CN105255853A - 一种磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法及在食用油脂加工中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法，首先制备磁性羟基磷灰石载体，为了使脂肪酶能够以化学键的形式固定在载体上，须对制备的磁性羟基磷灰石进行氨基功能化修饰，最后再使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。本发明的优点在于采用羟基磷灰石包覆磁性纳米粒子，由于羟基磷灰石具有大量孔道，孔道内壁上有大量羟基，这种构造便于载体的进一步修饰以及活性物质的固载，从而大幅度提高了磁性粒子的比表面积，增加了脂肪酶的负载量，更好的体现了固定化脂肪酶的催化作用。同时，本发明利用羟基磷灰石所具有良好的生物相容性，更好的发挥了固定化脂肪酶的催化活性。

Description

一种磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法及在食用油脂加工中的应用

技术领域

本发明涉及一种脂肪酶催化剂，尤其是涉及一种磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法，本发明还涉及所制备的固定化脂肪酶在食用油脂加工中的应用。

背景技术

脂肪酶作为催化剂，因具有高效性、专一性、反应条件温和、环境友好等特点而被广泛应用于医药、食品、香料、油脂、化妆品和农药等行业。然而，游离脂肪酶操作稳定性差、易失活、不易重复使用、难以实现生产过程连续化和自动化，而且反应后混入产品中,难以分离。所以，虽然游离脂肪酶催化技术比较成熟,但真正的产业化应用还是受到了很大的限制。

为了克服游离脂肪酶的缺陷，近十几年来有不少关于生物酶改良方法的报道，其中“酶的固定化”受到越来越多的关注。将游离酶以各种方法固定在适合的载体上，提高了酶的稳定性，简化了催化剂分离工艺，可以制备出能适应更多反应体系更广反应条件的非均相生物催化剂。同时，这也为脂肪酶酶类催化剂的重复利用提供了可能，进一步满足了工业生产的需要。载体的选择是固定化酶制备过程中的关键，目前用于负载脂肪酶的载体有很多种，包含有无机化合物和有机聚合物等。卢英华等在无水乙醇、去离子水和氨水的碱性体系中以TEOS为硅源、CTAB溶液为模板剂制备出介孔SiO₂载体HMSS，HMSS经过修饰后，用于脂肪酶的交联负载，制得的成品固定化酶活性较好，且耐热、耐酸碱能力均远强于游离酶（卢英华，何彩云，姚传义，林旺锦.固定化脂肪酶的制备方法[P].中国专利：CN104593278A,2015-05-06）。程海明等以皮胶原为基材,与交联剂依次在酸性条件和中偏碱性条件下进行交联后,用中性缓冲溶液冲洗除去未反应的交联剂,所得载体的游离醛基含量为0.5-5.0mmol/g，比表面积为2.0-20m²/g。然后，将脂肪酶与上述修饰载体交联后制得皮胶原固定化酶，该固定化酶活性在放置1个月后仅损失5%，稳定性良好（程海明，宋德伟，陈敏，李志强.脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法[P].中国专利：CN104293763A,2015-01-21）。然而，当此类固定化酶应用于高粘度物料体系时，在反应结束催化剂分离的过程中，过滤速率十分缓慢，在一定程度上制约了生产效率的提高。

近年来，磁性纳米粒子在各种固载化催化剂的制备中受到重视，以磁性材料为载体制备的固体催化剂在完成催化反应后均可在外界磁场的参与下快速分离和回收，从而简化了催化剂分离工艺，大幅度提高了工业化生产效率。此外，利用外部磁场可以控制磁性固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高了固定化酶的催化效率。刘薇等用共沉淀法制备了Fe₃O₄粒子，再经月桂酸处理后，获得平均粒径20nm、具有超顺磁性的疏水磁性载体，将此磁性载体用于脂肪酶固定化时，固定化脂肪酶成品的稳定性显著提高，且固定化脂肪酶回收便捷(刘薇,白姝,孙彦.磁性纳米粒子的制备及脂肪酶的固定化[J].过程工程学报,2004,04期:362-366)。Reetz等以一系列疏水单体为原料，采用溶胶-凝胶工艺，制备了氧化铁多孔磁性凝胶固定化酶，酶的固定化率较高(88%)。与自由脂肪酶相比，在异辛烷中其催化月桂酸与正辛醇酯化反应的活性增加了1-2倍（ReetzMT,ZontaA,VijayakrishnanV,etal.Entrapmentoflipasesinhydrophobicmagnetite-containingsol-gelmaterials:magneticseparationofheterogeneousbiocatalysts1[J].JournalofMolecularCatalysisAChemical,1998,134:251–258）。然而，磁性粒子比表面积较小，可负载的脂肪酶数量有限。此外，由于彼此之间的磁吸引力，磁性粒子在参与反应时容易产生磁凝聚效应，使其比表面积大幅度下降，降低了物料与酶活性中心接触的概率，从而制约了酶催化活性的表现。

