CN117448408B - 一种抑制血小板凝集的磷虾多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种抑制血小板凝集的磷虾多肽及其制备方法，属于海洋生物活性物质提取技术领域。所述制备方法包括以下步骤：S1、先将脱脂南极磷虾粉加入纯化水搅拌均匀，然后加入蛋白酶进行一次酶解，之后灭酶，得到酶解液；S2、将上述酶解液离心取上清液，然后进行过滤、超滤，得到滤出液，之后将滤出液进行浓缩，得到浓缩液；S3、将上述浓缩液作为DEAE上样液进行离子交换层析，得到洗脱溶液，然后进行超滤脱盐、冷冻干燥，得到冻干品；S4、将上述冻干品加入羧肽酶进行二次酶解，然后超滤除酶、超滤除氟脱盐、冷冻干燥，得到磷虾多肽。本发明制得的磷虾多肽可有效抑制血小板的凝集。
Description
技术领域
本申请属于海洋生物活性物质提取技术领域，具体涉及一种抑制血小板凝集的磷虾多肽、制备方法及其应用。
背景技术
南极磷虾主要生活在南极洲周围水域，生物资源量大，含有丰富的营养物质且优质蛋白含量高。目前，开发的应用价值高产品以磷虾油为主，提取磷虾油后的脱脂磷虾粉末得到有效利用，仅用作低附加值的饲料使用。
生物活性肽具有各种各样的生理活性，如抗菌抗炎等免疫活性，抑制肿瘤活性，促进生长活性，抗高血压活性，抑制血小板凝集活性等。生物活性肽按照其来源可分为天然生物活性肽和人工水解活性肽。天然生物活性肽主要存在于生物体的各种系统、器官组织及细胞中，如肽类激素，抗生素等。但是，天然活性肽在生物体内含量低，易降解，提取难度大，难以实现规模化、低成本生产。目前，适合规模化生产的水解生物活性肽越来越受到科研工作者的重视。人们已经成功研制了多种生物活性肽：酶解鳕鱼鱼肉得到生长因子促内分泌肽。
海洋生物蛋白储量丰富、结构多样、功能独特，是目前开发制备生物活性肽的重要资源。海洋活性肽是海洋生物中氨基酸不同组成和排列方式构成的从简单的二肽到复杂的线性或环状结构的不同肽类的总称，食用安全高，药用功效广，具有广阔的发展前景。海洋活性肽的主要功效包括止痛、免疫调节、抑菌作用、抗血栓作用、降血压和抗凝血等。
目前对南极磷虾肽的研究包括：具有抗菌效果的南极磷虾抗菌肽、具有抗氧化活性的南极磷虾多肽、具有抑制血管紧张素（ACE）活性的磷虾多肽、具有对非酒精性脂肪肝病保护功效的南极磷虾肽等。但是对具有抑制血小板凝集功效的南极磷虾多肽的研究鲜有报道，本发明可为该领域的研究和应用提供技术支持。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种抑制血小板凝集的磷虾多肽及其制备方法，本发明制备方法中一次酶解可生成对花生四烯酸诱导的血小板抑制多肽，二次酶解可产生对二磷酸腺苷诱导的多肽，纯化过程可使抑制效果明显增强。制得的磷虾多肽可有效抑制血小板的凝集。
本发明一方面提供了一种抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、先将脱脂南极磷虾粉加入纯化水搅拌均匀，然后加入蛋白酶进行一次酶解，之后灭酶，得到酶解液；
S2、将上述酶解液离心取上清液，然后进行过滤、超滤，得到滤出液，之后将滤出液进行浓缩，得到浓缩液；
S3、将上述浓缩液作为DEAE上样液进行离子交换层析，得到洗脱溶液，然后进行超滤脱盐、冷冻干燥，得到冻干品；
S4、将上述冻干品加入羧肽酶进行二次酶解，然后超滤除酶、超滤除氟脱盐、冷冻干燥，得到磷虾多肽。
可选地，所述步骤S1中一次酶解的过程为：先用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.1-8.5，然后在温度为40℃、搅拌转速600-1000rpm的条件下酶解2-3h，所述蛋白酶为胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，Alcalase蛋白酶中的任意一种或几种；灭酶的过程为：用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至3.5-4.5，升温至90-100℃后搅拌25-35min实现灭酶。
可选地，所述步骤S2中离心的过程为：待所述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/L氢氧化钠调节pH至10-10.5，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。
可选地，所述步骤S2中过滤前用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至7.0-7.5，然后经滤布过滤得到过滤液。
可选地，所述过滤液采用20-50kd的超滤膜超滤，超滤过程中不断添加摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液、pH 7.2超滤缓冲液至所述滤出液280纳米吸光度低于0.05时结束超滤，收集滤出液。
可选地，所述滤出液经1-5kd的超滤膜浓缩，收集超滤浓缩液，调节所述超滤浓缩液的电导率低于20ms。
