KR101680786B1 - 골 재생용 생체 재료 및 이의 제조 방법 - Google Patents

골 재생용 생체 재료 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 골 재생용 생체 재료 및 이의 제조 방법은 천연 뼈와 구조적 또는 화학적 조성이 동일한 혈액 적합성과 세포조직 적합성이 뛰어난 생체 적합성 고분자 재료를 이용하여, 조골 세포를 활성화함과 동시에 파골 세포의 사멸을 야기하여 골 손실과 골다공증을 억제할 수 있으며, 잠재적으로는 골다공증뿐만 아니라 약물 전달 시스템의 개발에 유용하고 다양한 골 질환의 치료제로 이용되어 골 재생 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 골 재생용 생체 재료 및 이의 제조 방법은 일시적으로만 조골 세포를 활성화시키는 것이 아니라 생체 재료와 골 조직 사이의 상호작용을 촉진하면서도 세포 독성을 나타내지 않으며, 보다 오랜 시간 동안 조골 세포 및 파골 세포의 활성을 조절할 수 있다. 또한, 나노 입자들의 응집을 방지하여 원래의 입자 크기를 유지하면서도 고르게 분산되도록 하여 뛰어난 조골세포 증식 촉진 효과를 기대할 수 있으며, 우수한 골 재생 효과를 나타내므로 기존의 인공 골 대체물을 대신하여 골 재생을 위한 물질로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

골 재생용 생체 재료 및 이의 제조 방법{BONE REGENERATION BIOMATERIALS AND FOR MANUFACTURING METHOD THEREOF}
본 발명은 혈액 적합성과 세포조직 적합성이 뛰어난 생체 적합성 재료를 이용하여, 조골 세포를 활성화함과 동시에 파골 세포의 사멸을 야기하여 골 손실과 골다공증을 억제할 수 있으며, 잠재적으로는 골다공증뿐만 아니라 약물 전달 시스템의 개발에 유용하고 다양한 골 질환의 치료제로 이용될 수 있는 골 재생용 생체 재료 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 일시적으로만 조골 세포를 활성화시키는 것이 아니라 생체 재료와 골 조직 사이의 상호작용을 촉진하여 보다 오랜 시간 동안 조골 세포를 증식하는 효과를 가지고, 나노 입자들간의 응집을 방지하여 나노 입자의 입자 크기가 유지된 상태로 고르게 분산될 수 있게 하여 골 재생 효과를 보다 증대 시킬 수 있는 골 재생용 생체 재료 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
뼈는 인체를 지탱하며 동작을 수행하는 기계적 기능 이외에 체내의 칼슘이온 농도를 조절하는 역할을 하며, 골 수에서 인체에 필요한 적혈구 및 백혈구를 생산하는 중요한 생리적 기능을 한다. 뼈는 높은 기계적 강도를 가진 조밀한 구조인 피질골과 내부 스펀지와 같은 구조인 지주골로 이루어진다.
한편, 파골 세포(Osteoclast)는 뼈 조직의 흡수(분해)를 일으키는 세포로서, 모노사이트-마크로파지 계통의 전구세포가 파골 세포 분화인자인 랑클(RANKL)의 신호를 받으면 다핵의 파골 세포로 분화하게 된다. 골다공증과 같은 질환에서 파골 세포가 증가하여 골 밀도가 감소되며, 류마티스성 관절염, 치주염과 같은 염증 조건에서도 파골 세포의 분화가 증가하여 뼈의 파괴가 증가하게 된다. 조골 세포(Osteoblast)는 중간엽줄기세포에서부터 분화하여 생성되는 세포로 골질을 만들어 골밀도를 증가 시키며, 파골 세포 분화인자인 랑클(RANKL)을 발현하여 파골 세포의 분화에도 관여 한다. 뼈를 분해하는 파골 세포 (Osteoclast)와 뼈를 재생하는 조골 세포(Osteoblast)중 한 가지 세포의 활성이 증가하거나 감소하게 되면, 항상성 파괴로 인한 여러 질병들이 일어날 수 있다. 뼈를 흡수 하는 파골 세포의 활성이 증가하게 되면, 뼈의 분해가 촉진, 뼈가 얇아지고 쉽게 부러지는 골다공증과 같은 질병이 일어나게 되며, 조골 세포의 활성이 증가하게 되면, 골 밀도의 증가로 뼈의 기형이나 골 석화증이 일어나게 된다. 이렇듯 두 세포의 상호작용이 골 밀도를 유지하는 중요 인자로 작용한다.
사람은 연령이 증가함에 따라 골밀도가 떨어져 작은 충격에도 쉽게 골절을 일으키게 되며, 골다공증, 관절염으로 손상되고, 이와 같은 생리적, 물리적 손상으로 골절이 발생되는 경우 이전과 달리 조골 세포가 충분히 활성화 되지 못하고 파골 세포를 억제하지 못하는 문제가 발생하여 골 재생이 어려워진다.
골 재생의 치료 방법은 자연적인 치료나 약물 또는 물리적 요법에 의한 치료방법, 정형외과 수술에 의한 치료 방법 등이 존재하며, 골에 대한 손상 정도가 커서 회복이 어려운 경우, 정상조직은 보호하고 손상된 조직은 제거한다. 현대에 이르러 손상된 골조직을 정상적인 골조직으로 대체하거나 재생시키려는 시도를 하고 있으며, 이에 따라 체내 이식을 위한 골조직의 개발에 관심이 증대 되고 있다. 손상된 골조직의 보완을 위하여 골수유래줄기 세포와 같은 세포를 이용하여 골 형성 효과를 증대시키려는 생체 조직 인공 뼈를 개발하려는 연구가 진행 중에 있기도 하며, 타인이나 동물의 뼈를 이식하는 방법이나 환자 자신의 조직을 이식하는 방법도 있다. 그러나, 타의 조직을 이식함으로써 면역학적 거부반응이 발생되거나 손상부위가 커서 환자 몸에서 사용할 수 있는 재료가 충분하지 않은 문제가 있다. 따라서 수급이 용이하고 다양한 형태로 제조 가능하며 안전한 생체 재료의 개발이 필요한 상황이다.
생체재료란 의약품을 제외한 합성, 천연 또는 그들의 복합재료로서, 일정기간 인체의 조직, 기관, 그 기능의 일부 또는 전부를 대체하거나 촉진하는 재료를 말한다. 이러한 생체재료로서의 고분자 재료는 원래 공업용 목적으로 중합, 성형시킨 것이 의료용으로 전용되어 사용되고 있다. 고분자 재료가 생체재료로 사용되기 위한 필수조건은 생체 적합성(biocompatibility)으로, 혈액과 접촉하는 경우의 혈액 적합성(blood compatibility)과, 혈액 이외의 생체조직이나 세포와의 세포조직 적합성(cell tissue compatibility)으로 나눌 수 있다. 고분자 재료가 생체조직에 악영향을 끼치지 않고 원하는 기능을 발휘할 수 있다면 이 재료는 생체 적합성이 좋은 것이 된다.
18세기 후반에는 귀금속 재료로 만든 철선, 핀 등으로부터 시작하여, 그 이후 합금들의 개발과 설계 및 외과 기술의 발달로 금속핀, 접골용 금속판, 나사 골수정 등 다양한 체내외 고정물이 개발되었다. 이러한 생체금속 재료에는 스테인레스 스틸, 코발트-크롬 (Co-Cr) 합금, 티타늄 (Ti) 금속 등이 있다. 이와 관련 한국등록특허 10-1242333은 타이타늄을 이용한 생체 이식용 금속을 제작하는 방법을 공시하고 있으며, 이런 재료로 만든 인공 뼈(골)는 부식, 마모, 헐거워짐 또는 매식체 파괴 등의 문제가 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명이 해결하려는 과제는 천연 뼈와 구조적 또는 화학적 조성이 동일한 생체 적합성 재료와 약물을 이용하여, 조골 세포를 활성화하고 파골 세포의 활성을 억제하여 다양한 골 질환의 치료제로 이용될 수 있는 골 재생용 생체 재료 및 그의 제조 방법을 제공하는 데에 목적이 있다.
또한, 일시적으로만 조골 세포를 활성화시키는 것이 아니라 생체 재료와 골 조직 사이의 상호작용을 촉진하면서도 세포 독성을 나타내지 않으며, 보다 오랜 시간 동안 조골 세포 및 파골 세포의 활성을 조절하며, 나노 입자들의 응집을 방지하여 원래의 입자 크기를 유지한 채로 분산성을 증대시켜 뛰어난 골 치료 및 골 재생 효과를 가지는 골 재생용 생체 재료 및 그의 제조 방법을 제공하는 데에 또 다른 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 나노 섬유의 기질 내부에 수산화 아파타이트 나노 입자가 분산되고, 상기 나노 섬유의 기질은 생체 적합성 고분자이고, 상기 기질 내부에 분산된 수산화 아파타이트(hydroxyapatite) 나노 입자는 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물과 결합된 골 재생용 생체재료를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 나노 섬유는 전기 방사로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 생체 적합성 고분자는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리락티-글리콜리드 공중합체, 폴리락티드-카프로락톤 공중합체 및 폴리글리콜리드-카프로락톤 공중합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 생체 적합성 고분자로 PLGA(폴리락산-글리콜산 공중합체)를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 수산화 아파타이트 나노 입자가 로드(rod) 형태를 가질 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물은 파미드로네이트(pamidronate), 알렌드로네이트(alendronate), 시마드로네이트(cimadronate), 클로드로네이트(clodronate), 이비-1053(EB-1053), 에티드로네이트(etidronates), 이반드로네이트(ibandronate), 네리드로네이트 (neridronate), 올파드로네이트(olpadronate), 리세드로네이트(risedronate), 틸루드로네이트 (tiludronate), 인카드로네이트(incadronate), 미노드로네이트(minodronate), YH 529, 졸레드로네이트(zoledronate), 및 이들의 약리적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 수산화 아파타이트 나노 입자와 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물은 링커(Linker)를 통해 결합된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 링커는 나노 섬유 기질 내부의 분산성을 향상시키기 위하여 수산화 아파타이트 나노 입자에 비하여 소수성을 가지는 화합물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 링커는 하기 화학식 1의 구조를 포함하는 화합물이며,
[화학식 1]
Figure 112016074117360-pat00001
상기 식에서 R1는 R1는 아민기 또는 아민을 포함하는 C1~C3의 알킬기일 수 있고, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기(-COOH), 아마이드기(-CONH2) 또는 디하이드로겐 포스페이트기(-H2PO4)이며, R2 및 R3 중 적어도 하나는 수소가 아니고, m 및 n은 정수이고, m은 0≤m≤3이고, n은 2≤n≤6이며, m과 n은 2≤m+n≤6의 조건을 만족할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 생체재료는 3차원 기공 구조를 갖는 나노 섬유 집합체일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물과 결합한 수산화 아파타이트 나노 입자가 나노 섬유 기질 내부에 0.1~10 중량% 포함될 수 있다.
