KR20200094473A

KR20200094473A - 하이드록시아파타이트에 단백질이 공유 결합된 생체접합용 복합체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20200094473A
Application number: KR1020190011998A
Authority: KR
Inventors: 박성순; 전민정; 정수현
Original assignee: 성신여자대학교 연구 산학협력단
Priority date: 2019-01-30
Filing date: 2019-01-30
Publication date: 2020-08-07
Also published as: KR102233145B1

Abstract

본 발명은 인산칼슘계 생체세라믹, 아미노기 및 카르복실레이트기를 포함하는 링커 화합물 및 소수성 단백질이 공유 결합되어 형성된 생체접합용 복합체 및 이의 제조 방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 펩타이드-커플링제를 이용함으로써 생체세라믹인 하이드록시아파타이트와 단백질을 공유결합으로 접합하는 효과적인 제조방법을 제공한다.
펩타이드-커플링제를 사용하여 소수성 단백질이 아닌 단백질을 생체세라믹에 직접 접합할 수 있고, 소수성의 단백질의 경우는 펩타이드-커플링제를 이용함으로써 생체세라믹과 링커 또는, 생체세라믹 및 링커 접합체와 생체 촉매의 접합 효율을 향상시킬 수 있다. 그 뿐만 아니라 링커 화합물을 이용함으로써 극성인 생체세라믹 표면에 소수성의 생촉매를 용이하게 결합시킬 수 있다. 상기 제조 방법으로 제조된 생체접합용 복합체는 소수성 단백질을 포함한 기능성 단백질들이 생체세라믹 표면에 공유 결합되어 있어 생체에 적합한 조직공학용 지지체, 조직재생 유도용 및 차폐용 재료 및 생체세포 증식기재 등에 적용할 수 있다.

Description

하이드록시아파타이트에 단백질이 공유 결합된 생체접합용 복합체 및 이의 제조방법{COMPOSITES FORMED BY COVALENT BONDING BETWEEN HYDROXYAPATITE AND HYDROPHOBIC PROTEIN, AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 생체세라믹(하이드록시아파타이트)과 소수성 단백질이 공유 결합된 생체접합용 복합체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 인산칼슘계 생체세라믹, 아미노기 및 카르복실레이트기를 포함하는 링커 화합물 및 단백질이 공유 결합되어 형성된 생체접합용 복합체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

자가복구기능을 손실한 조직을 재생시키기 위하여 조직과 조직을 이어주는 역할을 하는 경조직 재생용 지지체의 소재로 이용되는 대표적인 세라믹에는 뼈 광물상과의 화학적 유사성을 가진 인산칼슘계 세라믹이 있다. 인산칼슘계 세라믹 중 하나인 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite, HAp, 수산화회인석)은 생물학적 뼈 시스템의 주요 구성 성분이며, 생체 적합성 및 환경적으로 양성인 물질로 간주된다. 하이드록시아파타이트는 칼슘 이온, 인산염 및 수산화물이 화학적으로 Ca₅(PO₄)₃(OH)형태로 구성되어 있으며, 시험관 내에서 간단하게 합성 할 수 있다. 체내에서의 정확한 메커니즘이 명확하게 밝혀지지는 않았지만, 골아 세포는 성장하는 뼈에서 하이드록시아파타이트를 생성하는 역할을 한다. 뼈 성장 동안, 많은 단백질은 복잡한 뼈 시스템을 조립하기 위해 하이드록시아파타이트와 상호 작용하고 결합한다. 하이드록시아파타이트의 생체 친화성 외에도, 단백질에 대한 본래의 친화성은 단백질 정제 및 나노 의학과 같은 많은 생물학적 응용에 사용되어왔다. 이러한 하이드록시아파타이트의 특성은 하이드록시아파타이트가 생촉매를 고정화하기 위한 지지체 물질로서 적합함을 시사한다. 많은 단백질이 하이드록시아파타이트에 물리적으로 흡착될 수 있지만, 소수성 표면을 갖는 단백질은 하이드록시아파타이트 표면이 하전되어 완전히 양극화 되어 있기 때문에 하이드록시아파타이트 표면에 흡착될 수 없다. 이러한 소수성 단백질의 접합을 위해, 공유 결합은 대안적인 접근법이 될 것이다.

