286mg의 덱사메타손)을 중합체 기질에 혼합하였다. 비교군을 위해, 덱사메타손 자체를 TFE-중합체 용액에 5 중량%로 녹여 섬유 스캐폴드 내에 직접 로딩하였다. 이후에, 덱사메타손을 로딩한 섬유 스캐폴드를 완전히 건조시키고 나중의 방출 실험을 위해 진공 상태로 두었다.

스캐폴드로부터 덱사메타손 방출은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정량화하였다. 각각의 섬유 스캐폴드 50mg을 10ml DW에 담그고 37 °C에서 방치하였다. 미리 결정된 시점에, 덱사메타손 분석을 위해 방출 배지 1ml을 얻고, 상기 배지는 1ml DW로 다시 채웠다. 수집된 표본은 일회용 주사기 필터(0.20m, 아반테크, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., 일본)로 분석 전에 여과시켰다. 상기 분석은 용매 전달 펌프(SP930D), 진공 디개서(a vacuum, degasser, SDV50A), 가변 파장 UV/VIS 검출기(UV730D), 컬럼 오븐(CTS30) 및 데이터를 얻기 위한 AutoChro-300 크로마토그래피 데이터 시스템을 장착한 HPLC 기기(ACME 9000 시스템, 영린 기기, 한국)로 수행하였다. 유속은 1ml/min으로 조정하고, 컬럼 온도는 37°C로 유지하였으며 UV 검출은 254nm에서 수행하였다. 상기 크로마토그래피에서 분리는 이동상으로서 물/아세토나이트릴의 혼합물(40:60 v/v)을 이용하여 바리안(Varian) C18 컬럼(150 x 4.6mm, 5 um)(VR-150)으로 수행하였다. 덱사메타손은 1.18 분의 평균 시간에서 검출되었다. 10-100 μg/ml 농도 범위에서 덱사메타손 표준 용액 세트를 다음과 같은 검정곡선을 달성하기 위해 제조하였다: A = 28.686C - 27.668 (R₂ = 0.9988, n = 3).A는 흡광도이고 C(μg/mL)는 농도이다.

덱사메타손 방출 데이터는 약물 방출의 기전을 확립하기 위한 코스메이어-페파스(Korsmeyer-Peppas) 지수방정식인 Q = kt ⁿ 에 부합하는데, 여기서 Q는 시간 t에서 방출된 약물의 백분률이며 k는 장비의 구조적 및 기하학적 특성을 결합시킨 상수이다. 발산 지수(diffusional exponent) n은 약물 수송 기전의 중요한 지표이다. n ≤ 0.43의 값은 약물 방출이 픽키안(Fickian) 확산에 의해 조절되는 것을 가리키며, 여기서 n ≥ 0.85의 값은 약물 방출이 부식(erosion) 기전에 의해 지배된다는 것을 시사한다. 0.43 < n < 0.85의 값에서는, 방출은 이례적인 것으로 설명되며, 이는 확산 및 부식의 조합이 약물 방출 조절에 기여한다는 것을 의미한다.

mBGn으로부터 덱사메타손의 in-vitro 방출을 UV-Vis 분광법으로 기록하여 도 5c에 나타내었다. 덱사메타손 방출은 초반 24시간 내에 거의 80%가 방출되어 매우 갑작스럽게 나타났다. 반면에, 덱사메타손-로딩된 mBGN(2.5%)은 섬유 스캐폴드에 혼합되었을 때, HPLC를 이용하여 덱사메타손 방출 시험을 수행하였다. 노출된 mBGn으로부터 덱사메타손 방출은 비교 목적으로 또한 포함하였다. 나노 복합소재 섬유 스캐폴드로부터 덱사메타손 방출은 두 단계의 패턴, 즉 24시간 내의 초기 빠른 방출 뒤에 28일까지 느린 방출을 보였다. 상기 두 단계를 개별적으로 구성하였다(도 6의 (e) 참조). 첫 번째 단계에서, 덱사메타손 방출은 24시간 내에 ~35%의 방출된 덱사메타손을 보이며 갑자기 일어났다(도 6의 (e) 참조). 두 번째 단계에서, 덱사메타손 방출은 R² = 0.984의 거의 선형 패턴으로 아주 지속적이었고, 이는 ~5주 이상이 될 때까지 ~35% 덱사메타손 방출을 이끌었다.