可选地，所述步骤S3中离子交换层析的层析介质为DEAE Sephadex A-50，平衡缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液；洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液；洗脱缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.3mol/L的氯化钠溶液。
可选地，所述步骤S4中二次酶解前加入摩尔浓度为0.05mol/L的碳酸铵溶液，调节pH为8.0-8.5，然后加入0.2-0.5g羧肽酶A，在35-40℃的水浴锅中二次酶解20-40min，之后用15-40kd的超滤膜超滤，分多次加入摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，收集滤出溶液，再用1-5kd的超滤膜浓缩，浓缩过程中不断添加纯化水脱盐，最后冷冻干燥制得磷虾多肽。
本发明另一方面提供了一种抑制血小板凝集的磷虾多肽，所述抑制血小板凝集的磷虾多肽采用上述的制备方法制得。
本申请的有益效果包括但不限于：
1、本发明提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法中，一次酶解可生成对花生四烯酸诱导的血小板抑制多肽，二次酶解可产生对二磷酸腺苷诱导的多肽，纯化过程可使抑制效果明显增强；
2、本发明提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法中，超滤和离子交换层析过程能够降低氟含量，制备脱氟磷虾多肽；
3、本发明提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，一次酶解后，采用超滤和DEAE阴离子层析，再用羧肽酶酶解，能够降低羧肽酶的使用量，节约成本并且后续工艺中容易去除；
4、本发明提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，在制备过程不使用挥发性有机溶剂，降低了安全风险；
5、本发明提供的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，采用了蛋白酶和羧肽酶复合酶解技术，与之前单一蛋白酶酶解技术相比，能够开发出潜在的新功效，为磷虾多肽的研究开辟了新的方向。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法流程图；
图2为本申请实施例4中制得的磷虾多肽对花生四烯酸（AA）诱导抑制效果示意图；
图3为本申请实施例4中制得的磷虾多肽对二磷酸腺苷（ADP）诱导抑制效果示意图；
图4为本申请实施例4中制得的磷虾多肽电泳示意图；
图5为本申请实施例4中制得的磷虾多肽分子筛液相示意图。
具体实施方式
为了更清楚地阐释本发明的整体构思，下面以示例的方式进行详细说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”“一些实施例”“示例”“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
在下文中，将结合示例性实施例来详细说明本发明的抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法及其制备方法。图1为本申请具体实施例1中抑制血小板凝集的磷虾多肽制备方法流程图。
如图1所示，在本发明的一个示例性实施例中，抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法可通过以下步骤来实现：
S1、先将脱脂南极磷虾粉加入纯化水，在40℃水浴锅中以600-1000rpm搅拌8-12min。然后加入占脱脂南极磷虾粉质量百分数1.4%-2%的蛋白酶，用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.1-8.5，然后在温度为40℃、搅拌转速600-1000rpm的条件下酶解2-3h，所述蛋白酶为胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，Alcalase蛋白酶中的任意一种或几种。用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至3.5-4.5，升温至90-100℃后搅拌25-35min实现灭酶，得到酶解液。
一次酶解可生成对花生四烯酸诱导的血小板抑制多肽。该步骤可将磷虾蛋白降解出环氧化酶（COX）抑制剂效果的肽类，抑制血液中环氧化酶的活性。本申请通过响应面筛选试验，确定了适合的蛋白酶组合和酶解条件。环氧化酶（COX）首先将花生四烯酸（AA）转化为不稳定的前列腺素G2（PGG2）和前列腺素H2（PGH2），然后在过氧化物酶、血环素合成酶等关键酶的作用下，进一步形成具有生物活性的二十碳衍生物(Eicosanoids)，包括血栓素A2（TXA2）、PGD2、PGE2、PGF2、PGI2等。这些二十碳衍生物可刺激血小板凝集。