磁性粒子的包覆技术是一种新兴的载体处理手段，将一些化学惰性较好的材料附着在磁性粒子表面可以阻碍其发生磁凝聚，这种核-壳型磁性载体很好的克服了“磁性粒子分散性较差”的问题。安红等使用凝胶包覆法制备的磁性核壳结构Fe₃O₄MCM-41载体，饱和磁强度达46.65emu/g，很好的保持了磁性纳米粒子的磁分离优势。通过化学吸附的方法可以将约14%的胰蛋白酶固定在Fe₃O₄MCM-41上，与游离酶相比，固定化胰蛋白酶的热稳定性、pH值适应性明显改善，且分散性良好（安红,宋伟明,高树刚.胰蛋白酶在磁性核壳介孔分子筛上的固定化研究[J].食品科学,2012,23期:266-269）。此类核-壳型磁性载体通常以致密的二氧化硅作为包覆层，与磁性纳米粒子相比，其比表面积有一定增加，但脂肪酶的负载量依然较少。此外，脂肪酶作为一种生物物质对此类载体的适应性有限，故催化活性较低。

随着近年来食品工业的快速发展，功能性油脂和特殊使用性能的油脂制品需求量越来越大（如人造奶油、起酥油、煎炸油和结构脂等）。油脂酯酯交换和油脂氢化是食用油脂加工的重要化学反应。然而，由于氢化油脂中的反式脂肪酸会显著增加食用者罹患心脑血管疾病的风险，它的使用逐渐受到了限制。油脂酯-酯交换不产生反式脂肪酸，不丧失必需脂肪酸，而且能改善油脂的食用性能，生产出的油脂制品具有起酥性、可塑性、延展性和风味好的特点。此外，通过油脂酯-酯交换，结合新脂肪酸，改变脂肪酸的位置分布，从而赋予其熔化、消化、吸收和代谢功能，增加了其在食品营养和治疗方面的功能。油脂酯-酯交换反应中的催化剂发挥着重要作用，所以研究开发新型油脂酯酯交换固定化酶催化剂，对于食用油脂加工具有重要作用。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术所存在的缺陷，提供一种比表面积大，与产物分离速度快、催化活性高的磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法，本发明还提供所制备的固定化脂肪酶在食用油脂加工中的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法包括下述步骤：

第一步，磁性羟基磷灰石的制备

将一定量的FeCl₃·6H₂O和Fe₂SO₄·7H₂O放入烧杯中，加入脱氧水，机械搅拌使FeCl₃·6H₂O与Fe₂SO₄·7H₂O完全溶解；然后缓慢滴加25%的NH₃·H₂O溶液于混合溶液中，25℃恒温搅拌均匀；然后分别缓慢滴加Ca(NO₃)₂·4H₂0溶液和(NH₄)₂HPO₄溶液于上述反应体系中，继续搅拌均匀后升温至90℃，待其充分反应后将所得产物冷却至室温，陈化过夜，对产物进行磁分离并用去离子水洗至中性，干燥后在200℃条件下煅烧3h，得到磁性羟基磷灰石载体；

第二步，载体的功能化修饰

将第一步制备的磁性羟基磷灰石载体放入干燥的圆底烧瓶中与甲苯溶液混合均匀，然后缓慢滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷于该反应体系中，在甲苯的回流温度下充分反应；反应结束后用磁铁对产品进行分离，分离出的产品用甲苯洗涤后真空干燥，得到氨基修饰的磁性羟基磷灰石载体；

第三步，脂肪酶的固定化

取氨基修饰后的磁性羟基磷灰石载体放入干燥的圆底烧瓶中，加入10%的戊二醛溶液，25~45℃条件下在恒温振荡器中振荡反应；反应完成后加入0.025~0.125mol/L的酶溶液，继续振荡反应6~14小时；待反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用pH6.0~8.0的磷酸缓冲溶液洗涤，冷冻干燥后得到磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶成品。

所述第三步中加入的酶溶液是在pH值6.0~8.0、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.025~0.125g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成。