첫 번째 및 두 번째 단계의 덱사메타손 방출 데이터는 각각 멱법칙(power law) 및 1차 방정식(linear equation)에 잘 부합하였다. 속도 상수는 그래프에 요약하였다. 첫 번째 단계에서 초기 빠른 방출은 표면에 노출된 mBGn 또는 혼합 단계 동안 생체고분자 기질에서 미리 방출된 일부 덱사메타손 분자로부터 발생한 것으로부터 섬유 스캐폴드 표면에 느슨하게 부착된 약물 분자의 갑작스러운 효과를 반영한다. 그러나, 24시간 내의 갑작스러운 효과 후에 바로, 덱사메타손 방출의 0차 속도 양상은 아주 흥미로운 것이며, 이는 이상적인 약물 전달 시스템으로서 상기 스캐폴드의 잠재적 측면을 나타낸다. mBGn으로부터 덱사메타손 분리의 용이성 및 섬유 기질의 훌륭한 친수성은 포물선 패턴 또는 멱법칙을 따르지 않는 덱사메타손의 선형 방출을 야기하는 것으로 여겨진다. 덱사메타손 방출 실험에 기초하여, 친수성 생체고분자 기질 내에 덱사메타손을 미리 로딩한 mBGn을 혼합하는 접근은 로딩된 약물의 잠재적인 생물학적 효과를 위해 고려되어지는 패턴인, 장기간 0차 덱사메타손 방출을 이루는데에 매우 효과적이라는 것을 알 수 있었다.

실험예 4: 세포증식 및 골분화에서의 In-vitro 효과

(1) 래트로부터 초대 치주 인대세포(periodontal ligament cell) 배양

동물 세포 초대배양은 대한민국의 동국대학교 동물 관리 및 이용 위원회의 승인 후에 수행되었다. 래트 치주 인대(PDL) 세포를 5주령 수컷 스프라구-돌리(Sprague-Dawley, SD) 래트로부터 분리하였다. 간략하게, SD 래트의 네 개의 앞니를 뽑고 PDL 조직을 긁어내었다. 세척 후, 조직을 37°C, 5% CO₂의 습한 공기조건인 인큐베이터에서 1시간 동안 0.05% 콜라게나제 타입 I 용액으로 소화시켰다. 10% 소 태아 혈청(FBS), 100U/ml 페니실린 및 100mg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 α-변형된 최소 필수 배지(α-MEM)으로 이루어진 표준 배지에서 37 °C, 5% CO₂의 습한 공기 조건으로 24시간 배양한 후, 세포를 트립신 처리(0.05% 트립신)하여 수거하였고, 재현탁시켜 가득 찰 때까지 추가로 4일동안 배양하였다. 세포는 2-3일에 한번 신선한 배지로 계대 배양하였으며, 3-4 계대의 세포를 나중의 실험에 사용하였다.

