CN111041059A - 一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法，涉及南极磷虾的加工技术，该制备方法主要包括以下步骤：(1)匀浆：将南极磷虾解冻后加水匀浆，得到浆液A；(2)酶解：分批次向浆液A中加入复合蛋白酶并调节pH，保温酶解，得到酶解液A；(3)灭酶、离心：将步骤(2)中的酶解液A灭酶后离心；(4)浓缩干燥：取离心后的上清液，过滤，即得南极磷虾肽。该制备方法通过不同种类酶的复合、分批次添加，缩短了制备时间，避免反应时间过长造成的酶失活的问题，从而能够快速而有效地得到具有良好抗氧化性能的南极磷虾肽，该南极磷虾肽对超氧阴离子及羟基自由基具有良好的清除效果。

Description

一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法
技术领域
本发明涉及南极磷虾的加工技术，具体涉及一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法。
背景技术
天然的生物活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，但由于其在生物体内含量较低，难以进行工艺化的提取，因此，常需要通过添加外源酶进行酶解，从而通过简单而经济的方法筛选出特定功能的多肽。南极磷虾是一种生活在南冰洋的南极洲水域的磷虾，其具有高蛋白、低脂肪及丰富的矿物质，含量分别为16.31％、1.3％和2.76％。利用南极磷虾的特点，人们从南极磷虾体内提取了多种高附加值产品如南极磷虾肽、南极磷虾油以及蛋白水解酶等，其中，南极磷虾肽属于生物活性肽的一种，在抗氧化活性方面具有极高价值。
中国专利CN107974480A公开了一种南极磷虾肽制备方法，该发明以南极磷虾为原料，经匀浆、酶解、离心操作，得到分层的酶解液，其中游离油层和乳层可以用于提取南极磷虾油。收集水层溶液，加入复合蛋白酶进行二次酶解，酶解液添加氧化钙进行脱氟处理、离心。离心后的清液通过膜分离设备截留大分子物质，滤过液经过减压浓缩，然后进行喷雾干燥得到氟含量低、分子量小的南极磷虾低聚肽粉。该制备方法操作简单，得到的南极磷虾肽氟含量低，营养成分破坏小，而且分子量低，人体吸收率高，为开发功能性的低氟南极磷虾低聚肽奠定基础。但上述方法需要先后经过碱性蛋白酶酶解以及二次酶解，耗时较长且制备过程相对而言较为复杂。
张元元、汪之和以及陈敏等人在文献南极磷虾肽制备工艺优化及体外抗氧化研究[J].上海海洋大学学报,2016,25(5):786-793.中通过响应曲面法优化出最适条件，使用3种不同的蛋白酶(木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶)进行酶解，得到了对超氧阴离子、羟自由基和DPPH自由基的清除能力都比较良好的多肽。李明杰、姜国良以及赫佳明等人也在文献南极磷虾肽制备工艺优化及抗氧化测定[J].食品工业科技,2012(03):244-247+266.中公开了包括加水匀浆、保温酶解、高温灭酶、离心、超滤、酶解液以及喷雾干燥在内的南极磷虾制备方法，在该过程中，通过正交试验探寻了磷虾肽制备的最优条件，进而得到了在抗氧化方面具有良好的清除自由基的能力的南极磷虾肽。上述文献均是通过对制备工艺中的料液比、加酶量、pH、温度或时间进行的合理优化，虽然得到了最优的制备参数，但制备方法仅为在已知参数基础上的优化，最终结果仍落在可以预计的范围之中。
针对南极磷虾制备工艺中存在的制备时间长、酶类易失活等问题，应寻找一种南极磷虾肽的制备方法，使得该制备方法简单、高效，能够快速制备出具有良好抗氧化活性的南极磷虾肽。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法，该方法通过不同种类酶的复合、分批次添加，缩短了制备时间，避免反应时间过长造成的酶失活的问题，从而能够快速而有效地得到具有良好抗氧化性能的南极磷虾肽。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)匀浆：将南极磷虾解冻后加水匀浆，得到浆液A；
(2)酶解：分批次向浆液A中加入复合蛋白酶并调节pH，保温酶解，得到酶解液A；
(3)灭酶、离心：将步骤(2)中的酶解液A灭酶后离心；
(4)浓缩干燥：取离心后的上清液，过滤，将上清液经喷雾干燥即得南极磷虾肽；
其中，步骤(2)中所述分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至5-6，酶解0.5-1.5h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至6-8，酶解1-2h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至8-9.5，酶解1-2h。
进一步地，步骤(1)中所述南极磷虾与所述水的重量比为1:2-4，步骤(2)中所述浆液A与复合蛋白酶的重量比为120-180:1。
进一步地，步骤(2)中所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种。
优选地，步骤(2)中所述复合蛋白酶为重量比为3-5:2-3:1-3:0.5-0.8的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