所述第三步脂肪酶固定化时的最佳条件为：磷酸缓冲溶液pH为7.0，添加AY脂肪酶的比例为0.10g/mL，振荡反应温度为30℃，振荡反应时间10h。

本发明制备的磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶在食用油脂加工中作为酯酯交换催化剂应用。

羟基磷灰石是人体骨骼组织的主要无机组成成分，由于其具有较大的比表面积、较好的化学惰性、无毒副作用等突出优点而受到较多关注，常常被作为药物载体广泛的应用于生物医学领域。

本发明的优点在于采用羟基磷灰石包覆磁性纳米粒子，由于羟基磷灰石具有大量孔道，孔道内壁上有大量羟基，这种构造便于载体的进一步修饰以及活性物质的固载，从而大幅度提高了磁性粒子的比表面积，增加了脂肪酶的负载量，更好的体现了固定化脂肪酶的催化作用。同时，本发明利用羟基磷灰石所具有良好的生物相容性，更好的发挥了固定化脂肪酶的催化活性。

本发明的优点具体体现在：

1、磁性载体采用羟基磷灰石作为包覆层，增加了固载酶的生物相容性，提高了脂肪酶对载体的适应性。

2、制备过程中，在对磁性载体进行修饰和对脂肪酶进行固载时，保留了大量介孔孔道结构和较高的比表面积，提高了催化活性位点的分散度，从而增加了催化效率。

3、通过键合交联法将脂肪酶束缚在孔道结构中，有效地防止了活性组分流失，提高了催化剂的稳定性。

4、在催化反应中，可使用变换外界磁场的方法来增加催化剂与物料的接触传质速率与均匀度。

5、对反应容器无腐蚀性，对环境无污染。

6、该催化剂可采用外界磁场干预的方法从反应产物中快速的分离，比均相反应工艺有较大优势，提高了生产效率。与非磁性固定化酶相比，该固定化酶更容易分离，在某些环境（如高粘度底物体系）中其优势更大。

附图说明

图1是本发明磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备流程图。

图2是本发明中磁性羟基磷灰石（HAP-γ-Fe₂O₃）的透射电镜图。

图3是本发明磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶成品的透射电镜图。

图4是本发明中磁性羟基磷灰石（HAP-γ-Fe₂O₃）的氮气吸附和脱附曲线。

图5是本发明磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶成品的氮气吸附和脱附曲线。

图6是本发明中磁性羟基磷灰石（HAP-γ-Fe₂O₃）和磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶成品的磁性能曲线。

图7是本发明中磁性羟基磷灰石（HAP-γ-Fe₂O₃）和磁性羟基磷灰石固定化

脂肪酶成品的红外吸收光谱图。

具体实施方式

本发明所述的磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法如图1所示，包括下述步骤：

第一步，磁性羟基磷灰石的制备

将一定量的FeCl₃·6H₂O和Fe₂SO₄·7H₂O放入烧杯中，加入脱氧水，机械搅拌使FeCl₃·6H₂O与Fe₂SO₄·7H₂O完全溶解；然后缓慢滴加25%的NH₃·H₂O溶液于混合溶液中，25℃恒温搅拌30min；然后分别缓慢滴加Ca(NO₃)₂·4H₂0溶液和(NH₄)₂HPO₄溶液于上述反应体系中，继续搅拌30min后升温至90℃，待其充分反应后将所得产物冷却至室温，陈化过夜，对产物进行磁分离并用去离子水洗至中性，干燥后在200℃条件下煅烧3h，得到磁性羟基磷灰石载体（HAP-γ-Fe₂O₃）；

第二步，载体的功能化修饰

为了使脂肪酶能够以化学键的形式固定在载体上，须对第一步制备的磁性羟基磷灰石进行氨基功能化修饰，具体方法为：将第一步制备的磁性羟基磷灰石载体（HAP-γ-Fe₂O₃）放入干燥的圆底烧瓶中与甲苯溶液混合均匀，缓慢滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷于该反应体系中，在甲苯的回流温度下充分反应2小时；反应结束后用磁铁对产品进行分离，分离出的产品用甲苯洗涤后于60℃条件下真空干燥，得到氨基修饰的磁性羟基磷灰石载体（NH₂--HAP-γ-Fe₂O₃）；