종래에 하이드록시아파타이트에 단백질을 접합시키기 위한 방법으로서 히드라진 또는 아민으로부터 유도된 비스포스포네이트와 같은 특정 화합물을 링커로 사용하는 공유 결합 방법을 있다. 상기 히드라진 또는 아민으로부터 유도된 비스포스포네이트 링커 화합물에서 인산기는 하이드록시아파타이트 상의 칼슘 이온에 배위 결합하고, 링커 화합물의 다른 쪽(즉, 히드라진 또는 아민기)은 단백질 결합을 위한 자리를 제공함으로써 하이드록시아파타이트와 단백질을 접합시킨다. 그러나, 상기와 같이 히드라진 또는 아민으로부터 유도된 비스포스포네이트를 사용하는 접합 공정은 링커 화합물의 다단계 합성 또는 단백질의 추가 변형이 요구된다는 단점이 있다.

또한, 글리신을 링커 화합물로 사용하는 방법도 있는데, 이 방법은 하이드록시아파타이트의 제조 과정에서 하이드록시아파타이트에 글리신을 도입한 다음 공유 결합을 위해 글리신의 아미노 그룹을 사용함으로써 하이드록시아파타이트와 단백질을 접합시키고자 하였다. 이 방법은 링커 화합물의 다단계 합성을 필요로 하지 않지만, 하이드록시아파타이트의 합성 중에 글리신이 혼입되어야하기 때문에 미리 제조된 하이드록시아파타이트에 적용하기 어렵다는 단점이 있다.

따라서 단백질, 특히 소수성 단백질에 대한 하이드록시아파타이트의 적용 범위를 넓히기 위해서는 공유 결합을 통한 간편한 단백질 공액법 공정이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하고, 하이드록시아파타이트와 같은 생체세라믹과 소수성 단백질인 리파아제와 같은 생촉매를 접합시키기 위한 방법을 예의 연구노력한 결과, 일련의 펩타이드-커플링제들이 하이드록시아파타이트와 단백질을 직접 공유결합시킬 수 있음을 확인하였다. 특히 소수성 단백질의 경우에는, 하이드록시아파타이트와 소수성 단백질 사이의 반발력을 상쇄시키기 위한 링커화합물이 필요함을 확인하였다. 이를 통해 인산칼슘계 생체세라믹, 아미노기 및 카르복실레이트기를 포함하는 링커 화합물 및 소수성 단백질이 공유 결합되어 형성된 생체접합용 복합체의 경우, 생촉매인 소수성 단백질이 링커 화합물에 의해 생체세라믹에 결합되어 있어 조직공학용 지지체 또는 골조직 지지체로서의 가능성을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

KR

10-2015-0028976

A

KR

10-2014-0028924

A

본 발명의 주된 목적은 생체 활성 및 생분해성을 갖고, 조직공학용 지지체 또는 골조직 지지체로서의 유용한 생체세라믹 및 소수성 단백질이 공유 결합된 생체접합용 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질이 공유 결합된 생체접합용 복합체를 이용한 조직공학용 지지체, 골 충진용 또는 치공 충진용 의료재료 및 조직재생 유도용 또는 차폐용 막을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 세 가지 성분이 공유 결합되어 있는 생체접합용 복합체를 제공한다.

(i) 인산칼슘계 생체세라믹;

(ii) 아미노기 및 카르복실레이트기를 포함하는 링커 화합물; 및

(iii) 소수성 단백질.