更进一步优选地，步骤(2)中所述复合蛋白酶为重量比为3:2:1:0.5-0.8的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
优选地，步骤(2)中所述分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至5.5-6，酶解0.8-1.2h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至6-7，酶解1-1.5h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至8-9，酶解1.5-2h。
更进一步优选地，步骤(2)中所述分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至6，酶解1h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至7，酶解1.2h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至9，酶解1.8h。
进一步地，步骤(2)中所述保温的温度为50-55℃。
进一步地，步骤(2)中所述调节pH使用盐酸或氢氧化钠进行调节。
进一步地，步骤(3)中所述灭酶的温度为100℃，时间为8-12min。
进一步地，步骤(3)中所述离心的速度为4500-5000r/min，时间为3-5min。
进一步地，步骤(4)中所述过滤使用截留分子量为2000-5000Da的纳滤膜。
本发明所取得的技术效果是：
1.本发明通过不同种类酶的复合、分批次添加，对南极磷虾匀浆进行酶解，缩短了制备时间，与此同时，通过pH、温度、料液比以及酶加入量等的相互配合，避免反应时间过长造成的酶失活的问题，能够快速而有效地得到具有良好抗氧化性能的南极磷虾肽；
2.本发明制备得到的南极磷虾肽具有较强的抗氧化性能，对于超氧阴离子以及羟基自由基的清除率分别可达59.31％-64.19％及68.34％-75.21％。
具体实施方式
值得说明的是，本发明中的南极磷虾为购买自东营市鼎威海洋生物技术有限公司的南极磷虾砖；菠萝蛋白酶购买自上海如吉生物科技有限公司，产品编号为I00045；木瓜蛋白酶购买自上海如吉生物科技有限公司，产品编号为I00086；胰蛋白酶购买自上海如吉生物科技有限公司，产品编号为I00108；碱性蛋白酶购买自上海如吉生物科技有限公司，产品编号为I00006。其余原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
实施例1
一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)匀浆：将南极磷虾解冻后加水匀浆，得到浆液A；
(2)酶解：分批次向浆液A中加入复合蛋白酶并使用盐酸或氢氧化钠调节pH，50℃保温酶解，得到酶解液A；
(3)灭酶、离心：将步骤(2)中的酶解液A100℃灭酶8min后离心，离心的速度为4500r/min，时间为5min；
(4)浓缩干燥：取离心后的上清液，使用截留分子量为2000Da的纳滤膜过滤，将上清液经喷雾干燥即得南极磷虾肽；
其中，步骤(2)中分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至5，酶解0.5h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至6，酶解1h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至8，酶解1h。步骤(1)中南极磷虾与水的重量比为1:2，步骤(2)中所述浆液A与复合蛋白酶的重量比为120:1。步骤(2)中复合蛋白酶为重量比为3:2:1:0.5的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
实施例2
一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)匀浆：将南极磷虾解冻后加水匀浆，得到浆液A；
(2)酶解：分批次向浆液A中加入复合蛋白酶并使用盐酸或氢氧化钠调节pH，55℃保温酶解，得到酶解液A；
(3)灭酶、离心：将步骤(2)中的酶解液A100℃灭酶12min后离心，离心的速度为5000r/min，时间为3min；
(4)浓缩干燥：取离心后的上清液，使用截留分子量为5000Da的纳滤膜过滤，将上清液经喷雾干燥即得南极磷虾肽；
其中，步骤(2)中分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至6，酶解1.5h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至8，酶解2h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至9.5，酶解2h。步骤(1)中南极磷虾与水的重量比为1:4，步骤(2)中所述浆液A与复合蛋白酶的重量比为180:1。步骤(2)中复合蛋白酶为重量比为5:3:3:0.8的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
实施例3
