CN105002156A - 一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法。该方法将新鲜菠菜切碎并与Tris-HCl缓冲液混合，并进行均质、过滤、离心，将离心后得到的固体加入一定量的磷酸盐缓冲液，离心，所得上清液经硫酸铵沉淀之后，所得沉淀再次溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得到游离的HPL粗酶液；羟基磷灰石CHT与HPL粗酶液混合，分离、洗涤后得到固定化氢过氧化物裂解酶。本发明对氢过氧化物裂解酶进行了固定化，可提高酶的活性和稳定性，原料来源丰富，可节约大量成本，有利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法，属于酶技术领域。
背景技术
氢过氧化物裂解酶HPL广泛分布于高等植物的线粒体或叶绿体膜上，其蛋白分子表面存在着很多疏水性片段而使其紧密地连接在细胞膜上。一般植物来源HPL的制备都需要采用新鲜的原材料，易受季节影响。再者，HPL在植物组织中的活力通常都比较低，且极不稳定，在提取分离过程中也极易失活。另外，HPL在反应过程中也极易失活，原因主要在于以下三个方面：(1)作为反应底物的氢过氧化物性质非常活泼，具有攻击性，易造成HPL蛋白的氧化而使酶失活；(2)HPL反应过程中产生的自由基会攻击HPL酶，使其丧失活性；(3)反应产物(包括己醛和己烯醛)也都会对HPL活力产生较强的抑制作用。
发明内容
为解决上述原料季节的影响和酶容易失活的问题，本发明的目的在于：提供一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法，该方法通过对氢过氧化物裂解酶HPL的提取，羟基磷灰石固定化HPL的制备，得到固定化氢过氧化物裂解酶，其酶的稳定性提高，活性也大大增强，并且来源丰富，也降低了成本。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步骤：
(1)将菠菜切碎并与pH7.5-9.5的Tris-HCl缓冲液按照质量比为1:3-2:3的比例混合，用均质机处理2-5min；2-5层纱布过滤之后所得滤液在2-5℃下离心20-30min，得到下层固体为M-HPL；
上述菠菜中含有很多三硝基苯磺酸、苯甲酰基磺酰氟以及对氯汞苯甲酸钠，他们的存在都会对菠菜HPL产生强烈的抑制作用，将菠菜与pH 7.5-9.5的Tris-HCl缓冲液按照一定的比例混合，可确保菠菜中对HPL的活性有抑制作用的物质置换出来，用均质机处理可以使溶液充分混合，其置换更彻底，并有利于菠菜中HPL的提取。
(2)将M-HPL加入磷酸盐缓冲溶液中，2-5℃下搅拌0.5-1.5h之后于同样温度下离心20-30min，所得上清液经体积百分比20-40％的硫酸铵沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为0.05-0.08mmol/L游离的HPL粗酶液；
上述步骤中磷酸盐缓冲溶液可以保持细胞的活性，防止其由于HPL放置以后变质，活性遭到破坏；硫酸铵属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，在纯化过程中能最大程度的保护蛋白活性，另外，硫酸铵的可溶性极好，能形成高盐环境，对于蛋白沉淀与后续的高盐纯化做准备。
(3)将羟基磷灰石CHT与HPL粗酶液以质量比为1:1-1:3的比例混合，于2-5℃、100-150rpm水浴震荡2-5h之后分离出CHT-HPL，使用上述缓冲液以及去离子水分别冲洗2-3次，直到清洗液中不含酶蛋白为止，得到固定化氢过氧化物裂解酶。
所述羟基磷灰石CHT主要用于酶的固定化，该材料价钱较低，并且可以重复使用，在酶固定化以及蛋白纯化过程中都有着非常广泛的应用。
所述实验都在2-5℃下完成，保持低温主要是防止HPL变质。
上述均质机为一般压强下的均质机，可保持和大气压的压强基本一致，防止菠菜中的HPL在高压或是低压下破坏。
上述离心速度为50-100r/min。
上述Tris-HCl缓冲液浓度浓度为0.1-0.3mol/L。
上述磷酸盐缓冲溶液pH6.8-7.8，浓度0.03-0.05mmol/L。
上述磷酸盐为磷酸钠。
同现有技术相比较，本发明的技术效果在于：原料来源丰富，制备方法简单、快速、成本低廉，通过该方法制备的固定化氢过氧化物裂解酶其活性达到增强，稳定性也提高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，其中以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能限制本发明的保护范围。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。
实施例1：
一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步骤：
a、将10g菠菜切碎并与pH 7.5、0.3mol/L的Tris-HCl缓冲液按照质量比为1:3的比例混合，用均质机处理2min；2层纱布过滤之后所得滤液在5℃下离心20min，得到下层固体为M-HPL；b、将M-HPL加入pH7.2、0.05mmol/L的磷酸钠缓冲溶液中，5℃下搅拌1.5h之后于同样温度下离心30min，所得上清液经体积百分比40％的硫酸铵沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸钠缓冲溶液中，得到0.06mmol/L游离的HPL粗酶液；
c、将羟基磷灰石CHT与HPL粗酶液以质量比为1:3的比例混合，于5℃、150rpm水浴震荡2h之后分离出CHT-HPL，使用上述缓冲液以及去离子水分别冲洗3次，直到清洗液中不含酶蛋白为止，得到固定化氢过氧化物裂解酶。
该方法所得的HPL相对酶活为70％。所述酶活的测定方法参照：Long Z,Kong X,ZhangC,et al.Stability of hydroperoxide lyase activity from Amaranthus tricolor(Amaranthusmangostanus L.)leaves:influence of selected additives.