종래에 인산칼슘계 생체세라믹은 표면이 극성이기 때문에 소수성의 생촉매를 생체세라믹 표면에 접합시키기 어려워 조직공학용 지지체로서 이용하는데 한계가 있었다. 이에, 본 발명자들은 생체세라믹 표면에 소수성의 생촉매를 용이하게 결합시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 생체접합용 복합체에 있어서, 상기 인산칼슘계 생체세라믹은 종래에 조직공학용 지지체를 제조하기 위하여 이용된 어떠한 인산칼슘계 생체세라믹도 이용될 수 있으나, 바람직하게는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite), DCPD(Dicalcium phosphate dihydrate), MCPM(Monocalcium phosphate monohydrate), DCPA(Dicalcium phosphate anhydrous), α-TCP(α-Tricalcium phosphate) 및 β-TCP(β-Tricalcium phosphate)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 인산칼슘계 생체세라믹일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 생체접합용 복합체에 있어서, 상기 링커 화합물의 아미노기는 인산칼슘계 생체세라믹과 공유 결합하고, 링커 화합물의 카르복실레이트기는 소수성 단백질과 공유 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 링커 화합물은 6-아미노헥사노산(6-aminohexanoic acid; 6-AmH)일 수 있으며, 상기 6-AmH은 아미노 그룹과 카복실레이트 그룹 사이에 5 개의 탄소를 가지고 있기 때문에 하이드록시아파타이트와 소수성 단백질의 표면 사이의 반발 작용을 줄이는 데 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 생체접합용 복합체에 있어서, 상기 소수성 단백질은 종래에 생촉매로 이용된 어떠한 소수성 단백질도 포함될 수 있으나, 바람직하게는 리파아제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 생체접합용 복합체에 있어서, 상기 리파아제는 캔디다 루고사 리파아제(CRL), 부르크홀데리아 세파시아 리파아제 (BCL) 및 칸디다 안타르크티카 리파아제 B (CAL-B)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 리파아제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 생체접합용 복합체의 특성을 확인하기 위하여 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 및 분말 X 선 회절 (PXRD)의 분석을 한 결과, 링커 및 리파아제가 결합된 하이드록시아파타이트의 형태 및 결정성을 변화시키지 않음을 확인하였다(실험예 4, 도 5 및 도 6 참조). 또한, IR 분석을 통해 링커 및 리파아제가 결합된 하이드록시아파타이트의 피크를 확인한 결과, 링커, 리파아제 및 하이드록시아파타이트에 대한 특징적인 피크가 모두 보존된 것을 확인하였다(실험예 4 및 도 7 참조). 이러한 결과는, 본 발명에 따른 생체접합용 복합체는 인산칼슘계 생체 세라믹에 링커 및 생촉매가 순차적으로 접합된 구조로 형성되어 있어 조직공학용 지지체로서 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 생체접합용 복합체의 리파아제의 재활용 여부를 확인한 결과, 리파아제가 결합된 생체접합용 복합체가 10번의 재활용 후에도 활성이 유지되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, 본 발명에 따른 생체접합용 복합체는 결합단백질의 안정성을 효과적으로 유지 가능하기 때문에 조직공학용 지지체로서 이용할 경우, 유리한 효과를 얻을 수 있음을 시사한다(실험예 6 및 도 8 참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은, 인산칼슘계 세라믹을 펩타이드-커플링제에 혼합하여 활성화 시키는 제1 단계; 링커 화합물 용액에 제1 단계에서 활성화된 인산칼슘계 세라믹을 현탁시키는 제2 단계; 제2 단계의 현탁액을 원심분리하여 침전물을 수득한 후, 침전물을 세척하는 제3 단계; 상기 제3 단계의 침전물을 펩타이드-커플링제와 혼합하여 배양하는 제4 단계; 상기 제4 단계의 침전물을 소수성 단백질이 포함된 용액에 재현탁시킨 다음 배양하는 제5 단계; 및 제5 단계의 용액을 원심분리하여 소수성 단백질이 결합된 복합체를 수득하는 단계를 포함하는 생체접합용 복합체의 제조 방법을 제공한다.

종래에 인산칼슘계 생체세라믹은 표면이 극성이기 때문에 소수성의 생촉매를 생체세라믹 표면에 접합시키기 어려워 조직공학용 지지체로서 이용하는데 한계가 있었다. 이에, 본 발명자들은 펩타이드- 커플링제를 이용할 경우 접합 효율을 향상시킬 수 있고, 링커를 이용할 경우 생체세라믹 표면에 소수성의 생촉매를 용이하게 결합시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 생체접합용 복합체의 제조 방법에 있어서, 상기 제1 단계에서의 인산칼슘계 생체세라믹은 종래에 조직공학용 지지체를 제조하기 위하여 이용된 어떠한 인산칼슘계 생체세라믹도 이용될 수 있으나, 바람직하게는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite), DCPD(Dicalcium phosphate dihydrate), MCPM(Monocalcium phosphate monohydrate), DCPA(Dicalcium phosphate anhydrous), α-TCP(α-Tricalcium phosphate) 및 β-TCP(β-Tricalcium phosphate)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 인산칼슘계 생체세라믹일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 생체접합용 복합체의 제조 방법에 있어서, 상기 제1 단계 또는 제4 단계에서의 펩타이드-커플링제는 카르보디이미드계(carbodiimide) 계열의 커플링제일 수 있으나, 예컨대, 1,1’-Carbonyldiimidazole (CDI), bis-Trichloromethylcarbonate (BTC), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU), bis-Trichloromethylcarbonate, 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethylaminium hexafluorophosphate (HBTU), 2-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tetramethylaminium hexafluorophosphate (HCTU), N-[(5-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-dimethylamino-morpholino]-uronium hexafluorophosphate N-oxide (HDMC) 일 수 있으며, 바람직하게는 N,N'-dicyclohexyl carbodiimide (DCC), N,N'-diisopropylcarbodiimide(DIC), 및 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩타이드-커플링제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 펩타이드-커플링제에 따른 접합 효율을 확인하기 위하여, 세 가지의 펩타이드-커플링제를 이용하여 링커-생체세라믹 접합체를 활성화시킨 후 리파아제를 링커와 접합시킬 경우, 접합 효율이 상승하는 것을 확인하였으며, 특히 펩타이드-커플링제로서 EDC를 이용할 경우, 다른 펩타이드-커플링제를 이용할 경우보다 현저히 높은 접합 효율을 나타내는 것을 확인하였다(실험예 4 및 도 4 참조). 이러한 결과는, 펩타이드-커플링제에 의한 활성화는 링커와 리파아제의 접합 효율에 영향을 미치는 인자로서, 본 발명에 따른 생체접합용 복합체를 제조하기 위한 필수 구성요소임을 나타내며, EDC는 리파아제를 링커에 접합시키기 위한 펩타이드-커플링제로서 가장 적합함을 시사한다.