또한, 상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 (1) 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물이 결합된 수산화 아파타이트 나노 입자를 준비하는 단계, (2) 상기 수산화 아파타이트 나노 입자를 생체 적합성 고분자를 포함하는 섬유형성성분에 투입하여 방사 조성물을 제조하는 단계 및 (3) 상기 방사 조성물로부터 나노 웹을 수득하는 단계를 포함하는 골 재생용 생체 재료의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (3) 단계의 방사 조성물을 전기 방사하여 나노 웹을 수득할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기의 제조 방법으로 제조된 골 재생용 생체 재료를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명에 사용된 용어를 설명한다.
본 발명에 사용하는 ‘나노 섬유’용어는 평균 직경이 100 내지 5000㎚ 정도를 갖는 초극세 섬유를 의미한다.
본 발명에 사용하는 ‘나노 웹’용어는 상기 ‘나노 섬유’들과 같은 초극세 섬유들의 집합체로서, 바람직하게는 전기 방사를 통해 제조되는 것일 수 있다.
본 발명의 골 재생용 생체 재료 및 이의 제조 방법은 천연 뼈와 구조적 또는 화학적 조성이 동일한 혈액 적합성과 세포조직 적합성이 뛰어난 생체 적합성 고분자 재료를 이용하여, 조골 세포를 활성화함과 동시에 파골 세포의 사멸을 야기하여 골 손실과 골다공증을 억제할 수 있으며, 잠재적으로는 골다공증뿐만 아니라 약물 전달 시스템의 개발에 유용하고 다양한 골 질환의 치료제로 이용되어 골 재생 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 골 재생용 생체 재료 및 이의 제조 방법은 일시적으로만 조골 세포를 활성화시키는 것이 아니라 생체 재료와 골 조직 사이의 상호작용을 촉진하면서도 세포 독성을 나타내지 않으며, 보다 오랜 시간 동안 조골 세포 및 파골 세포의 활성을 조절할 수 있다. 또한, 나노 입자들의 응집을 방지하여 원래의 입자 크기를 유지하면서도 고르게 분산되도록 하여 뛰어난 조골세포 증식 촉진 효과를 기대할 수 있으며, 우수한 골 재생 효과를 나타내므로 기존의 인공 골 대체물을 대신하여 골 재생을 위한 물질로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일실시예에 따른 (a) PLGA 나노 섬유 지지체, (b) nHA(나노로드 수산화아파타이트, nano-rod hydroxyapatite)/PLGA 및 (c) P-g-nHA(파미드론산이 결합된 나노 로드 수산화아파타이트, pamidronic acid grafted nano-rod hydroxyapatite)/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체의 FE-SEM 사진이다.
도 1b는 본 발명의 일실시예에 따른 (a,d) PLGA 나노 섬유 지지체, (b,e) nHA/PLGA 및 (c,f) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 점착한 조골 세포의 FE-SEM 사진을 나타내며, 보다 구체적으로는 (a,b,c) 1일이 경과한 후와 (d,e,f) 3일이 경과한 후의 FE-SEM 사진이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 (a) nHA, (b) P-g-nHA, (c) nHA/PLGA 및 (d) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체의 TEM 사진이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 (a) nHA, (b) P-g-nHA, (c) PLGA 및 (d) P-g-nHA/PLGA의 FTIR 스펙트럼 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 (a) PLGA 나노 섬유 지지체, (b) nHA, (c) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체 및 (d) P-g-nHA의 X-선 광전자 분석법(ESCA, Electron Spectroscopy for Chemical Analysis)에 의한 스펙트럼 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일실시예에 따른 PLGA 나노 섬유 지지체, nHA/PLGA 및 P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 배양된 조골 세포의 증식에 대한 MTT(세포 독성 실험) 분석 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일실시예에 따른 PLGA 나노 섬유 지지체, nHA/PLGA 및 P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 배양된 파골 세포의 증식에 대한 MTT 분석 그래프이다.
도 6a는 본 발명의 일실시예에 따른 (a) PLGA 나노 섬유 지지체, (b) nHA/PLGA 및 (c) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 배양한 조골 세포의 1일 후의 CFM 사진이고, (d) PLGA 나노 섬유 지지체, (e) nHA/PLGA 및 (f) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 배양한 조골 세포의 7일 후의 ARS(Alizarin red staining) 사진이며, (g) 나노 섬유 지지체에 조골 세포를 각각 15일, 21일 동안 배양한 경우의 상대적 ALP 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일실시예에 따른 (a) PLGA 나노 섬유 지지체, (b) nHA/PLGA 및 (c) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 배양한 조골 세포와, P-g-nHA/PLGA 나노 섬유 지지체에 배양한 (d) 조골 세포, (e) 파골 세포 및 (f) 대식세포(Raw 264.7)를 초록색 형광색소(calcein-AM)과 빨간색 요오드화프로피디움(propidium iodide))으로 세포를 염색한 후 촬영한 CFM 사진이다.
도 7은 nHA 표면에 링커를 이용해 PDA를 결합시킨 구조에 대한 그림이다.
도 8은 HA 나노 입자의 형태에 따른 조골 세포의 세포 반응에 대한 구조도이다.
이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세하게 설명한다. 다만, 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.
종래에는 합금들의 개발과 설계 및 외과 기술의 발달로 금속핀, 접골용 금속판, 나사 골수정 등 다양한 체내외 고정물이 개발되었다. 이러한 생체금속 재료에는 스테인레스 스틸, 코발트-크롬 (Co-Cr) 합금, 티타늄 (Ti) 금속 등이 있으며, 이런 재료로 만든 인공 뼈(골)는 부식, 마모, 헐거워짐 또는 매식체 파괴 등의 문제가 있었다.
또한, 종래의 생체 적합성 고분자를 이용한 골 재생용 생체 재료는 이식된 재료와 재생되는 골 조직 사이의 상호작용이 불리하게 일어나고 나노 입자들의 응집이 발생해 이식 후 단 시간 내에 골 재생 효과가 떨어지는 문제가 있었다. 또한, 나노 섬유의 두께의 균일성이 떨어지거나 나노 입자의 결정성이 저하되는 문제가 있었으며, 조골 세포의 생존 및 증식 효과도 일시적으로만 유지되어 결국엔 골 재생 효과가 떨어지는 문제가 있었다.
이에 본 발명은 나노 섬유의 기질 내부에 수산화 아파타이트(hydroxyapatite) 나노 입자가 분산되며, 상기 나노 섬유의 기질은 생체 적합성 고분자이고, 상기 기질 내부에 분산된 수산화 아파타이트 나노 입자는 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물과 결합된 골 재생용 생체재료를 제공하여 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 혈액 및 혈액 이외의 세포나 세포조직과의 적합성이 뛰어난 골 재생용 생체 재료를 이용하여 인공 골의 부식, 마모, 헐거워짐 또는 매식체 파괴 등의 생체 악영향을 방지할 수 있는 골 재생용 생체 재료 및 그의 제조 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 천연 뼈와 구조적 또는 화학적 조성이 동일한 생체 적합성 재료와 약물을 이용하되, 이러한 생체 적합성 재료와 약물을 결합하여 생체 재료인 나노 입자의 표면 개질을 통해 골 조직에 적합한 환경을 제공하고 골세포 점착성을 증가시켜 일시적인 조골 세포의 활성화에 그치는 것이 아니라, 장기적으로 조골 세포를 활성화할 수 있도록 하였다. 뿐만 아니라, 이러한 표면 개질을 통해 나노 입자의 분산성을 증대시킬 수 있어 나노 입자들이 응집되지 않고 원래의 크기를 유지한 채로 고르게 분산되어 조골 세포의 활성을 증대시키면서도 파골 세포의 활성도 억제하여 다양한 골 질환의 치료제로 활용될 수 있는 골 재생용 생체 재료 및 그의 제조 방법을 제공할 수 있다.
먼저, 상기 나노 섬유의 기질로 사용되는 생체 적합성 고분자를 설명한다.
상기 생체 적합성 고분자는 통상적으로 나노섬유에 사용되는 생체적합성 고분자면 제한없이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리락티드-글리콜리드 공중합체, 폴리락티드-카프로락톤 공중합체, 폴리글리콜리드-카프로락톤 공중합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기의 고분자들은 생체 적합성이 우수하며 용이하게 성형될 수 있다는 장점이 있다. 상기 생분해성 고분자는 특별히 제한되는 것은 아니나 평균 분자량이 5,000 내지 500,000g/mol 범위인 것을 사용하는 것이 바람직하다. 만일 상기의 생체 고분자가 아닌 생체 적합성이 떨어지는 고분자를 사용하여 생체조직에 매입하면 여러 가지 조직 반응을 일으키고 생체 내의 고분자 재료 표면에 형성된 혈전이 인공장기의 기능 부전을 가져와 합병증을 유발할 수 있다.