(2) 직접적 및 간접적 세포 분석의 설계

세포 실험을 위해, 세 개의 다른 섬유 스캐폴드 군을 시험했다; 생체고분자 스캐폴드, 2.5% mBGn-첨가된 스캐폴드 및 2.5% mBGn (DEX)-첨가된 스캐폴드. 세포 실험에 앞서, 15 mm 넓이 x 15 mm 길이 크기의 표본을 제조하고 에틸렌 옥사이드 기체로 살균하였다. 세포와 스캐폴드 사이의 ‘직접’ 또는 ‘간접’ 상호작용을 가능하게 하기 위해 두 가지 배양 설계를 사용하였다. 직접 상호작용을 위해 세포를 스캐폴드 표본에 직접적으로 두었다. 5 x 10⁴ PDL 세포의 100 μl 부분 표본을 24-웰 접시의 각 웰에 장착된 각 스캐폴드 표본 위에 접종하였으며, 그 후 37 ^oC에서 2시간 동안 인큐베이터에 두었다. 그 다음에, 세포를 접종한 표본을 장기 배양을 위해 다른 배양 웰에 옮겼다. 간접 상호작용을 위해, 5 x 10⁴ PDL 세포를 24-웰 접시의 각 웰에 접종하였다. 세포 부착 2시간 후, 세포와 스캐폴드 표본 사이에 오직 배지 상호작용만 가능하도록, 스캐폴드 표본을 배양 웰 상층에 놓인 트랜스웰(Transwell) 삽입체 위에 두었다. 24시간 후, 세포 배양 배지를 덱사메타손 결핍 골분화 배지(표준 배지 조성에 더해 아스코빅산 및 베타-글리세로파이스페이트(beta-glycerophysphate) 함유)로 교체하고, 그 후 상기 배양 배지를 매일 교체하였다.

(3) 세포 증식 및 형태

미리 결정된 시점까지 세포를 배양한 후, 상기 세포를 스캐폴드 표본(직접 실험) 또는 배양 웰(간접 실험)로부터 트립신 처리하여 회수하였다. 세포 증식의 정량화는 두 가닥 DNA(dsDNA) 형광 키트(피코그린 정량화 분석 키트, 몰리큘라 프로브)로 평가하였다. 간략하게, 배양된 세포를 용해시키고, 다음으로 세 번의 냉각/해동 사이클을 거쳐 그 결과로 생긴 상층액을 수집하였다. 세포 용해물의 부분 표본(50 μl)을 96-웰 분석 접시에 첨가하고 (50 μl) 부피의 피코그린(Quant-iT 피코그린 분석 키트; 인비트로젠)을 각 웰에 첨가하였으며, 어두운 곳에 5분간 방치하였다. 각 군에서 세 개의 표본을 사용하였으며 데이터는 반복된 실험으로 평균을 내었다. dsDNA 표준 표본 및 실험 표본의 형광 방출 강도는 480nm에서 여기시키고(excited), 상기 형광 방출 강도를 520nm에서 측정하였다. 세포 증식 수준은 dsDNA 표준 용액의 계열희석으로부터 생산된 표준 곡선을 참고하였다.

세포 형태 관찰을 위해, 배양한 세포를 세척한 뒤 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 그 다음 0.2% 트리톤 X-100을 처리하였다. 비특이적 단백질 결합을 막기 위해 1% 소 혈청 알부민 용액(w/v)을 30분 동안 처리하였다. 그 다음, F-액틴 및 핵 염색을 위해 알렉사 플루오르 488이 결합된 팔로이딘(phalloidin) 및 4’,6-다이아미디노-2-페닐인돌(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)가 있는 ProLong Gold 안티페이드(antifade) 시약을 사용하였고, 형광 현미경(IX71, 올림푸스, 도쿄, 일본)을 통해 세포를 관찰하였다. 디지털 카메라가 장착된 도립 현미경을 이용하여 형광 사진을 얻었다.