第三步，脂肪酶的固定化

使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取氨基修饰后的磁性羟基磷灰石载体（NH₂--HAP-γ-Fe₂O₃）放入干燥的圆底烧瓶中，加入10%的戊二醛溶液，25~45℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h后，加入0.025~0.125mol/L的酶溶液（所用酶溶液是在pH值6.0~8.0、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.025~0.125g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应6~14小时；待反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，再用pH6.0~8.0的磷酸缓冲溶液洗涤，冷冻干燥后得到磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶成品（简称磁性固定化酶），2~4℃条件下保存备用。

在磁性载体HAP-γ-Fe₂O₃与磁性固定化酶制备完成后，对其进行表征和确认：

从HAP-γ-Fe₂O₃的透射电镜图（如图2所示）中可以看出，该磁性载体呈现为核-壳型结构，外形呈均匀棒状，浅色材料HAP中包裹有深色γ-Fe₂O₃磁核，粒径尺寸较为统一，有利于粒子在反应体系中的分散。磁性固定化酶成品的透射电镜图（如图3所示）显示其结构与磁性载体HAP-γ-Fe₂O₃相比没有明显变化，说明脂肪酶的固定化并没有导致磁性粒子的团聚或载体材料结构的改变。

HAP-γ-Fe₂O₃与磁性固定化酶成品的N₂吸附-脱附等温线（如图4与图5所示）基本属于LangmuirⅣ型，由此说明样品材料为介孔材料。在相对压力为0.2-0.65的范围内，氮气吸附量吸附量增加平缓，此时N₂分子在孔道内表面以单层到多层吸附，在相对压力为0.75-0.9的范围内吸附量突增，形成滞后环，为毛细凝聚现象所致，此现象发生在中高压段，说明材料的孔径较大。通过N₂吸附-脱附等温曲线可计算出相应材料的比表面积和孔径分布。HAP-γ-Fe₂O₃的比表面积为81m ² /g，孔径为23.5nm，孔径分布均匀，载体具有较大的比表面积，有利于负载活性脂肪酶组分。固定酶之后样品的比表面积下降为22m ² /g，孔径也同样下降至17.4nm。这种现象说明脂肪酶成功地固载到了磁性羟基磷灰石载体材料（HAP-γ-Fe₂O₃）上，同时仍保持较大比表面积，有利于化学反应进行。

该固定化酶的磁性能使其更容易从反应体系中得到分离，在外加磁场条件下催化剂可有效的得以分离，能够提高其使用效率，简化生产工艺，避免更多能源的浪费。在室温条件下使用MicroSense-EV9振动样品磁强计对HAP-γ-Fe₂O₃和磁性固定化酶的磁性能进行了测定，测定结果如图6所示。

由图6可得出，HAP-γ-Fe₂O₃(曲线a)的饱和磁化强度为22.1eum/g，磁性固定化酶(曲线b)的饱和磁化强度为14.5eum/g。由于脂肪酶无磁性，磁性固定化酶的饱和磁化强度与HAP-γ-Fe₂O₃相比减小，但是二者都能通过外加磁场快速有效地从反应体系中分离出来。此外，二者的磁化曲线均呈现零剩磁和矫顽力，表明磁性粒子为超顺磁性。该固定化酶的磁性能使得它很容易受到外加磁场影响，从而使固定化脂肪酶（固相）和反应底物（液相）更容易分离。

图7为HAP-γ-Fe₂O₃（曲线a）和固定化脂肪酶（曲线b）的红外吸收光谱图。在HAP-γ-Fe₂O₃的红外吸收光谱图中，3420cm^-1的宽吸收峰为HAP-γ-Fe₂O₃表面羟基的伸缩振动吸收峰，1042cm^-1和865cm^-1处的强吸收峰归因于PO₄ ^3-的特征吸收，而571cm^-1处的强吸收峰则对应于Fe₂O₃的Fe-O伸缩振动。该磁性固定化脂肪酶在2939cm^-1和2860cm^-1的两处吸收峰为饱和烷基的特征吸收峰，而在1665cm^-1处的吸收峰可合理归属为C=N双键的伸缩振动。另外，固定酶的红外谱图中1042cm^-1、865cm^-1和571cm^-1处出现了PO₄ ^3-和Fe-O的特征吸收峰，而在1710cm^-1和1461cm^-1有两个酰胺的特征吸收峰，表明游离脂肪酶成功通过戊二醛键合交联固载至HAP-γ-Fe₂O₃载体上。