또한 더욱 바람직하게는, 상기 생체 적합성 고분자로 PLGA (폴리락트산-폴리글리콜산의 공중합체, Poly(lactic acid-co-glycolic acid)) 를 사용할 수 있다. PLGA의 생분해 기간은 폴리 락트산 및 폴리 글리콜산의 단량체의 몰%의 비율을 변화시킴으로써 조절할 수 있다. 이와 관련, PLGA는 바람직하게는 60~90몰%의 폴리 락트산과 10~40몰%의 폴리 글리콜산으로 이루어질 수 있다. PLGA는 체내에 투여되었을 때 생체내의 정상 대사 과정인 시트르산 회로(citric acid cycle)을 통해 인체에 무해한 물과 이산화탄소로 분해되기 때문에 생체 적합성 및 생체 분해성이 뛰어난 고분자로 알려져 있다.
상기의 생체 적합성 고분자를 포함하는 나노 섬유는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있는데, 예를 들어 전기방사, 직접방사, 복합방사, 플래시방사 등의 다양한 방법으로 제한 없이 제조될 수 있으나, 바람직하게는 전기 방사(electrospinning)로 제조된 것일 수 있다. 전기방사로 나노 섬유를 제조할 경우, 간편한 방법으로 여타 다른 공정에 비해 자유로운 소재의 선택이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 또한, 다양한 고분자를 이용해 대량의 연속적인 나노 섬유의 생산이 가능하며, 생산된 나노 섬유의 부피 대비 표면적 비가 크고 공극률이 높은 장점이 있다.
상기의 전기 방사는 종래 알려진 통상의 전기 방사법을 이용하여 수행될 수 있으나, 바람직하게는 전기 방사 파라미터는 다음과 같은 조건일 수 있다.
즉, 전기 방사는 바람직하게는 방사 전압이 10 내지 30 kV일 때 방사거리 5 내지 30cm를 적용하여 방사용액 토출속도 0.5 내지 2.0 ml/hour로 방사될 수 있다. 방사전압이 10 kV 보다 낮은 경우는 섬유가 충분히 세화되지 못하고, 방사전압이 30 kV 보다 큰 경우는 섬유가 극세화되는 문제가 있어 상기 파라미터 수치범위에서 더욱 균일한 직경의 나노 섬유가 방사될 수 있다.
구체적으로, 방사용액의 경우 용매는 디크로르메탄, 클로르포름, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 테트라하이드로퓨란, 에틸아세테이트, 프로필렌카보네이트, 아세톤 등 PLGA 폴리에스테르를 용해시킬 수 있는 용매이면 제한 없이 사용될 수 있으나 바람직하게는 THF:DMF (tetrahydrofuran:dimethylformamide)를 사용할 수 있다. 또한 방사용액의 농도는 바람직하게는 상기 생체 적합성 고분자를 10 내지 30 중량% 포함할 수 있고, 이러한 범위를 만족하는 경우에 가장 균일하면서 안정한 나노 구조를 가지는 나노 섬유를 제조할 수 있는 효과가 있다. 또한, 제조된 나노 섬유 기질의 섬유의 섬도는 바람직하게는 200 ~ 3000nm 일 수 있다.
한편, 상기 생체재료는 3차원 기공 구조를 갖는 나노 섬유 집합체일 수 있다. 구체적으로, 도 1a의 (c)는 P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체의 FE-SEM 사진이다. 상기 도면에서와 같이 본 발명의 나노 웹은 나노 섬유들이 서로 교락되어 3차원의 기공을 형성하는 나노 집합체를 포함하여 이루어진다. 이러한 3차원 나노 섬유 집합체는 유연성과 신축성이 좋아 보다 우수한 효과를 가진다. 또한, 도 1a는 실험예 1에 따른 (a) PLGA 나노 섬유 지지체, (b) nHA/PLGA 및 (c) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체의 FE-SEM 사진이다. 이를 통해 모든 지지체가 균일한 형태를 보임을 확인할 수 있고, 본 발명에 따라 제조된 골 재생용 생체 재료가 일반적인 PLGA와 비교하여도 나노 섬유의 직경이 일정하게 유지됨을 통하여 특별한 결함이 없는 나노 섬유 기질을 가짐을 알 수 있다.
이러한 나노 섬유 기질은 생체 적합성 고분자로 이루어져 있기에, 일정 시간이 지난 후 자연스럽게 분해되며 인체에 무해하다. 또한, 상기의 나노 섬유는 혈액 및 혈액 이외의 세포나 세포조직과의 적합성이 뛰어나므로 인공 골의 부식, 마모, 헐거워짐 또는 매식체 파괴 등의 생체 악영향을 방지할 수 있는 효과가 있다.
또한, 상기의 3차원 나노 섬유 집합체는 원하는 두께로 제한 없이 제조할 수 있으나 바람직하게는 50 ~ 800μm 두께 범위일 수 있고, 제조할 수 있는 면적도 원하는 면적으로 제한 없이 제조할 수 있으나 바람직하게는 200 ~ 1000cm2 면적 범위일 수 있다.
다음, 상기 나노 섬유의 기질 내부에 포함되는 수산화 아파타이트 나노 입자를 설명한다.
본 발명에 사용될 수 있는 수산화 아파타이트 나노 입자의 형태는 별다른 제한이 없으며, 바람직하게는 구 형태, 로드(rod) 형태, 가지 형태, 다면체형태 또는 속이 빈 형태 등 일 수 있으나, 가장 바람직하게는 로드(rod) 형태일 수 있다.
구체적으로, 도 8는 나노 입자의 형태에 따른 조골 세포의 세포 반응에 관한 것이다. 도 8에서 보이는 바와 같이, 나노 로드 형태의 HA(nHA, nano-rod hydroxyapatite)는 Ca2 +양이온이 나노 입자 바깥 표면에 많이 존재하여 전반적으로 양 전하를 가진다. 반면, 구 형태의 HA(sHA, sphere hydroxyapatite)는 나노 입자 바깥 표면에 많은 PO4 3-음이온이 존재하여 전반적으로 음 전하를 가진다. 따라서 음 전하인 조골 세포에 대하여 양 전하를 가지는 나노 로드 형태의 HA가 더 많이 점착할 수 있음을 알 수 있고, 이를 통해 생체 적합성이 보다 우수함을 확인할 수 있다.
다음, 상기 수산화 아파타이트 나노 입자와 결합되는 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물을 설명한다. 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물은 강력한 뼈 흡수억제제로 종류에 따라 척추, 비척추 골절에 대해 다양한 예방효과를 가진다. 또한, 비스포스포네이트는 파골 세포에 의한 골 흡수가 진행되는 동안 파골 세포가 골 조직의 구조물인 수산화 아파타이트 나노 입자와 결합된 비스포스포네이트계 약물에 노출되는 경우, 비스포스포네이트계 약물이 파골 세포 내에 들어가 여러 가지 생화학적인 반응을 일으켜 파골 세포(osetoclast)에 직접 또는 간접적으로 작용하여, 파골 세포의 수와 활성을 감소시킴으로써 골 흡수를 억제시키고 총체적으로 골 질량을 증가시키는 기능을 가지는 화합물로서, 골 흡수가 증가되어 발생하는 질병을 예방 또는 치료하기 위해 사용된다.
먼저 본 발명에 사용될 수 있는 상기 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물은 바람직하게는 질소계 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 물질일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 파미드로네이트(pamidronate), 알렌드로네이트(alendronate), 시마드로네이트(cimadronate), 클로드로네이트(clodronate), 이비-1053(EB-1053), 에티드로네이트(etidronates), 이반드로네이트(ibandronate), 네리드로네이트 (neridronate), 올파드로네이트(olpadronate), 리세드로네이트(risedronate), 틸루드로네이트 (tiludronate), 인카드로네이트(incadronate), 미노드로네이트(minodronate), YH 529, 졸레드로네이트(zoledronate), 및 이들의 약리적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다. 또한, 가장 바람직하게는 파미드로네이트 및 이의 약리적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
골 흡수에 기인한 질병으로서 비스포스포네이트가 예방 또는 치료 약물로서 사용되는 질병은, 골다공증, 파젯씨병, 악성종양으로 인한 고칼슘혈증, 악성종양으로 인한 전이성 골질환, 다발성 골수종, 고정화로 인한 골소실, 인공관절 대치술 후 골소실, 원인 불명의 소아, 류마티스, 부갑상선 기능항진증, 치근막 등을 예로 들 수 있다. 따라서, 비스포스포네이트를 활성 약물로서 포함하는 본 발명의 골 재생용 생체 재료는 상기한 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 만일 비스포스포네이트계 약물을 사용하지 않을 경우, 골 손실 또는 골다공증 등의 골 질환을 예방하는 효과를 얻을 수 없는 문제가 발생할 수 있다.
구체적으로, 골다공증의 치료에 적용되고 있는 대표적인 약물은 파미드로네이트, 알렌드로네이트, 리세드로네이트 등이다. 알렌드로네이트는 파골 세포에 축적되어 세포골격을 변화시키고 파상연(ruffered border)을 감소시키며 선 분비 및 효소 활성을 감소시켜 세포괴사(apoptosis)를 유발함으로써 파골 세포의 활성과 수를 감소시키며, 또한 간접적으로 조골 세포에 먼저 작용하여 파골 세포의 분화를 억제함으로써 파골 세포의 수와 활성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 또한 파미드로네이트(pamidronate)는 골 손실을 예방하고, 골다공증을 치료하는데 사용되며 다발성 골수종과 같은 질병과 스테로이드로 인한 골 손실을 방지하는 효과를 가진다. 바람직한 양태에서, 상기 비스포스포네이트는 파미드로네이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 등일 수 있다.