一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)匀浆：将南极磷虾解冻后加水匀浆，得到浆液A；
(2)酶解：分批次向浆液A中加入复合蛋白酶并使用盐酸或氢氧化钠调节pH，52℃保温酶解，得到酶解液A；
(3)灭酶、离心：将步骤(2)中的酶解液A100℃灭酶10min后离心，离心的速度为5000r/min，时间为4min；
(4)浓缩干燥：取离心后的上清液，使用截留分子量为4000Da的纳滤膜过滤，将上清液经喷雾干燥即得南极磷虾肽；
其中，步骤(2)中分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至6，酶解1h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至7，酶解1.2h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至9，酶解1.8h。步骤(1)中南极磷虾与水的重量比为1:3，步骤(2)中浆液A与复合蛋白酶的重量比为150:1。步骤(2)中复合蛋白酶为重量比为3:2:1:0.6的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
实施例4
一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)匀浆：将南极磷虾解冻后加水匀浆，得到浆液A；
(2)酶解：分批次向浆液A中加入复合蛋白酶并使用盐酸或氢氧化钠调节pH，50℃保温酶解，得到酶解液A；
(3)灭酶、离心：将步骤(2)中的酶解液A100℃灭酶8min后离心，离心的速度为4500r/min，时间为5min；
(4)浓缩干燥：取离心后的上清液，使用截留分子量为2000Da的纳滤膜过滤，将上清液经喷雾干燥即得南极磷虾肽；
其中，步骤(2)中分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至5.5，酶解0.8h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至6，酶解1h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至8，酶解1.5h。步骤(1)中南极磷虾与水的重量比为1:2，步骤(2)中所述浆液A与复合蛋白酶的重量比为140:1。步骤(2)中复合蛋白酶为重量比为3:2:1:0.5的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
实施例5
一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)匀浆：将南极磷虾解冻后加水匀浆，得到浆液A；
(2)酶解：分批次向浆液A中加入复合蛋白酶并使用盐酸或氢氧化钠调节pH，55℃保温酶解，得到酶解液A；
(3)灭酶、离心：将步骤(2)中的酶解液A100℃灭酶12min后离心，离心的速度为5000r/min，时间为3min；
(4)浓缩干燥：取离心后的上清液，使用截留分子量为5000Da的纳滤膜过滤，将上清液经喷雾干燥即得南极磷虾肽；
其中，步骤(2)中分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至6，酶解1.2h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至7，酶解1.5h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至9，酶解2h。步骤(1)中南极磷虾与水的重量比为1:4，步骤(2)中所述浆液A与复合蛋白酶的重量比为160:1。步骤(2)中复合蛋白酶为重量比为3:2:1:0.8的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
对比例1
与实施例3的区别仅在于，步骤(2)中复合蛋白酶为重量比为2:4:0.5:1的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
对比例2
与实施例3的区别仅在于，步骤(2)中复合蛋白酶为重量比为6:1:4:0.3的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
对比例3
与实施例3的区别仅在于，步骤(2)中分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至4，酶解1.8h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至9，酶解0.8h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至10，酶解2.2h。
对比例4
与实施例3的区别仅在于，步骤(1)中南极磷虾与水的重量比为1:6，步骤(2)中浆液A与复合蛋白酶的重量比为100:1。
对比例5
与实施例3的区别仅在于：南极磷虾肽的制备方法包括以下步骤：
(1)匀浆：将南极磷虾解冻后加水匀浆，得到浆液A；
(2)酶解：向浆液A中加入复合蛋白酶并使用盐酸或氢氧化钠调节pH至9，60℃保温酶解4h，得到酶解液A；
(3)灭酶、离心：将步骤(2)中的酶解液A100℃灭酶5min后离心，离心的速度为4000r/min，时间为8min；