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。

实施例1

（1）HAP-γ-Fe₂O₃载体的制备

称取3.0gFeCl₃·6H₂O和1.54gFe₂SO₄·7H₂O于500mL烧杯中，加入90mL脱氧水，机械搅拌使FeCl₃·6H₂O与Fe₂SO₄·7H₂O完全溶解，再缓慢滴加30mL25%的NH₃·H₂O于混合溶液中，25℃温度下恒温继续搅拌30min，将7.1gCa(NO₃)₂·4H₂O和2.3g(NH₄)₂HPO₄分别溶于67mL蒸馏水，再将这两种溶液缓慢加入至反应体系中，继续搅拌30min后升温至90℃，反应2h。反应结束后将产品冷却至室温，陈化过夜，对产物进行磁分离并用去离子水洗至中性，干燥后在200℃条件下煅烧3h得到HAP-γ-Fe₂O₃载体。

（2）载体的氨基功能化修饰

称取1.0gHAP-γ-Fe₂O₃载体于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入20mL甲苯，混合均匀后缓慢滴加0.44g3-氨丙基三乙氧基硅烷于反应体系中，在甲苯的回流温度下反应2h。反应结束后用磁铁对产品进行分离，并用甲苯和乙醇分别洗涤数次后于60℃条件下真空干燥。

（3）脂肪酶的固定化

使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，35℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.075g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应6h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂1#。

实施例2

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，35℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.075g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应8h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂2#。

实施例3

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，35℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.075g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应12h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂3#。

实施例4

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，35℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.075g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应14h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂4#。

实施例5

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，35℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.025g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应10h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂5#。

实施例6

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，35℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.05g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应10h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂6#。

实施例7

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，35℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.1g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应10h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂7#。

实施例8

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，35℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.125g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应10h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂8#。

实施例9

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，25℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.1g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应10h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂9#。

实施例10

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，30℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.1g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应10h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂10#。

实施例11

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，40℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.1g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应10h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂11#。

实施例12

HAP-γ-Fe₂O₃的制备和载体的氨基功能化修饰方法同实施例1。

脂肪酶的固定化：同样使用戊二醛作为交联剂对脂肪酶进行固定化。取0.5g氨基修饰后的HAP-γ-Fe₂O₃于100mL干燥的圆底烧瓶中，加入10mL10%的戊二醛溶液，45℃条件下在恒温振荡器中振荡0.5h，然后加入10mL的脂肪酶溶液（在pH值7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.1g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成），继续振荡反应10h。反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用0.2mol/L的磷酸缓冲溶液（pH=7.0）洗涤，冷冻干燥后得到磁性固定化酶成品--催化剂12#。

本发明制得的催化剂的活性测试—大豆油与脂肪酸甲酯的酯酯交换反应

实施例13

将2.0g大豆油、1.4g硬脂酸甲酯加入50mL圆底烧瓶中，在60℃条件下搅拌30min使混合油样完全熔化并均匀混合，待温度降至室温时，平行加入上述不同制备条件得到的固定化脂肪酶各0.85g，45℃条件下在恒温振荡器中反应72h，反应结束后通过外加磁场将磁性固定化酶分离。然后，使用薄层色谱法对酯交换产品中的甘油三酯与脂肪酸甲酯进行分离，将脂肪酸甲酯对应的谱带转移至试管中并用正己烷进行萃取，然后进行气相色谱分析(GRUCZYNSKAE.,KOWALSKAD.,KOWALSKIB.,etal.EnzymaticInteresterificationofaLardandRapeseedOilEqual-WeightBlend[J].JournalofOleoScience,2013,4(62):187-193)。

表1为各种固定化酶的制备条件及其应用于大豆油和硬脂酸甲酯的酯酯交

换反应中硬脂酸酯的交换率。

表1

本发明在脂肪酶量与载体比例、温度一定的条件下，考察了不同固定时间（6、8、10、12和14h）对脂肪酶固定化的影响，结果如表1所示。由表1可看出，随着固定时间的增长，固定酶的催化活性不断上升，当固定时间为10h时催化剂活性达到最高，之后随着固定时间继续增长，脂肪酶的活力逐渐下降，产生这种现象的原因可能是在固定的初始阶段，脂肪酶的固载率随着固定时间的延长不断增高从而使催化剂活性不断上升，当固载率达到饱和之后继续增加反应时间，使载体网络表面的酶分子之间较为拥挤，空间位阻增大，底物不易与酶充分接触，故使固定酶整体的活力有所下降。适宜的固定化时间为10h。