한편, 본 발명의 비스포스포네이트계 약물은 반드시 수산화 아파타이트 나노 입자와 결합되어야 하며, 상기의 결합은 화학적 결합을 의미한다. 이는 수산화 아파타이트 나노 입자의 표면의 특성이 골 조직의 생존 및 재생에 중요한 역할을 하기 때문에 적절한 표면 개질을 통해서 골 조직에 적합한 환경을 제공하고 골세포 점착성을 증가시켜 골 질환을 치료하기 위함이다. 만일 상기의 결합 없이 각 물질을 단독으로 분산시키는 경우, 이식되는 수산화 아파타이트 나노 입자 본래의 표면이 골 조직을 과하게 자극하여 이식된 재료와 골 조직 사이의 상호작용을 저해하여 골 조직의 재생이 저하될 수 있다. 또한, 나노 입자들이 응집되어 원래의 나노 크기를 유지하지 못하게 되고 골고루 분산되지 않아, 나노 섬유 기질의 표면에 수산화 아파타이트 입자가 노출되지 못하여 골 생성이 저하되는 문제가 발생할 수 있다. 또한, 상기의 결합이 화학적 결합이 아닌 단순 물리적 흡착인 경우엔 생체 내에서 보다 쉽게 분리되므로 상술한 결합에 의한 효과를 기대할 수 없는 문제가 있다.
구체적으로, 도 2는 실시예 1 및 실험예 2에 따른 (a) nHA, (b) P-g-nHA, (c) nHA/PLGA 및 (d) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체의 TEM 사진이다. TEM 사진을 통해, 나노 섬유의 형태가 균등한 지 여부와 나노 섬유 기질 내에 nHA가 골고루 분산된 상태로 포함되어 있는지 여부를 확인할 수 있다. 도 2(b)를 통해 nHA가 기질 내부에 응집되는 현상 없이 골고루 분산된 상태로 포함되어 있음을 알 수 있고, 도 2(d)를 통해 나노 섬유의 형태가 균등하게 제조되었음을 확인할 수 있다. 즉, 나노 섬유의 두께를 균일하게 유지하면서도 생체 재료인 나노 입자들의 분산성도 증대시켰음을 확인할 수 있다.
또한, 도 1b는 실시예 실험예 5에 따른 (a,d) PLGA 나노 섬유 지지체, (b,e) nHA/PLGA 및 (c,f) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 점착한 조골 세포의 FE-SEM 사진이며, 보다 구체적으로는 (a,b,c) 1일이 경과한 후와 (d,e,f) 3일이 경과한 후의 FE-SEM 사진이다. 이를 통해 조골 세포가 본 발명에 따라 제조된 골 재생용 생체 재료에 더 잘 부착하고 증식함을 확인 할 수 있다. 즉, 수산화 아파타이트 나노 입자와 비스포스포네이트계 약물을 결합하여 나노 입자의 표면을 개질하는 경우, 조골 세포에 적합한 생체 환경을 제공하여 조골 세포의 활성을 증대시키고, 이를 통해 골 질환 등의 치료제 혹은 골 재생용 재료로 유용하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면 상기 수산화 아파타이트 나노 입자와 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물의 결합이 용이할 수 있게 링커(Linker)를 통해 결합될 수 있다. 상기 링커를 통해 결합될 경우, 입체 장애가 완화되어 수산화 아파타이트 나노 입자와 비스포스포네이트계 약물이 용이하게 결합될 수 있다.
상기 링커는 바람직하게는 수산화 아파타이트 나노 입자에 비하여 소수성을 가지는 화합물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 다음의 화학식 1의 구조를 포함하는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112016074117360-pat00002
상기 식에서
Figure 112016074117360-pat00003
R1는 아민기 또는 아민을 포함하는 C1~C3의 알킬기이며, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기(-COOH), 아마이드기(-CONH2) 또는 디하이드로겐 포스페이트기(-H2PO4)이며, R2 및 R3 중 적어도 하나는 수소가 아니고, m 및 n은 정수이고, m은 0≤m≤3이고, n은 2≤n≤6이며, m과 n은 2≤m+n≤6의 조건을 만족할 수 있다.
또한, 상기 링커는 체내에서 수산화 아파타이트 나노 입자와 비스포네이트계 약물을 연결하는 링커 본연의 기능을 다하기 위해서는, 수산화 아파타이트 나노 입자의 하이드록시기와 비스포스포네이트계 약물의 친수성기와 결합을 할 수 있는 관능기를 가져야한다. 그러나 수산화 아파타이트 나노 입자에 비해서는 소수성을 가져야 한다.
만일 링커가 수산화 아파타이트 나노 입자에 비하여 소수성을 가지지 않는다면, 수산화 아파타이트 나노 입자의 친수성을 완화시키지 못하여 나노 섬유 제조시 수산화 아파타이트 보다 비교적 소수성인 유기용매에서의 나노 입자들의 분산성이 저하되는 문제가 발생할 수 있다.
만일 상기의 링커가 없어 분산성이 저하되는 경우 나노 입자들 간의 응집 현상이 발생하게 되어 나노 입자들이 원래의 크기를 유지하지 못하고 골고루 분산되지 못하게 되므로 생체 재료와 재생되는 골 조직 사이의 상호작용이 저하되게 된다. 또한 일시적으로는 조골 세포의 활성을 촉진시킬 수 있더라도, 단 시간 내에 조골 세포와 파골 세포의 활성도를 조절하지 못하게 되므로 골 손실 등을 방지하지 못하게 되는 문제가 발생할 수 있다. 즉, 수산화 아파타이트 보다 비교적 소수성인 유기용매 내에서 수산화 아파타이트 나노 입자 그 자체로는 분산되지 못하고 응집될 수 있으나, 상기의 링커를 통해 결합하면 수산화 아파타이트 나노 입자의 친수성이 완화되어 상기의 유기용매 내에서 잘 분산될 수 있다.
이에 따라, 상기 R1는 아민기 또는 아민을 포함하는 C1~C3의 알킬기일 수 있는데, 아민기는 친수성이면서 단백질 내에서 잘 용해되는 성질을 가지고 있어 상기 링커에 포함되는 바람직한 관능기일 수 있다. 또한, 상기의 아민은 메틸 아민, 에틸 아민, 프로필 아민 또는 부틸 아민의 경우 좋은 친수성도를 가진다. 프로필 아민에는 이소 프로필 아민도 포함될 수 있고, 부틸 아민에는 sec-부틸 아민, tert-부틸 아민도 포함될 수 있다. 따라서 m은 0~3 사이의 정수일 수 있다. m이 0인 경우는 R2가 결합되어 있는 탄소에 바로 아민기가 결합하는 화합물일 수 있다.
또한, 상기 R2 및 R3는 수소 또는 친수성을 가진 관능기이면서 지방에서도 잘 용해되는 성질을 가져야 하는데, R2 및 R3 중 적어도 하나는 수소가 아닌 친수성 관능기인 것이 바람직하다. 이러한 관능기로는 카르복실기와 비슷한 친수성도를 가지면서 인체 내부에 무해하게 존재할 수 있고 nHA의 -OH기 또는 비스포스포네이트계 약물의 친수성 관능기와 화학적 결합을 할 수 있는 관능기이면 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 카르복실기, 아마이드기 또는 디하이드로겐 포스페이트기 등일 수 있고, 더욱 바람직하게는 카르복실기일 수 있다.
나아가, 상기의 링커는 R2와 R3를 이용한 화학 결합을 통해서 비스포스포네이트계 약물과 수산화 아파타이트 나노 입자에 결합할 수 있다. 링커의 상기 두 관능기는 각각 수산화 아파타이트 나노 입자 표면의 -OH기와 비스포스포네이트계 약물의 친수성 관능기와 화학 결합을 형성하며, 이러한 결합으로 상술한대로 수산화 아파타이트 나노 입자의 표면 개질 및 유기 용매 내에서의 분산성을 증대시켜 우수한 골 재생 효과를 얻을 수 있다.
상기의 R2 및 R3는 C(탄소수)≤ 5 인 경우 친수성을 가짐이 일반적이다. 다만 상기의 화학식 1에서 볼 수 있듯이, 화학식 1은 R2 및 R3기의 2개의 친수성기를 모두 포함하고 있으므로 전체 C(탄소수)< 8 인 경우 친수성을 가진다. 따라서 바람직하게는, n은 6이하의 양의 정수여야 한다.
또한, 수산화 아파타이트에 비해서는 소수성을 가져야 하므로 화학식 1의 화합물의 관능기에 포함된 탄소를 제외한 전체 탄소수가 3개 이상이어야 한다. 따라서 n은 6 이하의 양의 정수이되, 2이상이어야 한다. 즉, n은 2~6 사이의 양의 정수일 수 있다. 또한, 관능기에 포함된 탄소를 제외한 탄소수가 3이상의 양의 정수이면서도, 화학식 1의 전체 탄소수가 7이하의 양의 정수 개이어야 하므로 n+m은 2~6 사이의 양의 정수일 수 있다.
만일 n과 m이 상기의 조건을 만족하지 못할 경우, 친수성이 지나치게 떨어져 수산화 아파타이트와 비스포네이트계 약물 사이를 용이하게 결합하지 못하여 결합에 따른 분산성 증대 및 수산화 아파타이트 나노 입자의 표면 개질 등을 기대할 수 없는 문제가 발생할 수 있다. 또한, 반대로 친수성이 지나치게 높아져 소수성인 유기용매에서의 비스포스포네이트계 약물과 결합한 수산화 아파타이트 나노 입자의 분산성이 낮아지고 응집되어 골 질환의 치료 효과 내지는 골 재생용 생체 재료로서의 역할을 기대할 수 없는 문제점이 발생할 수 있다.