S2、将待上述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/L氢氧化钠调节pH至10-10.5，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。然后用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至7.0-7.5，然后经滤布过滤得到过滤液。再将过滤液采用20-50kd的超滤膜超滤，超滤过程中不断添加摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液、pH 7.2超滤缓冲液至所述滤出液280纳米吸光度（A280）低于0.05时结束超滤，收集滤出液。之后将所述滤出液经1-5kd的超滤膜浓缩，收集超滤浓缩液，调节所述超滤浓缩液的电导率低于20ms。
离心、过滤、超滤和浓缩过程可明显提高对花生四烯酸诱导抑制效果。经调pH，溶液中会沉淀出不溶物，经离心和过滤过程可去除这些沉淀物，经测定这些沉淀物不具备血小板抑制效果。在两次超滤过程中，一次超滤膜内截留的物质为高分子量的不具有血小板抑制效果的蛋白，第二次超滤流出液体中含有对花生四烯酸诱导的血小板抑制效果的肽类，通过二次超滤把部分肽类浓缩收集。通过离心、过滤、超滤和浓缩工艺，可将不具有血小板抑制效果的肽类去除，并保留对花生四烯酸诱导抑制效果的肽类。因此，在单位重量的肽中具有抑制效果的肽类的占比大幅增加。
S3、将上述浓缩液作为DEAE上样液进行离子交换层析，层析介质为DEAE SephadexA-50，平衡缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液；洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液；洗脱缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.3mol/L的氯化钠溶液，得到洗脱溶液，然后进行超滤脱盐、冷冻干燥，得到冻干品。
离子层析过程可有效降低磷虾多肽中氟的含量。离子交换层析过程中，游离的氟离子会在上样和洗涤过程中被氯离子置换，从而能降低磷虾多肽中的氟含量。同时，一次酶解后，采用超滤和DEAE阴离子层析，能够有效降低二次酶解过程中羧肽酶的使用量，节约成本并且后续工艺中容易去除。
S4、将上述冻干品加入摩尔浓度为0.05mol/L的碳酸铵溶液，调节pH为8.0-8.5，然后加入0.2-0.5g羧肽酶A，羧肽酶的酶活为2000-3000U/g蛋白，在35-40℃的水浴锅中二次酶解20-40min，之后用15-40kd的超滤膜超滤，分多次加入摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，收集滤出溶液，再用1-5kd的超滤膜浓缩，浓缩过程中不断添加纯化水脱盐，最后冷冻干燥制得磷虾多肽。
二次酶解过程中可产生对二磷酸腺苷诱导的多肽，超滤能够降低磷虾多肽中氟的含量。本申请采用多种蛋白酶对一次冻干品进行酶解，经对比筛选，发现羧肽酶的效果最好，不仅能够保存之前对花生四烯酸诱导的血小板凝集的抑制效果，同时能够酶解出对ADP诱导的血小板凝集有抑制效果的多肽，通过对ADP诱导的血小板凝集的抑制作用响应面优化了羧肽酶的反应条件。超滤和浓缩过程可明显提高对二磷酸腺苷诱导抑制效果。
实施例1
本实施例采用上述制备方法制备了一种抑制血小板凝集的磷虾多肽，具体步骤如下：
1、先在1kg脱脂南极磷虾粉中加入4L纯化水，在40℃水浴锅中以600rpm的转速搅拌10min。然后加入14g胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase蛋白酶，用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.1，然后在温度为40℃、搅拌转速600rpm的条件下酶解2h。用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至3.5，升温至90℃后搅拌35min实现灭酶，得到酶解液4.8L。
2、将待上述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/L氢氧化钠调节pH至10，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。然后用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至7.0，然后经621#滤布过滤得到过滤液。再将过滤液采用20kd的超滤膜超滤，超滤过程中不断添加摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液、pH 7.2超滤缓冲液至所述滤出液280纳米吸光度（A280）为0.05时结束超滤，收集滤出液。之后将所述滤出液经1kd的超滤膜浓缩，收集超滤浓缩液1.2L，调节所述超滤浓缩液的电导率低于20ms。