(4) 알카린 포스파타제(alkaline phosphatase) 확인에 의한 골분화 실험

PDL 세포의 골분화를 확인하기 위해 알카리 포스파타제(ALP)의 효소 활성을 보았다. 3, 7 및 14일 동안 배양 후, 세 번의 냉각/해동 사이클(-80°C에서 20분 동안 냉각한 직후 37°C에서 10분간 해동시킴)을 거친 뒤 세포 용해 완충액(0.2% 트리톤 X-100)을 첨가하여 각 표본으로부터 세포 용해물을 얻었다. 세포 용해물 표본(50μl)을 1.5M 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(2-amino-2-methyl-1-propanol), 20mM p-나이트로페놀 포스페이트(nitrophenol phosphate) 및 1mM 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride)가 같은 비율(1:1:1)로 함유된 50μl의 작동(working) 시약에 첨가하고, 상기 표본을 37°C에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 반응은 얼음에서 1N NaOH를 100μl 첨가하여 정지시켰고, 마이크로플레이트리더(microplate-reader, 아이마크, 바이오래드, CA, US)를 이용하여 405nm 흡광도에서 확인하였다. 상기 표본에 대한 판독은 p-나이트로페놀 스탁(stock) 표준을 이용하여 제조된 표준 ALP 활성으로부터 확인하였다. ALP 특이적 활성은 각 표본으로부터 생산되고 시간당 마이크로그램당 나노몰로서 발현된 dsDNA에 ALP 활성을 표준화함으로써 계산하였다. 각 실험은 세 개의 표본에서 반복하여 수행하였다(n = 3).

제작된 섬유 스캐폴드 내에 덱사메타손 분자의 효과적인 로딩 및 이들의 상당한 장기간 방출 양상을 확인한 후, 다음으로 관련있는 조직 세포를 이용하여 끌어내어진 생물학적 기능을 확인하였다. 이를 위해, 래트의 치아인대로부터 유래된 줄기세포(PDSCs)를 사용하였다. 막-유사 형태를 가진 섬유 스캐폴드는 유도된 골 재생 및 치주포켓(periodontal pocket)의 재건축을 위해 효과적인 것이라고 생각되어진다. 실험을 위해 세 개의 대표적 표본 군을 사용하였다; mBGn-결핍 스캐폴드(0%), 2.5% mBGn-첨가 스캐폴드 및 덱사메타손-로딩된 스캐폴드와 2.5% mBGn(2.5%+DEX). 먼저, 스캐폴드에 대한 in-vitro 세포 반응을 세포 부착 및 증식 측면에서 평가하였다. 모든 스캐폴드에서, 세포의 dsDNA 양(도 7의 (a) 참조) 및 핵이 염색된 세포 사진(도 7의 (b) 참조)으로 나타낸 것과 같이, 세포는 초기에 활발하게 부착된다(3시간 동안). 추가적으로, 10일째까지 배양된 세포는 밑에 있는 섬유 구조를 따라 확장된 세포골격 과정을 가지는 것을 보여준다(도 7의 (c), (d) 참조). 세포 부착 및 증식 단계의 스캐폴드 군 사이에는 거의 차이가 없다.

PDSC의 증식 능력에 덱사메타손이 상당한 효과가 없는 반면, 세포의 골분화 양상은 상당히 영향을 받는다. 골분화 지표로서, 세포의 알카리 포스파타제(ALP) 활성을 대표적 두 그룹(덱사메타손이 있거나 없는 2.5% mBGn)과 비교하여 확인하였다. 먼저, 7일 및 14일 동안 배양한 세포를 ALP 정량화로 분석하였다. 2.5%+덱사메타손 표본에서 배양한 세포는 특히 14일째에 상당히 높은 ALP 활성을 가졌다(도 8a). 상기 결과는 ALP 자극에서 스캐폴드로부터 방출된 덱사메타손의 효과의 가능성을 나타낸다. 본 발명자들은 상기 효과가 실제로 방출된 덱사메타손으로부터 나타나는지 설명하기 위해 더 실험하였으며, 이를 위해 섬유 스캐폴드로부터 추출물을 수집하고 배양 배지로서 추출물을 사용하였다. 추출물은 두 시점에서 수집하였다: 초기 7일(1^st - 7일) 및 그 다음의 7일(2^nd - 7일). 상기 추출물을 7일 이상 세포와 함께 배양하고 ALP 활성을 분석하였다(도 8의 (a) 참조). 상당히 높은 수준의 ALP가 추출물의 1^st 및 2^nd 시점 모두의 세포에서 생산되었다. ALP 자극이 두 시점에서 유사한 것은 주목할만한데, 이는 다른 시점에서 방출된 덱사메타손의 효과는 시간에 따라 그리고 그에 따른 덱사메타손 방출의 장기간 자극 가능성에 따라 매우 일정한 형태라는 것을 시사한다.