또한, 상기의 링커는 상기 화학식 1을 만족하는 화합물이면 제한 없이 이용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 L-글루타민산을 이용할 수 있다. 글루타민산은 20가지 단백질 아미노산 가운데 하나이며, 화학식 C5H9NO4 , 분자량 147.13g/mol이고 하기 화학식 2의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112016074117360-pat00004
L-글루타민산은 상기 화학식 2에서 보듯이, 2개의 카르복실기를 가지고 이를 통해 수산화 아파타이트 나노 입자와 비스포스포네이트계 약물과 용이하게 화학 결합할 수 있다.
이와 관련, L-글루타민산은 산성이며 친수성 아미노산이므로 체내에서 신경전달물질의 기능 등을 할 수 있는 반면, 수산화 아파타이트보다는 소수성 화합물이므로 수산화 아파타이트 나노 입자의 친수성을 완화시켜 유기 용매내에서의 분산성을 증대시키는 효과가 있으며, 나노 입자의 표면을 개질하여 골 조직 적합성을 높이는 효과도 있다. 나노 입자들이 응집되지 않고 나노 크기를 유지한 채로 골고루 분산되어 이식된 재료와 골 조직 간의 상호작용이 보다 활발히 일어날 수 있고, 일시적인 조골 세포의 활성화가 아니라 보다 긴 시간 동안 조골 세포 및 파골 세포의 활성을 조절할 수 있어 뛰어난 골 치료 및 골 재생 효과를 가질 수 있다.
구체적으로, 도 7은 nHA 표면에 PDA를 결합시킨 구조에 대한 그림이다. 도 7에 도시된 바와 같이, 수산화 아파타이트 나노 입자에 링커인 L-글루타민산을 결합시키고, 이 링커의 카로복시기를 이용해 비스포스포네이트계 약물인 파미드론산이 수산화 아파타이트 나노 입자에 결합되었음을 알 수 있다. 이에 따라, 링커를 통해 수산화 아파타이트 나노 입자와 비스포스포네이트계 약물을 결합한 골 재생용 생체 재료를 치료 등의 목적으로 이용할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 도 6b는 실시예 1 및 실험예 9에 따른 (a) PLGA 나노 섬유 지지체, (b) nHA/PLGA 및 (c) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 배양한 조골 세포와, P-g-nHA/PLGA 나노 섬유 지지체에 배양한 (d) 조골 세포, (e) 파골 세포 및 (f) 대식세포(Raw 264.7)를 초록색 형광색소(calcein-AM)과 빨간색 요오드화프로피디움(propidium iodide))으로 세포를 염색한 후 촬영한 CFM 사진이다. 이를 통해 파미드론 산에 의한 효과로 파골 세포의 일부는 적색 형광을 나타내어 세포 사멸이 일어났음을 확인할 수 있는 반면, 조골 세포 또는 대식 세포 등은 녹색 형광을 나타내어 어떠한 불리한 효과도 없음을 확인할 수 있다. 즉, 이러한 세포 생존 실험을 통해 본 발명에 따른 골 재생용 생체 재료가 대식 세포 등에 대한 불리한 효과 없이 오직 조골 세포 및 파골 세포의 활성을 조절하여 골 질환의 치료제 혹은 골 재생용으로 적합한 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
또한, 조골 세포의 활성화가 일시적인 현상인지 여부와 관련, 도 6a는 실시예 1 및 실험예 7에 따른 (a) PLGA 나노 섬유 지지체, (b) nHA/PLGA 및 (c) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 배양한 조골 세포의 1일 후의 CFM 사진이고, (d) PLGA 나노 섬유 지지체, (e) nHA/PLGA 및 (f) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 배양한 조골 세포의 7일 후의 ARS 사진이며, (g) 나노 섬유 지지체에 조골 세포를 각각 15일, 21일 동안 배양한 경우의 상대적 ALP 활성도를 나타낸 그래프이다. 이를 통해, 조골 세포가 제조된 나노 섬유 지지체에 골고루 분산되어 부착되어 있는지 여부를 확인할 수 있다. 도 6a(c) 및 도 6a(f)를 통해서 조골 세포를 본 발명의 나노 섬유 지지체에 배양한 경우, 더 많은 조골 세포가 관찰됨을 알 수 있다. 이러한 조골 세포에 기인한 골 형성은 뼈의 칼슘을 조절하는 파미드론 산으로부터 기인한 것으로 도 6a(g)의 그래프에서 볼 수 있듯이, 일시적인 조골 세포의 활성만을 촉진하는 것이 아니라, 시간이 지날수록 더 높은 ALP 활성도를 가져 보다 오랜 시간 동안 골 형성이 원활히 진행됨을 확인할 수 있다.
나아가, 상기 나노 섬유 기질 내부에 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물과 결합한 수산화 아파타이트 나노 입자가 0.1~10 중량% 포함될 수 있다. 비스포스포네이트계 약물과 결합한 수산화 아파타이트 나노 입자가 상기 범위 내일 경우, 조골 세포의 활성이 뛰어나지고 파골 세포의 활성은 떨어지게 되는 효과가 있다. 만일 비스포스포네이트계 약물과 결합한 수산화 아파타이트 나노 입자가 0.1 중량% 미만인 경우 나노 섬유 기질 내에 적절한 양보다 적은 양의 수산화 아파타이트가 존재하게 되고, 10 중량%를 초과하는 경우에는 수산화 아파타이트의 응집이 생기게 되어, 두 경우 모두 조골 세포와 파골 세포의 활성을 적절히 조절하지 못하게 되어 우수한 골 재생 효과를 기대할 수 없는 문제가 발생할 수 있다.
상술한 본 발명의 골 재생용 생체 재료를 제조하기 위한 제조 방법은 (1) 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물이 결합된 수산화 아파타이트 나노 입자를 준비하는 단계, (2) 상기 수산화 아파타이트 나노 입자를 생체 적합성 고분자를 포함하는 섬유형성성분에 투입하여 방사 조성물을 제조하는 단계 및 (3) 상기 방사 조성물로부터 나노 웹을 수득하는 단계를 포함한다.
이하에서는 중복되는 부분은 제외하고 제조 방법의 특징적인 부분을 중심으로 설명한다.
먼저, 상기 나노 섬유의 기질로 사용되는 생체 적합성 고분자를 설명한다. 상기 생체 적합성 고분자는 바람직하게는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리락티드-글리콜리드 공중합체, 폴리락티드-카프로락톤 공중합체 및 폴리글리콜리드-카프로락톤 공중합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 PLGA(폴리락산-글리콜산 공중합체)일 수 있다. 또한 상술한 바와 같은 성질을 가질 수 있다.
또한, 상기 (3) 단계의 나노 섬유 제조시 상술한 다양한 방법들로 제조할 수 있으며 바람직하게는 전기 방사로 나노 웹을 제조할 수 있다. 또한 제조된 나노 웹은 3차원 기공 구조를 갖는 나노 섬유 집합체일 수 있으며 상술한 바와 같은 효과 및 기능을 가진다.
다음, 상기 나노 섬유의 기질 내부에 포함되는 수산화 아파타이트 나노 입자를 설명한다. 상술한 바대로 수산화 아파타이트 나노 입자는 다양한 형태일 수 있으나, 바람직하게는 로드(rod)형태 일 수 있다. 그 효과 및 기능은 상술한 바와 같다.
다음, 상기 수산화 아파타이트 나노 입자와 결합되는 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물을 설명한다. 상술한 바와 같이 상기 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물은 바람직하게는 질소계 비스포스포네이트계 약물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 파미드로네이트(pamidronate), 알렌드로네이트(alendronate), 시마드로네이트(cimadronate), 클로드로네이트(clodronate), 이비-1053(EB-1053), 에티드로네이트(etidronates), 이반드로네이트(ibandronate), 네리드로네이트 (neridronate), 올파드로네이트(olpadronate), 리세드로네이트(risedronate), 틸루드로네이트 (tiludronate), 인카드로네이트(incadronate), 미노드로네이트(minodronate), YH 529, 졸레드로네이트(zoledronate), 및 이들의 약리적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 화합물일 수 있다. 그 효과 및 기능은 상술한 바와 같다.
또한, 상기 비스포스포네이트계 약물과 결합한 수산화 아파타이트 나노 입자는 나노 섬유 내부에 상술한 농도 범위 내로 포함 되는 경우, 조골 세포 및 파골 세포의 활성 여부의 조절이 가장 용이해지며 골 재생효과도 우수해지는 등의 상술한 효과를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 (1)단계에서 수산화 아파타이트 나노 입자와 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물은 링커(Linker)를 통해 결합될 수 있다. 바람직하게는 상기 링커는 나노 섬유 기질 내부의 분산성을 향상시키기 위하여 수산화 아파타이트 나노 입자에 비하여 소수성을 가지는 화합물일 수 있으며, 더 바람직하게는 상기 링커는 상술한 바와 같이 화학식 1의 구조를 포함하는 화합물일 수 있다. 또한 상술한 대로 결합을 용이하게 해주고, 분산성을 증대시켜주는 등의 효과 및 기능을 가진다.
나아가 본 발명은 상기의 제조 방법으로 제조된 골 재생용 생체 재료를 제공할 수 있다. 이를 통해 천연 뼈와 구조적 또는 화학적 조성이 동일한 생체 적합성 재료와 약물을 이용하여, 조골 세포를 활성화하고 파골 세포의 활성을 억제하여 다양한 골 질환의 치료제로 활용될 수 있고 골 재생 효과를 제공하는 등 상술한 본 발명의 성질 및 특징을 가진다.