在最优固定时间以及特定温度条件下，考察了不同酶溶液浓度（0.025、0.05、0.075、0.10、0.125g/mL）对固定酶活性的影响，结果如表1所示。固定化酶的活性随着脂肪酶溶液浓度的增大，首先逐渐提高而后基本保持不变。当脂肪酶溶液浓度大于0.10g/mL时，固定化酶的活性趋于稳定，再继续增大酶溶液浓度，固定化酶的活性基本保持不变。因此，0.10g/mL为最佳酶溶液浓度。

在最优固定时间以及脂肪酶浓度条件下，考察不同固定化温度（25、30、35、40、45℃）对固定化酶催化活性的影响，结果如表1所示。从表1可以看出，在适宜的pH、固定化时间以及合适的酶溶液浓度条件下，温度为30℃时固定酶催化反应的活性最高，随着温度的继续升高，其催化活性逐渐下降。因此30℃为酶的最适宜固定温度。

综上所述，10#固定化酶的活性最高，本发明磁性固定化酶制备的最优条件为：酶溶液浓度为0.10g/mL，固载温度为30℃，固载时间为10h。

本发明制得的催化剂的重复利用性能的测试

实施例14

将4.0g大豆油、2.8g硬脂酸甲酯加入50mL圆底烧瓶中，在60℃条件下搅拌30min使混合油样完全熔化并均匀混合，待温度降至室温时，加入10#固定化酶1.7g（大豆油和硬脂酸甲酯质量之和的25%），45℃条件下在恒温振荡器中反应72h，反应结束后通过外加磁场将磁性固定化酶分离。固定化酶经过滤分离后，再用磷酸缓冲溶液(0.2mol/mL,pH=7.0)和正丁醇各洗涤3次。洗涤后的固定化酶经冷冻干燥10h后，投入下次酯酯交换反应（反应条件与首次使用时相同）。如此重复利用4次（当固定化酶量不足时，用平行实验回收固定化酶补充），产物后处理方法和分析方法同实施例13。

本发明制得的固定化酶重复利用性能测试结果见表2。

表2

从表2可看出，本发明中固定化酶在大豆油与硬脂酸甲酯的酯酯交换反应中经4次重复利用后活性仍保持在80%以上，说明该催化剂的稳定性较高，可以在间歇反应装置中连续使用。

本发明制得的催化剂催化大豆油与棕榈硬脂的酯酯交换反应

将棕榈硬脂（PS）与大豆油（SO）分别以30:70、40:60的质量比例混合，加入50mL圆底烧瓶中，60℃条件下搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。取出一半反应前混合油样作为对照物进行组成测定，剩余混合油样中加入一定量的固定酶催化剂，在45℃条件下，放入摇床中振荡反应一定时间。反应结束后通过外加磁场分离催化剂，产品在2℃-4℃条件下存放12h，然后进行熔点测定（GB/T12766-2008动物油脂熔点测定[S]）、碘值测定(AOCS,2009)、总脂肪酸组成分析（GRUCZYNSKAE.,KOWALSKAD.,KOWALSKIB.,etal.EnzymaticInteresterificationofaLardandRapeseedOilEqual-WeightBlend[J].JournalofOleoScience,2013,4(62):187-193）、Sn-2位脂肪酸组成分析（SOCIETYA.O.C.,FIRESTONED.OfficialmethodsandrecommendedpracticesoftheAmericanOilChemists'Society[M].AOCSChampaign,IL,,US,1989.）和油脂甘三酯的组成分析（安广杰,侯冰冰,王瑛瑶,etal.超高效液相色谱法测定油脂中甘三酯组成[J].中国油脂,2011,36(5):55-58.）。

实施例15

将1.2g棕榈硬脂与2.8g大豆油（质量比为30:70）加入50mL圆底烧瓶中，在60℃下搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。然后，取出2.0g混合油样作为对照物进行组成测定。剩余混合油样中加入10#固定酶催化剂0.5g，在45℃条件下，放入摇床中振荡反应72h。反应结束后通过外加磁场分离催化剂，产品在2℃-4℃条件下存放12h，然后进行熔点测定。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的49.5℃下降为反应后的35.1℃。其它油脂结构分析也证明两种油脂之间发生了酯酯交换反应（见表3，表4和表5）