실험예 5: In-vivo 골 재생 모델에서의 효능

(1) 래트 피하 모델에서의 조직 적합성

두 개의 대표적인 섬유 스캐폴드(덱사메타손이 존재하거나 존재하지 않는 조건의 2.5% mBGn)를 제조하고, 그 다음 외과 수술 전에 에틸렌 옥사이드로 살균하였다. 조직 적합성 실험을 위하여, 수컷 스프라구-돌리 래트를 사용하였다. 동물 실험은 단국대학교 동물 관리 및 이용 위원회의 승인을 받았다. 동물에서 모든 조작은 멸균조건으로 통상적인 마취 하에 수행하였다. 각각의 래트에 80mg/kg 체중의 케타민과 10mg/kg 체중의 자일라진(xylazine)을 근육내 주사하였다. 척추로부터 측면으로 등 부위에 네 개의 작은 피하 주머니를 가위로 만들고 상처 부위 내에 스캐폴드 검체를 두었다. 상기 절개된 부위를 4-0 비-흡수성 모노필라멘트 봉합(프롤렌)으로 봉합시키고, 표준 펠렛(pellet) 사료와 물을 임의로 제공하였다. 4 주째에, 상기 동물을 희생시켰다. 조직 표본을 회수한 다음, 24시간 동안 상온에서 10% 중화 포르말린(neutralized buffered formalin)에 담그고, 단계별 에탄올 시리즈(graded ethanol series)로 탈수시키고, 이등분하여, 파라핀에 고정시켰다. 조직 표본은 회전 마이크로톰을 이용하여 5mm 두께로 제조하고, 헤마톡실린 및 에오신(H＆E) 또는 메이슨 트리크롬(Masson’s trichrome, MT)으로 염색하였다.

덱사메타손-결핍 또는 덱사메타손-로딩 나노 복합소재 스캐폴드의 이식 4주 후에, 조직 표본을 H＆E 및 MT로 염색하였고, 스캐폴드를 둘러싸고 있는 영역 또는 스캐폴드를 침투한 지역의 세포 및 조직의 상태를 도 9에 나타내었다. 상기 스캐폴드와 관련된 아주 최소한의 염증 반응만 있을 뿐, 이식 기간 동안 조직 거부반응은 나타나지 않았다. 이는 생적합성 물질에서 일반적으로 발견되는 특성이며 제작된 치료용 스캐폴드에 대한 건강한 조직 반응을 가리키는 것이다.

(2) 래트 두개골(calvarium) 결함에 이식

종래 기술된 바와 같이, 래트 두개골 결함 모델에서 섬유 스캐폴드의 인비보 골-형성 능력을 조사하였다. 두개골 중앙 선형 피부 절개(linear sagittal midline skin incision)를 두개골에 만들고, 피부의 전층 두께 플랩(full-thickness flap) 및 골막을 들어올렸다. 두 개의 치명적-크기의 전층 두께 골 장애(5-mm 직경)를 생리식염수로 계속 적시는 조건에서 관상톱(trephine bur)을 이용하여 두개골의 각 두정골(parietal bone) 중앙에 만들었다. 각각의 두개골 결함에 스캐폴드만(2.5 mBGn) 또는 덱사메타손-로딩한 스캐폴드 군을 무작위로 채웠다. 상기 피하조직을 흡수 가능한 물질로 닫고, 피부 절개를 비-흡수성 물질로 봉합하였다.