본 발명의 체접합용 복합체의 제조 방법에 있어서, 상기 제2 단계의 링커 화합물은 아미노기 및 카르복실레이트기를 포함하는 화합물인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 링커 화합물은 아미노기 및 카르복실산기를 가지고 있는 어떤 화합물도 이용할 수 있으나, 바람직하게는 3-아미노프로파노산(3-aminopropanoic acid), 4-아미노부타노산(4-aminobutanoic acid), 5-아미노펜타노산(5-Aminopentanoic acid), 6-아미노헥사노산(6-aminohexanoic acid), 7-아미노헵타노산(7-Aminoheptanoic acid), 8-아미노옥타노산(8-Aminooctanoic acid) 및 9-아미노노닌산(9-aminononanoic acid)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 6-아미노헥사노산(6-aminohexanoic acid; 6-AmH)인 것을 특징으로 한다. 상기 6-AmH은 아미노 그룹과 카복실 레이트 그룹 사이에 5 개의 탄소를 가지고 있기 때문에 하이드록시아파타이트와 리파아제의 표면 사이의 반발 작용을 줄이는 데 도움을 줄 수 있다. 단, 소수성 단백질이 아닌 경우에는 이러한 링커화합물 없이 펩타이드-커플링제로 단백질과 하이드록시아파타이트를 직접 접합할 수 있다.

본 발명의 생체접합용 복합체의 제조 방법에 있어서, 상기 제5 단계의 소수성 단백질은 리파아제인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 캔디다 루고사 리파아제(CRL), 부르크홀데리아 세파시아 리파아제 (BCL) 및 칸디다 안타르크티카 리파아제 B (CAL-B)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 리파아제인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 한 양태에에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 생촉매 복합체를 포함하는 산업용 생촉매를 제공한다.

본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 생체접합용 복합체를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.

본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 생체접합용 복합체를 포함하는 골 충진용 또는 치공 충진용 의료재료를 제공한다.

본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 생체접합용 복합체를 포함하는 조직재생 유도용 또는 차폐용 막을 제공한다.

본 발명에 따른 생체접합용 복합체는 인체 내 기관이나 조직이 기능을 상실하거나 유실시에 효과적으로 조직을 재생하기 위한 것으로, 생체세라믹, 링커 및 생체 촉메제를 이용하여 생체접합용 복합체를 제조하고, 상기 제조된 생체 접합용 복합체를 조직공학용 지지체, 조직재생 유도용 및 차??용 재료, 생체세포 증식기재 등에 적용할 수 있다.

본 발명의 다른 한 양태에 따르면, 본 발명은 펩타이드-커플링제에 의해 인산칼슘계 생체세라믹; 및 기능성 단백질이 공유 결합된 생체접합용 복합체를 제공한다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 생체접합용 복합체의 제조방법은 펩타이드-커플링제를 이용함으로써 생체세라믹과 링커 또는, 생체세라믹 및 링커 접합체와 생체 촉매의 접합 효율을 향상시키고, 링커를 이용함으로써 극성인 생체세라믹 표면에 소수성의 생촉매를 용이하게 결합시킬 수 있다. 단, 소수성 단백질이 아닌 경우는 링커 도움없이 직접 단백질과 생체세라믹을 직접 결합시킬 수 있다.

