CN108220372A - 一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法 - Google Patents
一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，它是选用东海乌参作为原料，通过酸、碱和EDTA的浸泡，去除重金属和杂蛋白，获得胶原蛋白；在超声波辅助下，采用胶原蛋白酶酶解，获得胶原蛋白酶液，所述的胶原蛋白酶液中加入葡萄糖或蔗糖，调节pH=6—7，得到初始发酵液；在初始发酵液中加入就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌，密封发酵后获得发酵滤液；所述的发酵滤液经冷冻干燥或通过管式膜脱除大分子、并通过截留分级、浓缩脱盐、喷雾干燥得到东海乌参胶原蛋白肽；所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种用微波辅助微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，属于蛋白抗氧化肽生物制品制备技术领域。
背景技术
东海乌参（学名：白肛海地瓜Acaudina leucoprocta），盛产于东海海区，其体壁中含有丰富的胶原蛋白，具有极高的营养价值与药用价值。然而，由于其分子量很大，不利于肠胃和皮肤的吸收。
与胶原蛋白相比，胶原蛋白肽不仅有胶原蛋白的营养特性，而且还具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等生物活性。东海乌参胶原蛋白，其结构稳定，肌纤维丝排列紧密，一般蛋白酶对其水解效果较差。
乌参蛋白复杂的结构使蛋白质分子内部的某些基团，不能与酶活性部位接触，难以反应。根据东海乌参结构的特点，微波处理后，由于其暴露到蛋白质分子的表面上，从而变得可以反应了。因此，微波处理之后蛋白质的水解率可以得到提高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种原料来源广，成本低，制备工艺简单，可靠性好，收率高的用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，它是选用东海乌参作为原料，通过酸、碱和EDTA的浸泡，去除重金属和杂蛋白，获得胶原蛋白；在超声波辅助下，采用胶原蛋白酶酶解，获得胶原蛋白酶液，所述的胶原蛋白酶液中加入葡萄糖或蔗糖，调节pH=6—7，得到初始发酵液；在初始发酵液中加入就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌，密封发酵后获得发酵滤液；所述的发酵滤液经冷冻干燥或通过管式膜脱除大分子、并通过截留分级、浓缩脱盐、喷雾干燥得到东海乌参胶原蛋白肽；所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品。
作为优选：所述的膜分离为超滤：将胶原蛋白肽加入超滤系统，用超滤膜进行超滤；
所述的凝胶过滤采用G-25凝胶分离，超滤后的胶原蛋白肽用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取胶原蛋白肽溶液1.5ml过Sephadex G-25柱(90 cm ×115cm(ID))，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱；
所述的反相高效液相色谱( RT- HPLC)技术分离纯化是在如下色谱条件进行:
1) 胶原蛋白肽的前处理:将胶原蛋白肽用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心（12000-14000 RPM，离心10分钟）取上清；
2）系统: Agilent 1260 HPLC；
3）柱子: Zorbax SB-C18 4.6 X 250 5 um；
4）进样体积:80-10ul；
5）缓冲液和平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈；
6）梯度: 0%–0 % B洗脱4分钟，0%–8% B洗脱25分钟，8% -100%B洗脱1分钟，100% -100%B洗脱5分钟；
7）流速: 1.0 ml/min；
8）检测: 280 nm /214nm。
作为优选：所述的酸、碱和EDTA的浸泡是：将东海乌参清洗、打浆以及研磨细化处理后，先用EDTA浸泡液进行浸泡3—4天，然后过滤后加入乙酸进行提取1-3天，离心后合并上清液，加入添加剂静置20—40分钟后12000—14000r/min离心8—5分钟得到沉淀物，经盐析并透析后冻干得到东海乌参胶原蛋白；
所述的胶原蛋白酶酶解是：在东海乌参胶原蛋白中，依次分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸蛋白酶中的至少两种，并且分别在超声波辅助催化下分别酶解3—5h和1—3h；升温至110—20℃灭酶35—45分钟，得到胶原蛋白酶液；