实施例16

将1.6g棕榈硬脂与2.4g大豆油（质量比为40:60）加入50mL圆底烧瓶中，在60℃下搅拌30min使混合油样完全熔化并混合均匀。然后，取出2.0g混合油样作为对照物进行组成测定。剩余混合油样中加入10#固定酶催化剂0.5g，在45℃条件下，放入摇床中振荡反应72h。反应结束后通过外加磁场分离催化剂，产品在2℃-4℃条件下存放12h，然后进行熔点测定。实验结果显示，混合油脂熔点由反应前的51.2℃下降为反应后的38.0℃。其它油脂结构分析也证明两种油脂之间发生了酯酯交换反应（见表3，表4和表5）

熔点是油脂的一项重要物理特性，对油脂的口感有很大影响，接近人体体温且熔程较短的半固体油脂具有更好的口感。未经酯酯交换的两种固液物理混合油脂存放后会出现分层，而且口感较差。棕榈硬脂的熔点为57.5℃。不同质量比的棕榈硬脂与大豆油混合油脂酯-酯交换反应前后熔点均有明显变化，其中，实施例15中混合油脂熔点由反应前的49.5℃下降为反应后的35.1℃，而实施例16中混合油脂熔点由反应前的51.2℃下降为反应后的38.0℃。酯交换产品的熔点下降说明固定化酶催化油脂酯-酯交换反应改变了混合油脂的甘三酯组成。由混合油脂中甘三酯的变化情况可知,反应后三棕榈酸甘油酯（PPP）的含量明显下降，因此产品的熔点也较反应前明显降低。

表3是棕榈硬脂、大豆油以及二者不同质量比例混合油脂酯-酯交换反应前后混合油样中的总脂肪酸组成以及碘值(IV)的测定结果。其中大豆油的碘值为131.5，棕榈硬脂的碘值为19.3。不同质量比的棕榈硬脂和大豆油酯-酯交换反应前后，其总脂肪酸的组成及含量没有明显变化，说明固定脂肪酶催化油脂酯-酯交换反应仅仅改变了油脂甘三酯分子中脂肪酸的排布，而对油脂甘三酯分子中脂肪酸的种类和饱和程度并不产生影响，而且避免了产生异构化的脂肪酸。

表3

由表3可知，大豆油中富含人体必需脂肪酸，其中亚油酸和亚麻酸的含量分别为53.6%和7.2%，另外含有23.3%油酸、11.1%的棕榈酸和4.8%的硬脂酸。大豆油中饱和脂肪酸含量为15.9%，而不饱和脂肪酸占了较大的比重，约为84.1%。棕榈硬脂中主要脂肪酸为棕榈酸，含量为83.9%，同时含有8.9%的油酸、4.4%的硬脂酸、1.4%的亚油酸和1.4%的亚麻酸。鉴于两种油脂脂肪酸组成的巨大差异，可以通过调整棕榈硬脂和大豆油的质量比例获得不同脂肪酸组成的混合油脂。随着棕榈硬脂含量的不断增大，混合油脂中饱和脂肪酸（SFA）的百分含量不断增大，不饱和脂肪酸（USFA）的相对百分含量则相应的呈现逐渐降低的趋势。

不同质量比的棕榈硬脂和大豆油酯-酯交换反应前后油脂样品的Sn-2位脂肪酸组成测定结果见表4。由表4可知，棕榈硬脂Sn-2位上棕榈酸的含量最高，为84.2%，另外含有9.3%油酸、4.2%硬脂酸和2.2%亚油酸。大豆油Sn-2位上含量最高的是亚油酸（69.2%），油酸（22.7%）次之，亚麻酸（6.4%）、棕榈酸（1.3%）和硬脂酸（0.4%）含量相对较少。

表4

酯-酯交换反应通常被用来制备结构化油脂，通过使甘油骨架上的各种脂肪酸进行重新排列，使其功能性得到显著改善。从表4可以看出，与酯酯交换反应前相比较，酯酯交换反应后油脂样品Sn-2位的脂肪酸组成发生了明显变化。这是因为通过酯-酯交换反应，脂肪酸在甘油骨架上进行了重新的排列。此外，油脂酯-酯交换反应产品在进行气相色谱分析的过程中，没有检测到反式脂肪酸。

对比同比例油脂样品酯-酯交换反应前后Sn-2位上的脂肪酸组成发现，反应后油脂Sn-2位上棕榈酸的含量明显提高，而不饱和亚油酸含量则有较大下降。以棕榈硬脂与大豆油40:60的比例为例，棕榈酸的相对含量由反应前的29.2%增长至反应后的50.8%，而亚油酸则由初始的44.4%降低为酯-酯交换反应后的25.4%。