또한, 상기 제조 방법으로 제조된 생체접합용 복합체는 소수성 생 촉매가 링커에 의해 생체세라믹 표면에 결합되어 있어 생체에 적합한 조직공학용 지지체, 조직재생 유도용 및 차폐용 재료 및 생체세포 증식기재 등에 적용할 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따른 녹색 형광 단백질-접합-하이드록시아파타이트를 제조하는 단계를 모식화한 도면이다.
도 2는 본 발명의 실험예 2에 따른 결과를 나타내는 도면이다( 펩타이트-커플링제로서 a: DCC, b: DIC, c: EDC를 사용함)
도 3은 본 발명의 실험예 3에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실험예 4에 따른 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실험예 4에서 SEM 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실험예 4에서 PXRD 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 실험예 4에서 IR 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실험예 5에 따른 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 녹색 형광 단백질-접합-하이드록시아파타이트의 제조

펜던트 인산염 그룹을 활성화 시키기 위하여 N,N'-dicyclohexyl carbodiimide (DCC), N,N'-diisopropylcarbodiimide(DIC), 및 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)와 같은 3 가지 펩타이드 커플링 시약을 이용하여, 두 단계를 통한 접한 공정을 진행하였으며, 모식도는 도 1에 나타내었다. 구체적인 실험 방법은 아래와 같다. 먼저, 하이드록시아파타이트(200mg)를 펩타이드 커플링 시약(4 mL of 37.5 mM, DCC and DIC in methylene chloride or EDC in 100 mM MES buffer, pH 5.0)에 침지시키고 25 ℃에서 20분 동안 진탕시켰다. 적절한 용매로 순차적으로 세척 한 후, 활성화된 하이드록시아파타이트를 EGFP 용액(1 mL, pH 7.2 BES 완충액중 1.55 mg/ml)에 현탁시키고 4 ℃에서 16시간 동안 배양 하였다. 그 다음, BES 완충액(5 mM, pH 7.2)으로 3회 세척 한 후, 제조된 EGFP-접합-하이드록시아파타이트를 공기 중에서 건조시켰다.

실험예 1: 하이드록시아파타이트에 접합한 EGFP의 접합량의 측정

하이드록시아파타이트(산화인회석의 6.9-8.6 mg/g)에 결합한 EGFP의 결합량은 접합 전의 접합체와 접합체의 농도를 뺀 값으로 계산 하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. EGFP 용액의 농도는 280 nm에서 ε = 22,015 M-1·cm^-1를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

커플링 시약	EGFP의 결합량(하이드록시아파타이트의 mg/g)
사용하지 않음	4.0 ± 0.05
DCC	6.9 ± 0.1
DIC	8.2 ± 0.03
EDC	8.6 ± 0.03

그 결과, 상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 펩티드 커플링 시약이 동일한 역할을 하지만, 펩타이드 커플링 시약에 따라 접합 수율 (EDC

DIC> DCC)이 변하는 것을 확인하였다.

실험예 2: 하이드록시아파타이트에 접합한 EGFP의 접합 특성 확인

EGFP 접합을 고려할 때, 단백질이 하이드록시아파타이트에 흡착 될 수 있다는 것이 알려져 있기 때문에, EGFP가 공유결합보다 물리적으로 흡착될 가능성이 있으므로, 결합 시약없이 EGFP 용액에 하이드록시아파타이트를 현탁시킨 후, 상층액의 농도를 측정함으로써 EGFP의 물리적으로 흡착 또는 약하게 배위된 양을 확인하고, 형광 현미경으로 EGFP-접합-하이드록시아파타이트 상을 확인하였다. 그 결과를 도 2(a 내지 c)에 나타내었다.

그 결과, 도 2(a 내지 c)에서 확인할 수 있듯이, 약 4 mg의 EGFP가 1 g의 하이드록시아파타이트에 물리적으로 흡착되었음을 확인하였다. 이는 특정양의 EGFP가 하이드록시아파타이트 상에 물리적으로 흡착됨을 나타내었다.

비교예 1: 직접 접합을 통한 하이드록시아파타이트-접합-리파아제의 제조

리파아제로는 Candida rugosa lipase (CRL), Burkholderia cepacia lipase (BCL), Candida antarctica lipase B (CAL-B)를 이용하였다. 먼저, 실시예 1과 같은 방법으로 칸디다 루고사 리파아제 (CRL)를 하이드록시아파타이트에 직접 접합시켰다. CRL은 DCC, DIC 또는 EDC에 의해 활성화된 후에 하이드록시아파타이트에 접합시켰다.