所述的发酵滤液的获得是：在初始发酵液中加入就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的量为初始发酵液的体积百分数的3—5%，接种混合物在35—45℃、150—250rpm搅拌转速的条件下密封发酵3—6天，滤去残渣后获得发酵滤液；
将所述的发酵滤液中加入10—20%海藻糖、0.5—1%的麦芽湖精和1—5%甘油，在零下50—零下30℃温度下预冻2—5h，然后在零下70—零下60℃冷肼温度和小于150pa真空度下冷冻干燥10—5小时，直接得到胶原蛋白肽。
作为进一步优选：所述的胶原蛋白酶酶解是：在东海乌参胶原蛋白中，先加入东海乌参胶原蛋白重量的1—3%胃蛋白酶，在超声波辅助催化下酶解3—4h，再加入东海乌参胶原蛋白重量的0.5—2%丝氨酸蛋白酶，在超声波辅助催化下酶解1—2h；
所述的EDTA浸泡液为0.25—0.35M、pH7.6—7.9；所述的乙酸含量为0.6—1M；
所述的添加剂由5—7重量份食盐、5—10重量份果糖、4—8重量份盐酸硫铵素、10—16重量份谷氨酰胺以及10—14重量份丝氨酸组成，添加剂的加入量为上清液重量的11—14%；
所述的接种混合液中还加入有发酵种子培养基，加入量为初始发酵液的20—30%。
作为进一步优选：所述的发酵种子培养基的原料按以下重量份计：30份大豆蛋白胨、50份富硒酵母、60份天冬酰胺、55份蛋氨酸、5份牛肉粉、5份葡萄糖、1份氯化钠、0.1份磷酸二氢钾，1000份水；所述发酵种子培养基中在混合有就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌后，摇床160r/min，培养45—50h，发酵液中的芽孢杆菌大于108cfu/mL。
本发明利用来源于就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的微生物蛋白酶进行酶解，提高酶解效率；酶解过程以微波辅助，提高多肽收率；本发明以抗氧化为指标，通过膜过滤、凝胶过滤和高效液相色谱等分离技术，获得具有抗氧化活性的多肽。
本发明属于对现有技术的改进，它具有原料来源广，成本低，制备工艺简单，可靠性好，收率高等特点。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍：本发明所述的一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，它是选用东海乌参作为原料，通过酸、碱和EDTA的浸泡，去除重金属和杂蛋白，获得胶原蛋白；在超声波辅助下，采用胶原蛋白酶酶解，获得胶原蛋白酶液，所述的胶原蛋白酶液中加入葡萄糖或蔗糖，调节pH=6—7，得到初始发酵液；在初始发酵液中加入就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌，密封发酵后获得发酵滤液；所述的发酵滤液经冷冻干燥或通过管式膜脱除大分子、并通过截留分级、浓缩脱盐、喷雾干燥得到东海乌参胶原蛋白肽；所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品。
作为一种实施例，本发明所述的膜分离为超滤：将胶原蛋白肽加入超滤系统，用超滤膜进行超滤；
所述的凝胶过滤采用G-25凝胶分离，超滤后的胶原蛋白肽用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取胶原蛋白肽溶液1.5ml过Sephadex G-25柱(90 cm ×115cm(ID))，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱；
所述的反相高效液相色谱( RT- HPLC)技术分离纯化是在如下色谱条件进行:
1) 胶原蛋白肽的前处理:将胶原蛋白肽用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心（12000-14000 RPM，离心10分钟）取上清；
2）系统: Agilent 1260 HPLC；
3）柱子: Zorbax SB-C18 4.6 X 250 5 um；
4）进样体积:80-10ul；
5）缓冲液和平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈；
6）梯度: 0%–0 % B洗脱4分钟，0%–8% B洗脱25分钟，8% -100%B洗脱1分钟，100% -100%B洗脱5分钟；
7）流速: 1.0 ml/min；
8）检测: 280 nm /214nm。
作为另一种实施例，本发明所述的酸、碱和EDTA的浸泡是：将东海乌参清洗、打浆以及研磨细化处理后，先用EDTA浸泡液进行浸泡3—4天，然后过滤后加入乙酸进行提取1-3天，离心后合并上清液，加入添加剂静置20—40分钟后12000—14000r/min离心8—5分钟得到沉淀物，经盐析并透析后冻干得到东海乌参胶原蛋白；
所述的胶原蛋白酶酶解是：在东海乌参胶原蛋白中，依次分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸蛋白酶中的至少两种，并且分别在超声波辅助催化下分别酶解3—5h和1—3h；升温至110—20℃灭酶35—45分钟，得到胶原蛋白酶液；