不同质量比的棕榈硬脂和大豆油酯-酯交换反应前后样品的甘三酯组成见表5。其中，棕榈硬脂中主要的甘三酯组成为：PPP（88.5%）、OPP（5.8%）、POO（1.2%）和StPL（0.3%）。而大豆油中主要的甘三酯组成为：LLL（26.6%）、OLL（18.9%）、PLL（16.1%）、PLO（11.6%）、OLO（7.4%）和LLLn（7.4%）。

表5

注：P-棕榈酸；St-硬脂酸；O-油酸；L-亚油酸；Ln-亚麻酸。

由表5可知，酯-酯交换反应前后，混合油样中的甘三酯组成发生了明显的变化。以40:60混合样品的酯-酯交换反应为例，酯-酯交换反应前后LLL从12.3%变为5.2%，PPL从0.9%变为11.9%，PLO从5.7%变为13.7%，OPO从2.6%变为5.2%，PPP从46.4%变为20.9%，这些明显的变化说明该磁性固定酶对该体系具有很好的催化活性。大豆油中棕榈酸的含量较低，而棕榈硬脂中棕榈酸的含量则较高。固定化酶催化油脂酯-酯交换反应后含有棕榈酸的甘三酯组分含量均明显升高，说明固定酶催化油脂酯交换反应改变了甘三酯分子中脂肪酸的组成和分布。

可以根据当量碳数（ECN）对酯-酯交换反应前后混合样品中的甘三酯进行归类。ECN与分子中含有的总碳原子个数和具有的双键个数有关，其中ECN=cn-2(db)，cn代表脂肪酸中的总碳原子的个数，db表示脂肪酸中含有的双键个数。从表5给出的数据可知，棕榈硬脂中的甘三酯，以C48的种类较多，而大豆油中含量较高的甘三酯是C40、C42和C44三类。酯-酯交换反应后，不同当量碳数的甘三酯组成发生了变化。以40:60的混合样品为例，与酯酯交换反应前相比，酯酯交换反应后C42和C48的甘三酯含量明显下降，而C46的甘三酯含量明显增加。这些结果说明，通过酯-酯交换反应油脂的甘三酯组成发生明显变化。

Claims (4)

1.一种磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

第一步，磁性羟基磷灰石的制备

将一定量的FeCl₃·6H₂O和Fe₂SO₄·7H₂O放入烧杯中，加入脱氧水，机械搅拌使FeCl₃·6H₂O与Fe₂SO₄·7H₂O完全溶解；然后缓慢滴加25%的NH₃·H₂O溶液于混合溶液中，25℃恒温搅拌均匀；然后分别缓慢滴加Ca(NO₃)₂·4H₂0溶液和(NH₄)₂HPO₄溶液于上述反应体系中，继续搅拌均匀后升温至90℃，待其充分反应后将所得产物冷却至室温，陈化过夜，对产物进行磁分离并用去离子水洗至中性，干燥后在200℃条件下煅烧3h，得到磁性羟基磷灰石载体；

第二步，载体的功能化修饰

将第一步制备的磁性羟基磷灰石载体放入干燥的圆底烧瓶中与甲苯溶液混合均匀，然后缓慢滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷于该反应体系中，在甲苯的回流温度下充分反应；反应结束后用磁铁对产品进行分离，分离出的产品用甲苯洗涤后真空干燥，得到氨基修饰的磁性羟基磷灰石载体；

第三步，脂肪酶的固定化

取氨基修饰后的磁性羟基磷灰石载体放入干燥的圆底烧瓶中，加入10%的戊二醛溶液，25~45℃条件下在恒温振荡器中振荡反应，反应完成后加入0.025~0.125mol/L的酶溶液，继续振荡反应6~14小时；待反应结束后对固定脂肪酶进行磁分离，用pH6.0~8.0的磷酸缓冲溶液洗涤，冷冻干燥后得到磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶成品。

2.根据权利要求1所述的磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述第三步中加入的酶溶液是在pH值6.0~8.0、0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中按0.025~0.125g/mL之比例添加AY脂肪酶后混配而成。

3.根据权利要求2所述的磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶的制备方法，其特征在于：所述第三步脂肪酶固定化时，磷酸缓冲溶液的pH为7.0，添加AY脂肪酶的比例为0.10g/mL，振荡反应温度为30℃，振荡反应时间10h。

4.权利要求1制备的磁性羟基磷灰石固定化脂肪酶在食用油脂加工中作为酯酯交换催化剂应用。