3、将上述浓缩液作为DEAE上样液进行离子交换层析，层析介质为DEAE SephadexA-50，柱体积10L；平衡缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液，pH为7.2；洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液，pH为7.2；洗脱缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.3mol/L的氯化钠溶液，pH为7.2，收集洗脱溶液22L，然后进行超滤脱盐、冷冻干燥，得到冻干品27.2g。
4、将上述冻干品加入摩尔浓度为0.05mol/L的碳酸铵溶液，调节pH为8.0，然后加入0.2g（2000-3000U/g蛋白）羧肽酶A，在35℃的水浴锅中二次酶解30min，之后用15kd的超滤膜超滤，分5次加入摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，每次加入300ml，收集滤出溶液1.7L。再用3kd的超滤膜浓缩，浓缩过程中不断添加纯化水脱盐，最后冷冻干燥制得磷虾多肽13.2g。
实施例2
本实施例采用上述制备方法制备了另一种抑制血小板凝集的磷虾多肽，具体步骤如下：
1、先在1kg脱脂南极磷虾粉中加入4L纯化水，在40℃水浴锅中以1000rpm的转速搅拌12min。然后加入20g胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase蛋白酶，用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.5，然后在温度为40℃、搅拌转速1000rpm的条件下酶解3h。用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至4.5，升温至100℃后搅拌35min实现灭酶，得到酶解液5L。
2、将待上述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/L氢氧化钠调节pH至10.5，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。然后用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至7.5，然后经621#滤布过滤得到过滤液。再将过滤液采用50kd的超滤膜超滤，超滤过程中不断添加摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液、pH 7.2超滤缓冲液至所述滤出液280纳米吸光度（A280）为0.04时结束超滤，收集滤出液。之后将所述滤出液经5kd的超滤膜浓缩，收集超滤浓缩液1.8L，调节所述超滤浓缩液的电导率低于20ms。
3、将上述浓缩液作为DEAE上样液进行离子交换层析，层析介质为DEAE SephadexA-50，柱体积10L；平衡缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液，pH为7.2；洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液，pH为7.2；洗脱缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.3mol/L的氯化钠溶液，pH为7.2，收集洗脱溶液24.5L，然后进行超滤脱盐、冷冻干燥，得到冻干品27.8g。
4、将上述冻干品加入摩尔浓度为0.05mol/L的碳酸铵溶液，调节pH为8.0，然后加入0.5g（2000-3000U/g蛋白）羧肽酶A，在40℃的水浴锅中二次酶解40min，之后用20kd的超滤膜超滤，分5次加入摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，每次加入300ml，收集滤出溶液2.1L。再用3kd的超滤膜浓缩，浓缩过程中不断添加纯化水脱盐，最后冷冻干燥制得磷虾多肽14.1g。
实施例3
本实施例采用上述制备方法制备了另一种抑制血小板凝集的磷虾多肽，具体步骤如下：
1、先在1kg脱脂南极磷虾粉中加入4L纯化水，在40℃水浴锅中以700rpm的转速搅拌9min。然后加入16g胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase蛋白酶，用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.5，然后在温度为40℃、搅拌转速900rpm的条件下酶解2h。用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至4.2，升温至100℃后搅拌30min实现灭酶，得到酶解液4.7L。