수술 6주 후에, 상기 동물을 희생시키고, 조직 표본을 10% 중화 포르말린으로 상온에서 24시간 동안 고정시키고 마이크로컴퓨터 단층 촬영(tomography, μCT) 분석 및 조직학적 분석을 위해 제조하였다. 고정 후에, 새로운 골형성을 분석하기 위해 μCT를 이용해 사진을 찍었다. 회수된 검체를 μCT 스캐너(스카이스캔 1176; 스카이스캔, Aartselaar)를 이용하여 스캔하였다. 흥미있는 원통형 지역(cylindrical region of interest, ROI)은 결합부위 내 새로운 뼈를 완전히 에워싼 단일 결함의 중앙에 위치했다. 각 ROI 내에 새로운 골 부피 백분율 및 새로 형성된 골의 골 표면 밀도(1/mm)를 컴퓨터 분석 프로그램인 CTAn(스카이스캔)을 통해 총 골요소(섬유주(trabecular) 및 피질골(cortical bone))에 대한 한계점을 평가함으로써 측정하였다.

μCT 촬영 후, 회수된 표본을 조직학적 분석을 위해 제조하였다. 고정된 검체를 RapidCal^TM 용액(BBC 케미컬, 스탠우드)으로 칼슘을 제거하고, 에탄올 용액 시리즈로 탈수시키고, 다음으로 파라핀에 고정시켰다. 5 마이크로미터 두께의 섹션을 원형 장애의 중심 지역에 연속적으로 제조하고, 대표적 조직(representative histology)으로 정의하였다. 조직 표본을 회전 마이크로톰을 이용하여 5mm 두께로 제조하고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.

상기 표본의 3차원 사진은 결함 지역 내에 생산된 석회 조직을 보여준다(도 10의 (a) 참조). 새로 형성된 뼈는 골 정량(골 부피, 도 10의 (b) 참조) 및 정성(골 표면 밀도, 도 10의 (c) 참조)을 위해 더 분석하였다. 아무 것도 없는 대조군 또는 순수한 섬유 스캐폴드 군과 비교하여, 나노 복합소재 스캐폴드 군은 차이가 아주 상당하지는 않지만 골 부피 및 밀도에서 일부 증가를 보였다. 더욱이, 덱사메타손-로딩된 나노 복합소재 군은 상당히 높은 수준의 골 부피 및 골 표면 밀도를 보였다. 상기 결과는 섬유 스캐폴드 주변에 새로운 골 형성에서 덱사메타손 방출의 효과적인 역할을 보여준다.

본 발명자들은 도 11에 제공된 형성된 골 표본의 조직학적 사진을 더 조사하였다. 새로운 골 조직은 보통 결함 공간으로부터 중심부를 향해 자라며, 대조군 및 스캐폴드 단독 군에서는 일부 제한된 골 내방성장(ingrowth)이 나타나지만, 2.5%의 mBGn과 덱사메타손을 포함하는 군에서는 중심 부분에서 상당한 신생 골 형성을 보인다. 정밀한 검사로, 신생-골 조직 내부의 다수의 골아세포(osteoblast, ‘Ob’) 및 내부에 둘러싸인 골세포(osteocyte, ‘Oc’)가 밝혀졌다. 잔기둥(trabeculae, ‘T’) 내에서 활성 세포 과정은 기질 퇴적의 재생 과정 및 석회화를 더 나타낸다. 골 구조는 또한 아마도 이후의 재모델링 과정이 따르는, 몇 주 후에 성숙한 층판뼈(lamellar bone)가 될 수 있는, 미성숙 무층뼈(woven bone)의 상태를 설명한다.