그 결과, 상기 각각의 리파아제는 각각 하이드록시아파타이트에 0.31, 0.26, 0.48mg/g로 접합되었다. 이러한 결과는 EGFP에 비해 적은 양이다. 이러한 결과는 리파아제의 소수성 표면은 하이드록시아파타이트의 표면이 매우 극성이기 때문에 하이드록시아파타이트의 표면과 상호 작용이 어렵기 때문으로 판단된다.

실시예 2: 링커로 결합된 리파아제-접합-하이드록시아파타이트를 이용한 하이드록시아파타이트의 제조

링커 화합물로서 6-아미노헥사노산(6-AmHA)를 선택하였다. 6-아미노헥사노산(6-AmHA)의 아미노기(amino group)는 하이드록시아파타이트 표상의 접합에 사용될 수 있고, 카르복실레이트기(carboxylate group)는 리파아제와 연결 될 수 있다. 게다가, 상기 링커는 아미노 그룹과 카복실레이트 그룹 사이에 5 개의 탄소를 가지고 있기 때문에 하이드록시아파타이트와 리파아제의 표면 사이의 반발 작용을 줄이는 데 도움을 줄 수 있다. 또한, 링커는 펩티드 커플링 시약에 의한 활성화 후에 하이드록시아파타이트와 접합되는데, 커플링 시약으로는 비교적 저렴하고, 부산물(N,N'-디이소프로필 요소)을 유기 용매로 세척하여 편리하게 제거 할 수 있는 DIC를 사용하였다. 구체적인 방법은 아래와 같다.

하이드록시아파타이트(500 mg)을 25 ℃에서 1 시간 동안 DIC(N,N'-diisopropylcarbodiimide; 5 mL의 디클로로 메탄 중 500 ㎕)로 활성화시켰다. 디클로로메탄 (1 mL)으로 3 회 세척 한 후, 활성화된 하이드록시아파타이트를 6-아미노헥산애시드(500 mg)를 포함하는 디클로로메탄(5 mL) 용액에 현탁시켰다. 현탁액을 25℃에서 24시간 동안 배양 하였다. 현탁액을 원심 분리 한 후, 디클로로 메탄, 아세톤 및 물(각각의 용매에 대해 1 mL)을 이용하여 연속적으로 침전물을 세척 하였다. 그 다음, MES 완충액(10 mL, pH 5.0, 100 mM) 중 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; 20 mg)의 용액을 침전물과 혼합 하였다. 혼합물을 25 ℃에서 20 분 동안 반응시키고, 침전물을 BES 완충액(1 mL, pH 7.2, 5 mM)으로 3회 세척 하였다. 침전물을 리파아제인 BCL(Burkholderia cepacia lipase) 또는 CRL(Candida rugosa lipase) 용액(1 mL, BES 완충액 중 1.5 mg/mL)에 재현탁시킨 다음, 혼합물을 24시간 동안 항온 배양 하였다. 리파아제가 접합된 하이드록시아파타이트를 원심 분리에 의해 회수한 다음 실온 상태에서 건조하였다.

실험예 3: 리파아제-접합-하이드록시아파타이트의 접합 확인

상기 실시예 2를 통해 제조된 리파아제-접합-하이드록시아파타이트에서의 링커의 접합은 염화중수소(DCl) 용액 (D₂O에서 20 %)에 의한 분해 단계 후에, NMR 분석에 의해 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있듯이 링커-접합된 하이드록시아파타이트(6-AmHA-HAp)의 분해된 샘플의 NMR 스펙트럼에서 링커 화합물의 특징적인 피크를 확인할 수 있다. 이러한 결과는 링커 화합물이 하이드록시아파타이트 상에 공유 결합되어 있음을 보여준다.

실험예 4: 리파아제-접합-하이드록시아파타이트의 특성 확인

실시예 2의 6-AmHA-HAp를 DCC, DIC 또는 EDC로 활성화시켰다. 그 다음, 리파아제인 CRL를 활성화된 링커와 접합된 하이드록시아파타이트에 접합시켰다. 결합된 CRL의 양은 각각 1.7, 2.5 및 2.8 mg/g로 측정되었다.

그 다음, (±)-1-페닐에틸알코올과 비닐 부티레이트의 에스테르교환 반응에서의 반응 전환율을 비교 하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이 EDC 활성화에 의해 접합된 것이 24 시간 후에 가장 높은 전환율을 보였다(도 4). 따라서, EDC가 BCL과 CAL-B가 링커 부착 하이드록시아파타이트에 결합시키기 가장 적합하다는 것을 알 수 있다.