2、将待上述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/L氢氧化钠调节pH至10.2，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。然后用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至7.5，然后经621#滤布过滤得到过滤液。再将过滤液采用30kd的超滤膜超滤，超滤过程中不断添加摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液、pH 7.2超滤缓冲液至所述滤出液280纳米吸光度（A280）为0.04时结束超滤，收集滤出液。之后将所述滤出液经5kd的超滤膜浓缩，收集超滤浓缩液1.3L，调节所述超滤浓缩液的电导率低于20ms。
3、将上述浓缩液作为DEAE上样液进行离子交换层析，层析介质为DEAE SephadexA-50，柱体积10L；平衡缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液，pH为7.2；洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液，pH为7.2；洗脱缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.3mol/L的氯化钠溶液，pH为7.2，收集洗脱溶液29.7L，然后进行超滤脱盐、冷冻干燥，得到冻干品26.8g。
4、将上述冻干品加入摩尔浓度为0.05mol/L的碳酸铵溶液，调节pH为8.3，然后加入0.5g（2000-3000U/g蛋白）羧肽酶A，在38℃的水浴锅中二次酶解25min，之后用20kd的超滤膜超滤，分4次加入摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，每次加入300ml，收集滤出溶液1.6L。再用3kd的超滤膜浓缩，浓缩过程中不断添加纯化水脱盐，最后冷冻干燥制得磷虾多肽12.9g。
实施例4
本实施例采用上述制备方法制备了另一种抑制血小板凝集的磷虾多肽，具体步骤如下：
1、先在1kg脱脂南极磷虾粉中加入4L纯化水，在40℃水浴锅中以800rpm的转速搅拌10min。然后加入18g胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase蛋白酶，用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.0，然后在温度为40℃、搅拌转速800rpm的条件下酶解2.5h。用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至4.0，升温至95℃后搅拌30min实现灭酶，得到酶解液4.9L。
2、将待上述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/L氢氧化钠调节pH至10.5，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。然后用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至7.2，然后经621#滤布过滤得到过滤液。再将过滤液采用40kd的超滤膜超滤，超滤过程中不断添加摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液、pH 7.2超滤缓冲液至所述滤出液280纳米吸光度（A280）为0.03时结束超滤，收集滤出液。之后将所述滤出液经3kd的超滤膜浓缩，收集超滤浓缩液1.2L，调节所述超滤浓缩液的电导率低于20ms。
3、将上述浓缩液作为DEAE上样液进行离子交换层析，层析介质为DEAE SephadexA-50，柱体积10L；平衡缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液，pH为7.2；洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液，pH为7.2；洗脱缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.3mol/L的氯化钠溶液，pH为7.2，收集洗脱溶液27.5L，然后进行超滤脱盐、冷冻干燥，得到冻干品27.2g。
4、将上述冻干品加入摩尔浓度为0.05mol/L的碳酸铵溶液，调节pH为8.0，然后加入0.5g（2000-3000U/g蛋白）羧肽酶A，在37℃的水浴锅中二次酶解30min，之后用30kd的超滤膜超滤，分5次加入摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，每次加入300ml，收集滤出溶液1.8L。再用3kd的超滤膜浓缩，浓缩过程中不断添加纯化水脱盐，最后冷冻干燥制得磷虾多肽13.4g。
对比例1