구체적으로, 도 3은 실시예 1 및 실험예 3에 따른 (a) nHA, (b) P-g-nHA, (c) PLGA 및 (d) P-g-nHA/PLGA의 FTIR 스펙트럼 그래프이다. 이를 통해 나노 섬유 기질 내에 P-g-nHA가 존재하는 지 여부를 확인하여 골 재생용 생체 재료가 의도한대로 제조되었는지 여부를 확인할 수 있다. 도 3(d)는 p-g-nHA/PLGA의스펙트럼에 관한 것이고, 이는 nHA와 PLGA의 특징적인 밴드를 보여준다. 1648cm-1 및 1540cm-1에서의 관찰되는 약한 밴드는 각각 펩티드 결합 내에서 아미드 I (-CONH-)의 신축 진동 및 아미드 II (-CONH-)의 굽힘 진동으로 인한 것이고, 이는 PLGA 나노 섬유 지지체에서 P-g-nHA가 존재함을 의미한다. 즉, 나노 섬유 기질 내부에 P-g-nHA가 존재하는 골 재생용 생체 재료가 제조되었음을 알 수 있다.
또한, 도 4는 실시예 1 및 실험예 4에 따른 (a) PLGA 나노 섬유 지지체, (b) nHA, (c) P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체 및 (d) P-g-nHA의 X-선 광전자 분석법(ESCA, Electron Spectroscopy for Chemical Analysis)에 의한 스펙트럼 그래프이다. 도 4(d)의 그래프에서 질소(N1s)와 탄소(C1s)에 대응하는 397.9와 284.6eV의 두 개의 새로운 광전자 신호를 볼 수 있고, 이는 PLGA(C1s)와 P-g-nHA(N1s와 P2p)의 특징에 따라 나타나는 마커 신호이므로 이를 통해 골 재생용 생체 재료의 PLGA 고분자 기질 내부에 P-g-nHA가 존재함을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 골 재생용 생체 재료 및 이의 제조 방법은 천연 뼈와 구조적 또는 화학적 조성이 동일한 혈액 적합성과 세포조직 적합성이 뛰어난 생체 적합성 고분자 재료를 이용하여, 조골 세포를 활성화함과 동시에 파골 세포의 사멸을 야기하여 골 손실과 골다공증을 억제할 수 있다. 먼저, 도 5a 및 도 5b는 각각 실험예 6, 8에 따른 조골 세포 및 파골 세포의 MTT 분석 그래프이다. 이를 통해, 조골 세포와 파골 세포의 증식 여부를 확인할 수 있다. 도 5a에서 볼 수 있듯이, P-g-nHA/PLGA의 경우에도 nHA/PLGA의 경우와 비교할 때 표준 편차 이내의 조골 세포의 증식을 보인다. 이를 통해 제조된 골 재생용 생체 재료가 조골 세포에 좋은 세포 적합성을 가져, 골 질환 치료 또는 골 재생용 재료로서 우수한 효과를 보임을 확인할 수 있다.
결국, 본 발명을 통해 천연 뼈와 구조적 또는 화학적 조성이 동일한 생체 적합성 재료와 약물을 이용하여, 조골 세포를 활성화하고 파골 세포의 활성을 억제하여 다양한 골 질환의 치료제로 이용될 수 있는 골 재생용 생체 재료 및 그의 제조 방법을 제공할 수 있다. 또한 이식된 재료와 재생되는 골 조직 사이의 상호작용을 향상시켜 의료분야에 유용하게 응용될 수 있는 골 재생용 생체 재료 및 그의 제조 방법도 제공할 수 있다.
실시예
이하 본 발명을 실시예에 의해 설명한다. 다만 본 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
NO 시료 제조사 제품번호 분자식 분자량
(g/mol)		 함량
(몰%))
1 PLGA Sigma Aldrich 739979 [C3H4O2]x[C2H2O2]y 240,000 락티드:글리콜 = 85 : 15
2 파미드론 산 Sigma Aldrich - HOCH2COOH 76.05 -
3 L-글루타민 산 Sigma Aldrich - HO2CCH2CH2CH(NH2)CO2H 147.13 -
4 수산화아파타이트 나노 입자 직접 합성 직접 합성 Ca5(PO4)3(OH) 502.31 -
5 골아 세포 한국 세포 은행 MC3T3-E1 - - -
6 대식 세포 한국 세포 은행 RAW 264.7 - - -
표 1은 본 실시예에 사용되는 시약들의 제원을 나타낸다.
NO 장비 제품번호 제조사
1 MTT(세포 독성 실험, 3-(4,5-디메틸 티아 졸-2-일)-2,5-디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드, 3-(4,5-dimethylazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 키트 11465007001 Sigma Aldrich
2 알리자린 레드 염색 키트 A5533 Millipore
표 2는 본 실시예에 사용되는 분석시약의 제원을 나타낸다.
< 실시예 1>
(1) 수산화아파타이트 표면에 파미드론 산을 결합시키는 단계
수산화아파타이트 나노 로드(nHA)는 종래에 알려진 방법에 약간의 변형을 가한 방법으로 합성하였다. nHA 표면에 파미드론 산을 결합시키는 과정은 두 단계로 진행하였다. 먼저, nHA표면을 L-글루타민 산으로 변형을 가하였고 그 다음, 파미드론 산을 L-글루타민 산이 결합된 g-nHA(grafted nHa)의 말단 카르복실기에 결합시켰다. 과량의 L-글루타민 산을 탈 이온수에 해리시킨 후, L-글루타민 산의 말단 COOH기를 수용성 카르보다이이미드 (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride) (0.5g, 0.25중량%) 와 N-하이드록시석신이미드(0.05g, 0.25중량%)에서 6시간 동안 활성화 시켰다. 말단 COOH기를 성공적으로 활성화 시킨 후, nHA 표면을 L-글루타민 산으로 바꾸기 위하여 nHA를 L-글루타민 산과 수용성 카르보다이이미드 용액에 넣고 6시간 동안 교반하였다. L-글루타민산이 결합된 nHA를 원심 분리한 후 세척하고 건조시켰다. 두 번째 단계에서, L-글루타민 산이 결합된 nHA는 수용성 카르보다이이미드 용액에 재분산되며 변형된 L-글루타민 산이 결합된 nHA의 표면의 자유로운 말단 COOH를 활성화시키기 위해서 6시간동안 교반하였다. 카르보실기 활성화 단계를 거친 후, 파미드론 산(10-4 M, 100mL)을 카르보다이이미드와 L-글루타민 산이 결합된 nHA용액에 첨가하고 6시간 동아 더 교반하였다. 그 다음, P-g-nHA(Pamidronic acid-grafted nHA)를 여러 번의 원심분리 및 세척과정을 거쳐 nHA와 결합하지 않은 파미드론 산을 nHA표면에서 제거해준 후, 건조하였다.
(2) 방사 용액을 준비하고 전기 방사하는 단계
PLGA 중합체를 20중량% 및 잔량의 THF:DMF를 용매로 한 PLGA 중합체 용액을 상기에 설명한 대로 준비하였다. THF/DMF 혼합 용매에 PLGA 중합체가 완전히 용해된 후, 중합체 용액으로 전기 방사를 실시하였다. 전기방사 변수는 바늘과 콜렉터 사이의 간격은 20cm, 유속은 1ml/h, 적용된 전압은 20kV이다. 매끄럽고 균일한 나노 섬유는 바늘 끝의 테일러 콘(Taylor cone)에서 생성되며, 고정된 간격을 유지하는 콜렉터에 모아졌다. 유사한 방법이 nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA의 전기방사를 이용한 나노 섬유 지지체의 제조에 이용되었다. 요약하면, nHA와 P-g-nHA(5중량%)는 이진 용매(THF:DMF)에 별도로 분산시켜 나중에 PLGA와 혼합하였다. 방사 용액은 전기 방사하기 전, 하룻밤 동안 교반하였다.
실험예 1 : 골 재생용 생체 재료의 FE-SEM 사진
FE-SEM 이미지는 본래의 PLGA, P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체의 전기방사의 형태를 결정하는데 이용되었다. FE-SEM 현미경 사진에 기초하여, 모든 지지체가 균일한 형태로 보였다. 나노 섬유의 직경에는 PLGA 나노 섬유 기질 안의 본래의 nHA와 P-g-nHA의 결합에 의해서도 급격한 변화가 관측되지 않았다(도 1a).
실험예 2 : 골 재생용 생체 재료의 TEM 연구
TEM은 본래의 PLGA, P-g-nHA/PLGA 하이브리드나노 섬유 지지체의 형상과 존재를 확인하기 위해서 이용되었다. TEM 분석은 전기방사 나노 섬유의 균등한 형태뿐만 아니라 P-g-nHA와 본래의 nHA가 성공적으로 PLGA 나노 섬유 기질 내에 포함되었는지 여부를 알려준다. PLGA 나노 섬유 기질(도 2(d)) 내부에서의 P-g-nHA의 분산이 본래의 nHA의 경우(도 2(c))보다 비교적 좋았다. 유사한 현상이 TEM으로 본래의 nHA(그림 3a)와 P-g-nHA(도 2(b))의 형태를 관찰할 때 나타났다. P-g-nHA의 더 나은 분산력은 nHA에 결합된 파미드론 산의 반발력에 기인한 것이다. nHA의 낮은 분산력은 높은 표면적의 결과로 인한 응집에 기인한 것이다. nHA에 파미드론 산을 결합하기 전, 후의 특징적인 회절 피크는 육각형 대칭의 nHA 단위 세포에 대하여 002, 102, 210, 112, 300, 212, 130, 213, 321, 004, 104 면에 대해 각각 26.1°에서 28.45°, 30.1°, 32.90°, 35.97°, 40.19°, 41.82°, 53.56°, 55.75°, 57.40°, 69.12°, 74.45°, 77.56°에서 나타난다. 이와 마찬가지로, 피크들은 본래의 nHA와 P-g-nHA 모두 같은 위치에서 나타났다. nHA와 P-g-nHA의 XRD 결과값으로부터, nHA 표면에 파미드론 산이 결합됨으로 인해 nHA의 결정성이 영향을 받지 않음을 알 수 있었다.