(4)浓缩干燥：取离心后的上清液，使用截留分子量为6000Da的纳滤膜过滤，喷雾干燥即得南极磷虾肽；
体外抗氧化活性试验
将本发明中实施例1-5及对比例1-5制备得到的未经喷雾干燥的南极磷虾肽进行体外超氧阴离子清除作用及羟基自由基清除作用试验，试验方法参照文献：李明杰.南极大磷虾多肽制备工艺优化、脱氟及其体外活性的研究[D].中国海洋大学,2012.所记载的方式进行，最终试验结果记载在下表1及表2中。
一、南极磷虾肽对超氧阴离子的清除作用
超氧阴离子(O2-)在人体内有一定数量的存在，不发生化学变化对人体无害，但与羟基(-OH)结合后的产物会导致细胞DNA损坏，破坏人类机体功能，对其进行抑制并清除其活性，可降低超氧阴离子对细胞DNA的损伤。
表1
实例 清除率(％)
实施例1 59.31
实施例2 59.89
实施例3 64.19
实施例4 63.93
实施例5 62.01
对比例1 50.04
对比例2 51.63
对比例3 46.73
对比例4 55.78
对比例5 52.32
由表1可知，本发明得到的南极磷虾肽对超氧阴离子拥有良好的清除作用，清除率在59.31％-64.19％范围内，其中，实施例3的清楚效果最优，清除率可达64.19％。对比例1-5相比于实施例3的南极磷虾肽而言对于超氧阴离子的清除率相对较低，由此可知，料液比、加酶情况、分子量以及制备方法将极大地影响着南极磷虾肽的功效，在本发明保护范围内的各个参数条件下制备出的南极磷虾肽对超氧阴离子具有较强的清除作用。
二、南极磷虾肽对羟基自由基的清除作用
羟自由基系活性氧一种，能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物，在人体内羟基自由基的含量较大，危害也较为严重。
表2
实例 清除率(％)
实施例1 69.07
实施例2 68.34
实施例3 75.21
实施例4 72.59
实施例5 72.04
对比例1 65.73
对比例2 64.36
对比例3 57.12
对比例4 68.06
对比例5 63.32
由表2可知，本发明得到的南极磷虾肽对羟基自由基拥有良好的清除作用，清除率在68.34％-75.21％范围内，其中，实施例3的清楚效果最优，清除率可达75.21％。对比例1-5相比于实施例3的南极磷虾肽而言对于羟基自由基的清除率相对较低，由此可知，料液比、加酶情况、分子量以及制备方法将极大地影响着南极磷虾肽的功效，在本发明保护范围内的各个参数条件下制备出的南极磷虾肽对羟基自由基具有较强的清除作用。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种具有抗氧化活性南极磷虾肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)匀浆：将南极磷虾解冻后加水匀浆，得到浆液A；
(2)酶解：分批次向浆液A中加入复合蛋白酶并调节pH，保温酶解，得到酶解液A；
(3)灭酶、离心：将步骤(2)中的酶解液A灭酶后离心；
(4)浓缩干燥：取离心后的上清液，过滤，将上清液经喷雾干燥即得南极磷虾肽；
其中，步骤(2)中所述分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至5-6，酶解0.5-1.5h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至6-8，酶解1-2h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至8-9.5，酶解1-2h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述南极磷虾与所述水的重量比为1:2-4，步骤(2)中所述浆液A与复合蛋白酶的重量比为120-180:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述复合蛋白酶为重量比为3-5:2-3:1-3:0.5-0.8的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述复合蛋白酶为重量比为3:2:1:0.5-0.8的菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述分批次加入复合蛋白酶酶解包括：初次加入复合蛋白酶，调节pH至5.5-6，酶解0.8-1.2h；再次加入复合蛋白酶，调节pH至6-7，酶解1-1.5h，以及第三次加入复合蛋白酶，调节pH至8-9，酶解1.5-2h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述保温的温度为50-55℃。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述灭酶的温度为100℃，时间为8-12min。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述离心的速度为4500-5000r/min，时间为3-5min。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述过滤使用截留分子量为2000-5000Da的纳滤膜。
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