本对比例采用与实施例4相同的制备方法制备了一种对比磷虾多肽，与实施例4不同的是：步骤1为：先在1kg脱脂南极磷虾粉中加入4L纯化水，在50℃水浴锅中以1500rpm的转速搅拌15min。然后加入25g胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase蛋白酶，用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.0，然后在温度为50℃、搅拌转速1500rpm的条件下酶解2.5h。用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至4.0，升温至95℃后搅拌30min实现灭酶，得到酶解液4.9L。
对比例2
本对比例采用与实施例4相同的制备方法制备了一种对比磷虾多肽，与实施例4不同的是：步骤2为：将酶解液的温度降至40℃以下后，加入丙酮至溶液浓度为70%，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液。再加入丙酮至溶液浓度为92%，沉降5小时，虹吸去除上清液，取底部沉淀物4000rpm离心10min，收集沉淀物溶解，溶解液经621#滤布过滤后收集过滤液进入步骤3。
对比例3
本对比例采用与实施例4相同的制备方法制备了另一种对比磷虾多肽，与实施例4不同的是：步骤3中无DEAE离子交换层析过程。
对比例4
本对比例采用与实施例4相同的制备方法制备了另一种对比磷虾多肽，与实施例4不同的是：洗脱条件为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.2mol/L的氯化钠溶液。
对比例5
本对比例采用与实施例4相同的制备方法制备了另一种磷虾多肽，与实施例4不同的是：步骤3中无超滤脱盐和冷冻干燥的过程。
对比例6
本对比例采用与实施例4相同的制备方法制备了另一种对比磷虾多肽，与实施例4不同的是：步骤4中无二次酶解、超滤除酶过程。
对比例7（二次酶解的酶不同）
本对比例采用与实施例4相同的制备方法制备了另一种对比磷虾多肽，与实施例4不同的是：将羧肽酶A替换为胰蛋白酶。
对比例8
本对比例采用与实施例4相同的制备方法制备了另一种对比磷虾多肽，与实施例4不同的是：步骤4中无超滤除氟脱盐和冷冻干燥的过程。
测试一：血小板抑制实验
具体实验方法为：饲养家兔耳静脉取血，用5%柠檬酸钠溶液离心管收集，轻微摇动混合。将磷虾多肽冻干粉用生理盐水溶解并稀释成不同浓度的药液备用，分别取10μl药液或生理盐水于prp中，37℃温育10min。按born氏比浊法，即ppp调零及prp调幅后，分别加入5μl的花生四烯酸（以下用AA表示）(0.35mmol/l)，二磷酸腺苷（以下用ADP表示）(3μmol/l)在血小板凝集仪上测定血小板凝集性并记录5min内血小板最大凝集率，血小板凝集抑制率计算公式为:血小板凝集抑制率(%)=［1-(测试管凝集百分率/对照管凝集百分率)］×100。用直线回归法求出样品的半数抑制浓度(50% inhibitory concentration，ic50)。抑制效果的强度以半数抑制浓度的倒数来表示，单位为IU，见图2和图3 ，抑制效果与半数抑制浓度成反比。
分别取实施例1-4和对比例1-8制备过程中的脱脂酶解磷虾粉、一次酶解蛋白酶灭活后酶解液、DEAE上样液、DEAE收集液、磷虾多肽稀释到合适浓度后分别进行血小板抑制实验测试。每个样本取样测试5个平行计算平均值，测试结果如表1所示。
表1 样品半数抑制浓度
表1续 样品半数抑制浓度
由表1和图2-3可知，实施例1-4采用本申请的制备方法，在一次酶解可以将没有血小板抑制效果的脱脂磷虾蛋白制备出具有AA抑制效果的肽类，二次酶解可制备出对ADP抑制效果的肽类，纯化过程可使得抑制活性逐渐增强。尤其是实施例4制备得到的磷虾多肽对AA和ADP的抑制效果最好，能够酶解出最大量对花生四烯酸诱导的血小板凝集有抑制效果的肽类。
对比例1与实施例4相比，一次酶解的条件不同，对AA诱导抑制效果的肽类的量最少，抑制效果差。说明将没有血小板抑制效果的脱脂磷虾蛋白制备出具有AA抑制效果的肽类需要特定的一次酶解条件。
对比例2与实施例4相比，采用有机溶剂梯度法替代离心、过滤、超滤工艺，由表1可以看出，采用有机溶剂梯度沉淀法虽然可实现对该肽类的纯化，但纯化效果却不如本申请的工艺，并且使用易燃易爆的丙酮溶剂还会增加安全隐患。由此说明本申请制备方法步骤2中具有抑制效果的肽类经不同孔径的超滤膜分离可实现较好的纯化效果。经实施例1-4中不同膜的组合对比，发现使用40kd孔径和3kd的超滤膜组合效果最佳。
对比例3与实施例4相比，无DEAE离子交换层析过程。对比例4与实施例4相比，离子层析条件不同。由表1可知，对比例3和4得到的磷虾多肽的抑制效果与实施例4相比较差。说明本申请的DEAE离子交换层析可将目标肽类吸附并通过洗涤和洗脱环节将其纯化，其中在0.3mol/L氯化钠条件下进行洗脱得到的效果最好。
对比例5与实施例4相比，缺少超滤脱盐和冷冻干燥的过程。由表1可知，对比例5得到的磷虾多肽的抑制效果与实施例4相比较差。说明经过超滤和冻干可将溶液中小分子盐类去除，并且得到粉末状固体后有利于下一步羧肽酶解时保持较理想的浓度。