Claims

젤라틴 및 폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL)을 포함하는 고분자; 및
표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어(mBGn)를 포함하고,
상기 젤라틴 및 폴리카프로락톤은 1:3 내지 3:1의 중량비인 것인, 섬유 스캐폴드.
삭제
제1항에 있어서,
상기 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어는, 고분자 전체 중량에 대하여 1 내지 15중량%인 것인, 섬유 스캐폴드.
제1항에 있어서,
상기 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어는 실리카(SiO2) 및 산화칼슘(CaO)을 60~80 : 20~40의 몰%로 포함하는 것인, 섬유 스캐폴드.
제1항에 있어서,
상기 스캐폴드는, 젤라틴 및 폴리카프로락톤을 포함하는 고분자 용액에 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 첨가하여 전기 방사시켜 제조된 것인, 섬유 스캐폴드.
제1항에 있어서, 상기 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어는
졸-겔 방법을 사용하여 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol, PEG)을 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계;
상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;
상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하여 반응 생성물을 제조하는 단계;
상기 반응 생성물을 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어에 아민계 화합물을 첨가하여 표면을 아민기로 관능화시키는 단계를 통해 제조된 것인, 섬유 스캐폴드.
제1항, 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 섬유 스캐폴드의 제조방법에 있어서, 상기 제조방법은
1) 트리플루오로에탄올(trifluoroethanol, TFE)에 젤라틴 및 폴리카프로락톤을 혼합하여 고분자를 제조하는 단계; 및
2) 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 상기 단계 1)의 고분자에 첨가하는 단계를 포함하는 것인,
섬유 스캐폴드의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어는;
a) 졸-겔 방법을 사용하여 폴리에틸렌글리콜을 용해시켜 템플레이트 용액을 제조하는 단계;
b) 상기 템플레이트 용액에 산화칼슘 전구체를 첨가하여 산화칼슘-템플레이트 혼합용액을 제조하는 단계;
c) 상기 산화칼슘-템플레이트 혼합용액에 실리카 전구체 용액을 첨가하여 반응 생성물을 제조하는 단계;
d) 상기 반응 생성물을 건조 및 소성하여 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어를 제조하는 단계; 및
e) 상기 제조된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어에 아민계 화합물을 첨가하여 표면을 아민기로 관능화시키는 단계를 포함하여 제조되는 것인,
섬유 스캐폴드의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 b)의 산화칼슘 전구체는 질산칼슘(calcium nitrate tetrahydrate), 염화칼슘(calcium chloride), 아세트산칼슘(calcium acetate) 또는 칼슘 메톡시에톡사이드(calcium methoxyethoxide)인 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 c)의 실리카 전구체 용액은 실리카 전구체를 무수 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 용해시킨 것인, 섬유 스캐폴드의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 c)의 실리카 전구체는 TEOS(tetraethyl orthosilicate), TMOS(trimethoxy orthosilicate), GPTMS((3-glycidoxypropyl)methyldiethoxysilane), MPS(3-mercaptopropyl trimethoxysilane), GOTMS(γ-glycidyloxypropyl trimethoxysilane) 및 APTMOS(aminophenyl trimethoxysilane)로 이루어진 군에서 선택된 것인,
섬유 스캐폴드의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 단계 e)의 아민계 화합물은 APTES(3-aminopropyl triethoxysilane) 또는 AEAPMDMS(N(beta-aminoethyl)gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane) 것인,
섬유 스캐폴드의 제조방법.
제1항, 제3항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 스캐폴드를 포함하고,
상기 표면 아민화된 메조다공성 생체활성 유리 나노스피어에 약물이 탑재되어 있는 것인, 약물을 지속적으로 방출하는 골 재생용 인공 이식재.
제13항에 있어서,
상기 골 재생용 인공 이식재는 초기 24시간 이내에 탑재된 약물양의 35%가 빠르게 방출된 후, 탑재된 약물양의 35%가 5주간 추가로 지속적으로 방출되는 2단계 약물 방출 패턴을 나타내는 것인, 골 재생용 인공 이식재.
제13항에 있어서,
성가 약물은 덱사메타손인, 골 재생용 인공 이식재.