실험예 3 : 골 재생용 생체 재료의 FTIR 연구
본래의 nHA, nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA 나노 섬유 지지체의 FTIR 스펙트럼 분석은 L-그루탐산이 결합된 nHA의 표면에 파미드론산이 성공적으로 결합되었는지 여부를 확인하고, PLGA 고분자 나노 섬유 기질에 P-g-nHA가 존재하는지를 알 수 있다. 본래의 nHA의 FTIR 스펙트럼은 두 개의 날렵한 밴드를 보여주고, 이는 각각 1000-1100cm-1 영역에서 정사면체(regular tetrahedral)PO4 - 3 의 피크와 3580cm-1에서의 자유로운 하이드록시기의 피크이다(도 3(a)). PLGA의 스펙트럼은 1720cm- 1영역에서 특직정인 카보닐기(c=o) stretching 밴드를 보이고, 2950~3000cm-1 영역에서 두 개의 탄화수소 (CH, CH2) 밴드를 보였다(도 3(c)). 1648cm-1과 1540cm-1의 아미드 I 및 II 결합 피크를 통해 nHA 표면에 L-그루탐산을 스페이서(spacer)로 이용하여 파미드론산을 성공적으로 결합하였음을 확인할 수 있었다(도 3(b)). P-g-nHA/PLGA의 스펙트럼(도 3(d))은 nHA와 PLGA의 특징적인 밴드를 보여준다. 1648cm-1과 1540cm-1에서의 약한 밴드는 각각 펩티드 결합 내에서 아미드 I (-CONH-)의 신축 진동 및 아미드 II (-CONH-)의 굽힘 진동으로 인한 것이고, 이는 PLGA 나노 섬유 지지체에서 P-g-nHA가 존재함을 의미함을 알 수 있었다. 아미드 I (CONH) 및 아미드 II(CONH ) 밴드의 강도의 감소는 과도한 PLGA의 영향 때문이다.
실험예 4 : 골 재생용 생체 재료의 X-선 광전자 분석법(ESCA, Electron Spectroscopy for Chemical Analysis)에 의한 스펙트럼
ESCA 스펙트럼으로 계산되는 나노 섬유 지지체의 화학적 성분은 nHA의 표면 변화를 설명하는데 필요하다. ESCA는 PLGA 섬유 기질 내부에 본래의 nHA와 P-g-nHA가 존재하는지 여부를 확인하기 위해서 수행되었다. 질소(N1s)의 광전자 신호는 PLGA 나노 섬유 내부에 P-g-nHA가 존재하는 지 여부를 확인하기 위한 마커로 간주되었다. PLGA 나노 섬유의 ESCA 스펙트럼은 C1s(결합에너지, 284.6eV)와 O1s(결합에너지, 536.1eV)에 대응하는 두 개의 광전자 신호를 보여주었다(도 4b(a)). 대조적으로, nHA는 O1(결합에너지, 536.1eV), Ca2p(결합에너지, 347.9eV), P2p(결합에너지, 133.2eV)의 세가지 특징적인 광전자 신호를 보여주었다(도 4b(b)). P-g-nHA의 ESCA 스펙트럼은, 질소(N1s)와 탄소(C1s)에 대응하는 397.9와 284.6eV의 두 개의 새로운 광전자 신호를 보였다(도 4b(d)). PLGA(C1s)와 P-g-nHA(N1s와 P2p)의 특징에 따라 나타나는 마커 신호는 P-g-nHA/PLGA의 스펙트럼에서 관측되었다(도 4b(c)). 그러므로, 이러한 결과들을 통해 PLGA 고분자 기질에 P-g-nHA가 존재함을 확인할 수 있었다.
실험예 5 : 세포 점착 관찰
PLGA에 대한 조골 세포(MC3T3-E1)의 반응을 확인하기 위하여, 조골 세포 (3×104 cells/mL)를 나노섬유 지지체를 장착한 4-well 배양접시에 넣고 37°C, 5 부피% 이산화탄소 조건의 습한 대기에서 1일 또는 3일 동안 배양하였다. 배양을 한 다음, 표면에 뜨는 것들을 제거하고 나노 섬유 지지체를 PBS로 세척한 후 2.5 몰% 글루타르알데히드 용액에 10분동안 고정시켰다. 그 다음 샘플들을 탈수, 건조한 후 금으로 스퍼터 코팅했다.
FE-SEM 이미지에서 관측되는 바와 같이, 조골세포는 모든 지지체에 부착되고 증식하였지만, PLGA(도 1b(a), (d)) 위에서 보다 nHA/PLGA(도 1b(b), (e))와 P-g-nHA/PLGA 나노 섬유 지지체(도 1b(c), (f))위에서 더 잘 증식함을 알 수 있었다. nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA 하이브리드 섬유 지지체 위에서의 조골세포의 부착과 증식은 nHA의 존재에 의해 조골세포에 향상된 세포 적합적 환경을 제공하는 것으로부터 기인한 것이다.
실험예 6 : 실시예 1에 의한 조골 세포의 MTT 분석
nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체뿐만 아니라 본래의 PLGA에 대한 조골 세포의 증식을 확인하기 위해서도 MTT 분석을 이용하였다. 간단히 말하면, 밀도 3×104 cells/mL 의 조골 세포를 4-well 접시에 고정시켜 놓은 PLGA 및 nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA 나노 섬유 지지체에 배양하였다. 조골 세포의 증식은 1일과 3일동안의 배양을 통해 관측하였다. MTT 용액 (50μL, 5 mg/mL in PBS)을 각 well에 첨가하고, 4시간동안 37°C 조건에서 5 부피%의 이산화탄소가 포함되어 습한 대기 상태로 배양하였다. 배지를 제거한 후, 변환된 염료는 산성 이소프로판올(0.04 N HCl-isopropanol)에서 용해시키고 20분동안 25°C조건에서 어두운 곳에서 배양했다. 각각의 샘플로부터, 배지(100μL)를 96-well 접시에 옮기고, 파장 570nm의 자외선 광으로 변환 색소를 관측하였다.
상기의 실험 과정에 따라 nHA/PLGA, P-g-nHA/PLGA 나노 섬유 지지체뿐만 아니라 PLGA의 세포 적합적 성질은 MTT 분석을 이용해 조골 세포의 생존율 분석을 통해 확인하였다(도 5a). 분석 결과는 조골 세포의 증식을 알 수 있게 한다. 세포의 증식은 본래의 PLGA 나노섬유 지지체에 비해서, nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA 위에서 더 큰 범위로 일어났다. 전술한 바와 같이, 조골 세포의 증식의 향상은 조골 세포의 성장을 촉진시키는 nHA의 존재로부터 기인한 것일 수 있다. nHA/PLGA 위에서의 조골 세포의 증식은 P-g-nHA/PLGA 하이브리드 섬유 지지체와는 약간의 차이만을 보일 뿐이며, 표준 편차 이내이며, 두 지지체 모두 좋은 세포 적합성을 가짐을 보여준다.
실험예 7 : 실시예 1에 의한 액틴 세포 골격 분석
(1) 본래의 PLGA 뿐만 아니라 nHA/PLGA 와 P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체, 액틴, DAPI(4,6-디아미디노-2-페닐인돌)의 세포 골격을 평가하기 위해서, 제조업체의 지침에 따라 두 번 염색을 수행하였다. 간단히 요약하면, 밀도 2×104cells/mL의 조골 세포를 지지체 상에 뿌리고 3일간 배양하였다. 세포를 4몰% 파라포름알데히드 PBS에 고정하였다. 고정을 한 다음, 샘플을 0.05몰% 트윈-20을 포함한 PBS(인산완충식염수, phosphate buffer saline)로 세척하였다. 그 다음, 그 샘플을 0.1몰% 트리톤 X-100 포함한 PBS로 25°C에서 15분간 투과시키고 1몰% 소혈청알부민을 포함한 PBS에서 30분간 배양하였다. 그 다음, 5(6)-테트라 메틸로다민·이소티오시아네이트-컨쥬게이티드 팔로이딘 (5(6)-tetramethyl-rhodamineisothiocyanate-conjugated phalloidin, TRITC, Millipore)를 대략 30분간 첨가한다. 샘플을 PBS로 각 10분씩 총 3번 세척하였고, DAPI (Millipore)에 5분 동안 배양하였다. PBS로 지지체를 세 번(각 10분씩) 세척한 후, 레이저 현미경(Model 700; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 형광 이미지를 관측하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 PLGA, nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에서의 조골세포의 부착 및 증식은 DAPI와 RITC(로다민-B-이소티오시아네이트, rhodamin-B-isothicyanate) 더블-염색으로 더 분석할 수 있었다. 도 6a는 조골세포가 잘 부착되었고 모든 지지체에 퍼져있음을 보여준다. 더 나은 세포 적합적 환경이 nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA에 의해 제공되었기 때문에, 조골세포는 PLGA 나노 섬유 지지체(도 6a(a)) 위에서 보다 P-g-nHA/PLGA 수산화 나노섬유 지지체(도 6a(b), (c)) 위에서 널리 퍼졌다.