对比例6与实施例4相比，无二次酶解、超滤除酶过程。对比例7与实施例4相比，二次酶解的酶不同。由表1可知，由表1可知，对比例6和7得到的磷虾多肽的抑制效果与实施例4相比较差。说明步骤4中采用羧肽酶可酶解出具有抑制ADP诱导血小板凝集效果的肽类。
对比例8与实施例4相比，步骤4中无超滤除氟脱盐和冷冻干燥的过程。由表1可知，由表1可知，对比例8得到的磷虾多肽的抑制效果与实施例4相比较差。说明经超滤去除降解后的小分子杂质冻干制备肽类，在纯化样品的同时制备可长时间存放的肽类。
测试二、电泳测试
对实施例4制备得到的磷虾多肽进行电泳测试。电泳测试的条件为：聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度4%，分离胶浓度12%，厚度1mm，电压200v，染色液0.2%R250。得到的测试结果如图4所示。
由图4电泳结果可知，采用本申请制备方法制备的多肽分子量4.9kd到31kd的多组分肽类。
测试三、液相分析
对实施例4制备得到的磷虾多肽进行液相分析。液相分析测试条件：仪器：Agilent1200；色谱柱：Superdex TM Peptide 10×300mm GL（GE Healthcare）；流动相：0.2M氯化钠，0.1M 醋酸钠；检测波长：280nm；进样量：100µL；流速：0.6mL/min；压力：18bar；柱温：30℃。计算方法：面积百分比法。得到的测试结果如图5所示。
由图5可知，实施例4制备得到的磷虾多肽在16.098min-27.241min出峰时间内包含7种多肽类组分，其中在18.720min的组分含量约占60%，这与图4中分子量8.3kd的组分占比一致。
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种抑制血小板凝集的磷虾多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、先将脱脂南极磷虾粉加入纯化水搅拌均匀，然后加入蛋白酶进行一次酶解，之后灭酶，得到酶解液；
S2、将上述酶解液离心取上清液，然后进行过滤、超滤，得到滤出液，之后将滤出液进行浓缩，得到浓缩液；
S3、将上述浓缩液作为DEAE上样液进行离子交换层析，得到洗脱溶液，然后进行超滤脱盐、冷冻干燥，得到冻干品；
S4、将上述冻干品加入羧肽酶进行二次酶解，然后超滤除酶、超滤除氟脱盐、冷冻干燥，得到磷虾多肽；
所述步骤S1中一次酶解的过程为：先用摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.1-8.5，然后在温度为40℃、搅拌转速600-1000rpm的条件下酶解2-3h，所述蛋白酶为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase蛋白酶；灭酶的过程为：用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至3.5-4.5，升温至90-100℃后搅拌25-35min实现灭酶；
所述步骤S2中离心的过程为：待所述酶解液的温度降至40℃以下后，用摩尔浓度为1mol/L氢氧化钠调节pH至10-10.5，然后在4000rpm的条件下离心10min，取上清液；
所述步骤S2中过滤前用摩尔浓度为1mol/L盐酸调节pH至7.0-7.5，然后经滤布过滤得到过滤液；所述过滤液采用20-50kd的超滤膜超滤，超滤过程中不断添加摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液、pH 7.2超滤缓冲液至所述滤出液280纳米吸光度低于0.05时结束超滤，收集滤出液；所述滤出液经1-5kd的超滤膜浓缩，收集超滤浓缩液，调节所述超滤浓缩液的电导率低于20ms；
所述步骤S3中离子交换层析的层析介质为DEAE Sephadex A-50，平衡缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液；洗涤缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的氯化钠溶液；洗脱缓冲液为摩尔浓度为0.05mol/L的Tris-盐酸溶液和摩尔浓度为0.3mol/L的氯化钠溶液；
所述步骤S4中二次酶解前加入摩尔浓度为0.05mol/L的碳酸铵溶液，调节pH为8.0-8.5，然后加入0.2-0.5g羧肽酶A，在35-40℃的水浴锅中二次酶解20-40min，之后用15-40kd的超滤膜超滤，分多次加入摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液，收集滤出溶液，再用1-5kd的超滤膜浓缩，浓缩过程中不断添加纯化水脱盐，最后冷冻干燥制得磷虾多肽。
2.一种抑制血小板凝集的磷虾多肽，其特征在于，所述抑制血小板凝集的磷虾多肽采用如权利要求1所述的制备方法制得。
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