또한, 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 및 분말 X 선 회절 (PXRD)의 분석을 통해 접합된 하이드록시아파타이트의 상태를 확인하였다. FE-SEM 이미지는 JSM-7500F (Jeol, Japan)에 의해 얻었고, XRD 패턴은 40 kV 및 40 mA에서 작동하는 Cu 타겟 및 X 선관이 있는 Bruker D8 Focus를 사용하여 분석하였다. 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다.

그 결과, 도 5 및 도 6에서 확인할 수 있듯이 상기 접합 과정이 링커 및 리파아제가 결합된 하이드록시아파타이트의 형태 및 결정성을 변화시키지 않음을 알 수 있다.

또한, IR 분석을 통해 링커 및 리파아제가 결합된 하이드록시아파타이트의 피크를 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

그 결과, 도 7에서 확인할 수 있듯이, 적외선 분광학 분석의 모든 특징적인 피크가 보존되어 있는 것을 알 수 있다.

시험예 5: 리파아제가 접합된 하이드록시아파타이트의 비활성 형태와 자유 형태의 비활동성의 비교

비닐 부티레이트와 (±)-1-페닐에틸알콜의 에스테르 교환 반응에 대한 리파아제-접합-수산회인회석(HAp-6-AmHA)의 특이적 활성을 세 가지 리파아제의 유리 형태와 비교 하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

	효소	특이적 활성값(μmol·min1 ^-1 ·mg ^-1 )	광학이성체 비율( E )
1	HAp(hydroxyapatite)	n.d.	n.d.
2	HAp-6-AmHA	n.d.	n.d.
3	Free CAL-B	0.070 ± 0.013	>200
4	HAp-6-AmHA-CAL-B	2.1 ± 0.082	>200
5	Free BCL	0.20 ± 0.0060	>200
6	HAp-6-AmHA-BCL	0.54 ± 0.12	>200
7	Free CRL	0.14 ± 0.0074	>200
8	HAp-6-AmHA-CRL	0.15 ± 0.014	>200

그 결과, 표 2의 항복 1 및 2에서 확인할 수 있듯이, 비개질된 하이드록시아파타이트 또는 단독으로 링커가 부착된 하이드록시아파타이트는 어떠한 촉매 활성도 나타내지 않았다. 대조적으로, 하이드록시아파타이트에 접합된 3 개의 리파아제는 자유형 효소보다 30 배까지 높은 활성을 나타내었다. 고정화는 효소 분자를 서로 분리 할 수 있기 때문에 효소의 활성 부위는 기질에 보다 많이 노출되며 효소의 자유 형태에 비해 활성이 증가한다. 이러한 결과는, 본 발명의 접합 과정이 리파아제를 불활성화시키지 않으며, 리파아제의 구조적 특징을 변화시키지 않는다는 것을 의미한다.

실험예 6: 하이드록시아파타이트에 접합된 리파아제의 재활용 실험

생촉매 고정화에서 중요한 이점 중 하나는 고정화된 생촉매가 경제적 비용을 줄이기 위해 재활용 될 수 있다는 것이다. 따라서, 세 가지 리파아제가 결합된 하이드록시아파타이트의 재활용 실험을 진행하였다.

구체적으로, 리파아제-접합-하이드록시아파타이트(CRL 및 BCL)의 경우 50 mg, CAL-B의 경우 5 mg)이 함유된 디이소프로필에테르(1 mL)에 (±)-1-페닐에탄올(0.05 mmol)과 비닐 부티레이트 (0.15 mmol)를 첨가하여 반응시켰다. 반응은 25℃에서 24시간 동안 항온 배양 하였다. 첫 번째 반응이 끝난 후 리파아제-접합-하이드록시아파타이트를 디이소프로필에테르(1 mL)로 3회 세척 하였다. 그 다음, 세척된 리파아제-접합-하이드록시아파타이트를 디이소프로필에테르(1 mL) 중의 (±)-1-페닐 에탄올 (0.05 mmol) 및 비닐 부티레이트 (0.15 mmol)의 용액에 첨가 하였다. 이 단계를 9 번 반복했다. 각 단계에서의 전환은 GC로 분석하였다. 가스 크로마토그래피는 키랄캐필러리 컬럼(Cyclosil-B 30 m x 0.25 mm, Agilent Technologies, Seoul, Korea)을 사용하여 Agilent 6890N으로 분석하였다. 반응 전환율을 24 시간 동안 비교하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

그 결과, 도 8에서 확인할 수 있듯이, CRL-접합-하이드록시아파타이트의 경우, 각 사이클에서 전환율이 다소 변화되었지만, 10 번 리싸이클링 후 여전히 85 % 이상의 활성이 유지되었다. 한편, BCL- 및 CAL-B 접합-하이드록시아파타이트의 활성은 10번의 재활용 후에도 유지되었다. 이러한 결과는, 수산회인석회는 생촉매고정화에서 지지체 물질로서 효과적으로 사용될 수 있음을 시사한다.