(2) PLGA뿐만 아니라 nHA/PLGA, P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체의 전기방사로 배양한 MC3T3 조골 세포의 알리자린 레드 염색으로 골 형성 여부를 확인하였다. 요약하면, MC3T3 조골 세포를 배양한 후, 배지는 세포에 영향을 주지 않고 흡인되었다. 세포를 포함한 배양 접시는 PBS로 두 번 씻었다. 세포를 10몰%의 포름알데히드로 고정하였고 실온에서 15분 동안 배양하였다. 정착액을 조심스럽게 제거하고 세포를 증류수로 3회 (각 10분) 세척하였다. 세척 후, 과량의 물을 제거하였다. 알리자린 레드 염색 용액(1mL/well)을 세포에 첨가하고, 샘플을 30분 동안 배양하였다. 과량의 염료는 샘플을 증류수로 4번(각 5분), 부드럽게 흔들어 세척하여 염색된 세포로부터 제거하였다. 염색된 세포의 디지털 이미지는 카메라(Axioplan 2, Carl Zeiss)를 이용해 얻었다. 알칼리성 포스파타제 (ALP) 활성은 본래의 PLGA, P-g-nHA/PLGA 하이브리드 나노 섬유 지지체에 배양된 조골 세포의 차이점을 평가하기 위한 마커로 사용되었다. ALP 활성은 우리의 연구에 의한 보고 및 제조업자의 프로토콜대로 평가되었다. 간단히 요약하면, 조골 세포는 하이브리드 나노 섬유 지지체에 15~21일 동안 뿌려진다. 세포 배양 배지를 제거하고 난 후, 세포는 PBS로 세척하였고, 세포 용해는 4°C에서 완충(2mM MgCl2와 0.05몰% 트리톤 X-100 (pH 8.2)를 포함하는 10 mM 트리스 염산)조건으로 수행되었다. 그 다음, 세포 용해액을 4°C조건에서 5분동안 15,000rpm 조건으로 원심 분리하였다. 상등액은 ALP 실험에 사용하였다. 용해액은 25°C 하에서 1시간 동안 ALP 검출 완충액에서 배양되었다. ALP 반응은 ALP 정지 용액 20 mL를 첨가하여 멈추게 하였고, 405nm에서 샘플을 분석하였다.
알리자린 레드 염색 실험의 결과는 ALP 활성 측정을 통해 얻을 데이터를 확인할 수 있다. 알리자린 레드 염색 결과에 기초하여, 더 많은 조골세포가 PLGA 나노 섬유 지지체(도 6a(d), 밝은 빨간색)에서 보다 nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA 수산화 나노섬유 지지체(도 6a(f), 어두운 빨간색)에서 골 형성을 시행하였다. 이러한 골 형성의 증가는 주로 PLGA 나노 섬유 기질에서의 nHA의 존재로부터 기인한 것이고, 그 다음으로 뼈의 칼슘을 조절하는 파미드론 산으로부터 기인한 것이다.
ALP 효소가 골 형성 중에 발현되기 때문에, ALP 활성은 골 형성의 마커로 확인 가능하다. 게다가, 연구진은 ALP가 자연 침전되는 칼슘과 인의 레벨을 측정하는데 도움이 된다고 제안하였다. 도 6a(g)에서 보는 바와 같이, nHA/PLGA와 P-g-nHA/PLGA 수산화 나노섬유 지지체의 향상된 ALP 활성은 PLGA 나노 섬유 기질의 nHA의 존재에 따른 것이고, 본래의 PLGA 나노섬유 지지체와 비교되는 하이브리드 나노 섬유 지지체로부터의 칼슘이온의 방출로 인한 것이다.
실험예 8 : 실시예 1에 의한 파골 세포의 MTT 분석
본래의 PLGA, P-g-nHA/PLGA 하이브리드나노 섬유 지지체에서 분화된 파골 세포의 생존여부를 검사하기 위해서, 분화된 파골 세포를 3일동안의 배양 후 형광 색소(calcein-AM)와 프로피디움 요오드화물로 염색하였다. 분화된 파골 세포를 밀도 1×105 - 1×106cells/mL 조건의 PBS에서 현탁하였다. 이어서, 200μL의 세포 현탁액을 100μL의 분석 용액과 혼합하였고 37°C에서 15분간 배양하였다.
분석 용액 조성물은 다음과 같다; 10μL 형광 색소(calcein-AM) 용액(1mM, 다이메틸설폭시화물), 5μL 프로피디움 요오드화물(1.5mM, 물), 5mL PBS. 이를 490nm에서 여기시켜 동시 관측 가능한 모니터로 생존 및 죽은 세포를 형광 현미경으로 조사하였다.
이러한 실험 과정을 통해 PLGA, nHA/PLGA, P-g-nHA/PLGA 나노 섬유 지지체에서의 파골 세포의 증식을 MTT 분석으로 확인할 수 있었다. 도 5b는 파골 세포의 증식이 PLGA 와 nHA/PLGA 나노 섬유 지지체의 경우에 비하여 P-g-nHA/PLGA 나노섬유 지지체로 인해 방해됨을 알 수 있었다. 파골 세포의 성장 지연은 nHA/PLGA 나노 섬유 지지체에 결합된 파미드론 산의 존재로부터 기인한 것이며, 이는 파골 세포의 사멸을 야기하였다.
실험예 9 : 실시예 1에 따른 세포 생존 실험
P-g-nHA/PLGA 나노 섬유 지지체의 조골 세포와 파골 세포의 세포 생존 실험은 형광 색소인 칼세인AM (calcein-AM)과 요오드화프로피디움(propidium iodide)을 이용하여 진행된다. 결과는 녹색 형광 이외에도, 파골 세포의 일부가 적색 형광을 나타냄을 보여준다. 적색 형광(도 6b(e))은 파미드론 산의 존재 하에서 세포 사멸(파골 세포의 자살 효과의 한 종류)로 인한 것이다. 하지만, 조골 세포(도 6b(d))와 대식세포(도 6b(f))는 오직 녹색 형광만을 보인다. 이러한 결과는 파미드론 산의 존재가 조골 세포의 생존과 대식세포의 미분화에 어떠한 불리한 영향을 미치지 않는 다는 것을 보여준다.

Claims (14)

  1. 나노 섬유의 기질 내부에 수산화 아파타이트 나노 입자가 분산되고;
    상기 나노 섬유의 기질은 생체 적합성 고분자이고;
    상기 기질 내부에 분산된 수산화 아파타이트 나노 입자와 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물은 링커(Linker)를 통해 결합하고;
    상기 링커는 나노 섬유 기질 내부의 분산성을 향상시키기 위하여 수산화 아파타이트 나노 입자에 비하여 소수성을 가지는 화합물인 골 재생용 생체재료.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노 섬유는 전기 방사로 제조된 것을 특징으로 하는 골 재생용 생체재료.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 생체 적합성 고분자는 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리락티드-글리콜리드 공중합체, 폴리락티드-카프로락톤 공중합체 및 폴리글리콜리드-카프로락톤 공중합체로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 골 재생용 생체 재료.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생체 적합성 고분자는 PLGA(폴리락산-글리콜산 공중합체)인 것을 특징으로 하는 골 재생용 생체 재료.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 수산화 아파타이트 나노 입자가 로드(rod) 형태인 것을 특징으로 하는 골 재생용 생체 재료.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물은 파미드로네이트(pamidronate), 알렌드로네이트(alendronate), 시마드로네이트(cimadronate), 클로드로네이트(clodronate), 이비-1053(EB-1053), 에티드로네이트(etidronates), 이반드로네이트(ibandronate), 네리드로네이트 (neridronate), 올파드로네이트(olpadronate), 리세드로네이트(risedronate), 틸루드로네이트 (tiludronate), 인카드로네이트(incadronate), 미노드로네이트(minodronate), YH 529, 졸레드로네이트(zoledronate), 및 이들의 약리적으로 허용되는 염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 골 재생용 생체 재료.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 하기 화학식 1의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 생체 재료.
    [화학식 1]
    Figure 112016096907046-pat00005

    -상기 식에서
    Figure 112016096907046-pat00006

    R1는 아민(-NH2) 또는 아민을 포함하는 C1~C3의 알킬기이며,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소, 카르복실기(-COOH), 아마이드기(-CONH2) 또는 디하이드로겐 포스페이트기(-H2PO4)이며, R2 및 R3 중 적어도 하나는 수소가 아니고,
    m 및 n은 정수이고, m은 0≤m≤3이고, n은 2≤n≤6이며, m과 n은 2≤m+n≤6의 조건을 만족하는 것을 특징으로 하는 화합물인 골 재생용 생체 재료.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 생체재료는 3차원 기공 구조를 갖는 나노 섬유 집합체인 골 재생용 생체 재료.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물과 결합한 수산화 아파타이트 나노 입자가 나노 섬유 내부에 0.1~10 중량% 포함된 것을 특징으로 하는 골 재생용 생체 재료.
  12. (1) 비스포스포네이트(bisphosphonate, BP)계 약물이 링커(Linker)를 통해 결합된 수산화 아파타이트 나노 입자를 준비하는 단계;
    (2) 상기 수산화 아파타이트 나노 입자를 생체 적합성 고분자를 포함하는 섬유형성성분에 투입하여 방사 조성물을 제조하는 단계; 및
    (3) 상기 방사 조성물로부터 나노 웹을 수득하는 단계;를 포함하며
    상기 링커는 나노 섬유 기질 내부의 분산성을 향상시키기 위하여 수산화 아파타이트 나노 입자에 비하여 소수성을 가지는 화합물인 골 재생용 생체 재료의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 (3) 단계의 방사 조성물을 전기 방사하여 나노 웹을 수득하는 것을 특징으로 하는 골 재생용 생체 재료의 제조 방법.
  14. 제12항 또는 제13항 중 어느 한 항의 제조 방법으로 제조된 골 재생용 생체 재료.



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