实施例2：
一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步骤：
a、将15g菠菜切碎并与pH9.5、0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液按照2:3的比例混合，用均质机处理5min；5层纱布过滤之后所得滤液在5℃下离心30min，得到下层固体为M-HPL；
b、将M-HPL加入pH6.8、0.03mmol/L磷酸钠缓冲溶液中，2℃下搅拌0.5h之后于同样温度下离心20min，所得上清液经体积百分比20％的硫酸铵沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述PBS溶液中，得到0.08mmol/L游离的HPL粗酶液；
c、将羟基磷灰石CHT与HPL粗酶液以质量比1:3的比例混合，于5℃、150rpm水浴震荡5h之后分离出CHT-HPL，使用上述缓冲液以及去离子水分别冲洗3次，直到清洗液中不含酶蛋白为止，得到固定化氢过氧化物裂解酶。
该方法所得的PHL相对酶活为85％。
实施例3：
一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步骤：
a、将18g菠菜切碎并与pH7.5、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液按照质量比1.5:3的比例混合，用均质机处理4min；3层纱布过滤之后所得滤液在4℃下离心25min，得到下层固体为M-HPL；
b、在M-HPL加入pH7.6、0.03mmol/L磷酸钠缓冲溶液中，3℃下搅拌1h之后于同样温度下离心25min，所得上清液经体积百分比30％的硫酸铵沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸钠缓冲溶液中，得到0.05mmol/L游离的HPL粗酶液；
c、将羟基磷灰石CHT与HPL粗酶液以1:2的比例混合，于4℃、120rpm水浴震荡4h之后分离出CHT-HPL，使用上述缓冲液以及去离子水分别冲洗3次，直到清洗液中不含酶蛋白为止，得到固定化氢过氧化物裂解酶。
该方法所得的PHL相对酶活为75％。
实施例4：
一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法，包括以下步骤：
a、将15g菠菜切碎并与pH8.5、0.3mol/L的Tris-HCl缓冲液按照1:3的比例混合，用均质机处理4min；3层纱布过滤之后所得滤液在3℃下离心25min，得到下层固体为M-HPL；
b、在M-HPL加入pH7.8、0.04mmol/L磷酸钠缓冲溶液中，4℃下搅拌1h之后于同样温度下离心25min，所得上清液经体积百分比30％的硫酸铵沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸钠缓冲溶液中，得到0.07mmol/L游离的HPL粗酶液；
c、将羟基磷灰石CHT与HPL粗酶液以质量比为1:2的比例混合，于4℃、120rpm水浴震荡4h之后分离出CHT-HPL，使用上述缓冲液以及去离子水分别冲洗3次，直到清洗液中不含酶蛋白为止，得到固定化氢过氧化物裂解酶。
该方法所得的PHL相对酶活为72％。
Claims (6)
1.一种氢过氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将菠菜切碎并与pH7.5-9.5的Tris-HCl缓冲液按照质量比为1:3-2:3的比例混合，用均质机处理2-5min；2-5层纱布过滤之后所得滤液在2-5℃下离心20-30min，得到下层固体为M-HPL；
(2)将M-HPL加入磷酸盐缓冲溶液中，2-5℃下搅拌0.5-1.5h之后于同样温度下离心20-30min，所得上清液经体积百分比20-40％的硫酸铵沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述磷酸盐缓冲溶液中，得到浓度为0.05-0.08mmol/L游离的HPL粗酶液；
(3)将羟基磷灰石CHT与HPL粗酶液以质量比为1:1-1:3的比例混合，于2-5℃、100-150rpm水浴震荡2-5h之后分离出CHT-HPL，使用磷酸缓冲液以及去离子水分别冲洗2-3次，直到清洗液中不含酶蛋白为止，得到固定化氢过氧化物裂解酶。
2.根据权利要求1所述的氢过氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于：所述均质机为一般压强下的均质机。
3.根据权利要求1所述的氢过氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于：所述离心速度为50-100r/min。
4.根据权利要求1所述的氢过氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于：所述Tris-HCl缓冲液浓度浓度为0.1-0.3mol/L。
5.根据权利要求1所述的氢过氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液pH6.8-7.8，浓度0.03-0.05mmol/L。
6.根据权利要求1所述的氢过氧化物裂解酶的固定化方法，其特征在于：所述磷酸盐为磷酸钠。
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