Claims

하기 세 가지 성분이 공유 결합되어 있는 생체접합용 복합체:
(i) 인산칼슘계 생체세라믹;
(ii) 아미노기 및 카르복실레이트기를 포함하는 링커 화합물; 및
(iii) 소수성 단백질.
제1항에 있어서,
상기 인산칼슘계 생체세라믹은 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite), DCPD(Dicalcium phosphate dihydrate), MCPM(Monocalcium phosphate monohydrate), DCPA(Dicalcium phosphate anhydrous), α-TCP(α-Tricalcium phosphate) 및 β-TCP(β-Tricalcium phosphate)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 인산칼슘계 생체세라믹인 것을 특징으로 하는 생체접합용 복합체.
제1항에 있어서,
상기 링커 화합물의 아미노기는 인산칼슘계 생체세라믹과 공유 결합하고, 링커 화합물의 카르복실레이트기는 소수성 단백질과 공유 결합하는 것을 특징으로 하는 생체접합용 복합체.
제1항에 있어서,
상기 소수성 단백질은 리파아제인 것을 특징으로 하는 생체접합용 복합체.
제4항에 있어서,
상기 리파아제는 캔디다 루고사 리파아제(CRL), 부르크홀데리아 세파시아 리파아제 (BCL) 및 칸디다 안타르크티카 리파아제 B (CAL-B)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 리파아제인 것을 특징으로 하는 생체접합용 복합체.
인산칼슘계 세라믹을 펩타이드-커플링제에 혼합하여 활성화시키는 제1 단계;
링커 화합물 용액에 제1 단계에서 활성화된 인산칼슘계 세라믹을 현탁시키는 제2 단계;
제2 단계의 현탁액을 원심분리하여 침전물을 수득한 후, 침전물을 세척하는 제3 단계;
상기 제3 단계의 침전물을 펩타이드-커플링제와 혼합하여 배양하는 제4 단계;
상기 제4 단계의 침전물을 소수성 단백질이 포함된 용액에 재현탁시킨 다음 배양하는 제5 단계; 및
제5 단계의 용액을 원심분리하여 소수성 단백질이 결합된 복합체를 수득하는 단계;를 포함하는 생체접합용 복합체의 제조 방법.
제6항에 있어서,
상기 제1 단계에서의 인산칼슘계 생체세라믹은 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite), DCPD(Dicalcium phosphate dihydrate), MCPM(Monocalcium phosphate monohydrate), DCPA(Dicalcium phosphate anhydrous), α-TCP(α-Tricalcium phosphate) 및 β-TCP(β-Tricalcium phosphate)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 인산칼슘계 생체세라믹인 것을 특징으로 하는 생체접합용 복합체의 제조 방법.
제6항에 있어서,
상기 제1 단계 또는 제4 단계에서의 펩타이드-커플링제는 N,N'-dicyclohexyl carbodiimide (DCC), N,N'-diisopropylcarbodiimide(DIC), 및 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 펩타이드-커플링제인 것을 특징으로 하는 생체접합용 복합체.
제6항에 있어서,
상기 제2 단계의 링커 화합물은 아미노기 및 카르복실레이트기를 포함하는 화합물인 것을 특징으로 하는 생체접합용 복합체.
제6항에 있어서,
상기 제5 단계의 소수성 단백질은 리파아제인 것을 특징으로 하는 생체접합용 복합체.
제1항의 생체접합용 복합체 또는 제6항의 제조방법으로 제조된 생체접합용 복합체를 포함하는 조직공학용 지지체.
제1항의 생체접합용 복합체 또는 제6항의 제조방법으로 제조된 생체접합용 복합체를 포함하는 골 충진용 또는 치공 충진용 의료재료.
제1항의 생체접합용 복합체 또는 제6항의 제조방법으로 제조된 생체접합용 복합체를 포함하는 조직재생 유도용 또는 차폐용 막.
펩타이드-커플링제에 의해 하기 두 가지 성분이 공유 결합된 생체접합용 복합체:
(i) 인산칼슘계 생체세라믹; 및
(ii) 기능성 단백질.