所述的发酵滤液的获得是：在初始发酵液中加入就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的量为初始发酵液的体积百分数的3—5%，接种混合物在35—45℃、150—250rpm搅拌转速的条件下密封发酵3—6天，滤去残渣后获得发酵滤液；
将所述的发酵滤液中加入10—20%海藻糖、0.5—1%的麦芽湖精和1—5%甘油，在零下50—零下30℃温度下预冻2—5h，然后在零下70—零下60℃冷肼温度和小于150pa真空度下冷冻干燥10—5小时，直接得到胶原蛋白肽。
作为进一步实施例：本发明所述的胶原蛋白酶酶解是：在东海乌参胶原蛋白中，先加入东海乌参胶原蛋白重量的1—3%胃蛋白酶，在超声波辅助催化下酶解3—4h，再加入东海乌参胶原蛋白重量的0.5—2%丝氨酸蛋白酶，在超声波辅助催化下酶解1—2h；
所述的EDTA浸泡液为0.25—0.35M、pH7.6—7.9；所述的乙酸含量为0.6—1M；
所述的添加剂由5—7重量份食盐、5—10重量份果糖、4—8重量份盐酸硫铵素、10—16重量份谷氨酰胺以及10—14重量份丝氨酸组成，添加剂的加入量为上清液重量的11—14%；
所述的接种混合液中还加入有发酵种子培养基，加入量为初始发酵液的20—30%。
作为更进一步的实施例是：所述的发酵种子培养基的原料按以下重量份计：30份大豆蛋白胨、50份富硒酵母、60份天冬酰胺、55份蛋氨酸、5份牛肉粉、5份葡萄糖、1份氯化钠、0.1份磷酸二氢钾，1000份水；所述发酵种子培养基中在混合有就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌后，摇床160r/min，培养45—50h，发酵液中的芽孢杆菌大于108cfu/mL。
本发明的其它实施例，可以在上述多个实施例的基础上，通过任一数值替换以及常规技术手段的简单替换，能够获得无数个实施例，且本领域技术人员在了解本发明的基础上，能够方便地实施本发明。
Claims (5)
1.一种用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，它是选用东海乌参作为原料，通过酸、碱和EDTA的浸泡，去除重金属和杂蛋白，获得胶原蛋白；在超声波辅助下，采用胶原蛋白酶酶解，获得胶原蛋白酶液，其特征在于所述的胶原蛋白酶液中加入葡萄糖或蔗糖，调节pH=6—7，得到初始发酵液；在初始发酵液中加入就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌，密封发酵后获得发酵滤液；所述的发酵滤液经冷冻干燥或通过管式膜脱除大分子、并通过截留分级、浓缩脱盐、喷雾干燥得到东海乌参胶原蛋白肽；所述的胶原蛋白肽通过膜分离、凝胶过滤、反相高效液相色谱技术分离纯化并筛选后获得所述的胶原蛋白抗菌肽产品。
2.根据权利要求1所述的用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，其特征在于：
所述的膜分离为超滤：将胶原蛋白肽加入超滤系统，用超滤膜进行超滤；
所述的凝胶过滤采用G-25凝胶分离，超滤后的胶原蛋白肽用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，取胶原蛋白肽溶液1.5ml过Sephadex G-25柱(90 cm ×115cm(ID))，用蒸馏水为洗脱液，平衡和洗脱；
所述的反相高效液相色谱( RT- HPLC)技术分离纯化是在如下色谱条件进行:
1) 胶原蛋白肽的前处理:将胶原蛋白肽用0.06%TFA的水溶解到0.6ml，离心（12000-14000 RPM，离心10分钟）取上清；
2）系统: Agilent 1260 HPLC；
3）柱子: Zorbax SB-C18 4.6 X 250 5 um；
4）进样体积:80-10ul；
5）缓冲液和平衡缓冲液: 0.06%TFA洗脱缓冲液: 0.05%TFA的乙腈；
6）梯度: 0%–0 % B洗脱4分钟，0%–8% B洗脱25分钟，8% -100%B洗脱1分钟，100% -100%B洗脱5分钟；
7）流速: 1.0 ml/min；
8）检测: 280 nm /214nm。
3.根据权利要求1所述的用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，其特征在于：
所述的酸、碱和EDTA的浸泡是：将东海乌参清洗、打浆以及研磨细化处理后，先用EDTA浸泡液进行浸泡3—4天，然后过滤后加入乙酸进行提取1-3天，离心后合并上清液，加入添加剂静置20—40分钟后12000—14000r/min离心8—5分钟得到沉淀物，经盐析并透析后冻干得到东海乌参胶原蛋白；
所述的胶原蛋白酶酶解是：在东海乌参胶原蛋白中，依次分别加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、丝氨酸蛋白酶中的至少两种，并且分别在超声波辅助催化下分别酶解3—5h和1—3h；升温至110—20℃灭酶35—45分钟，得到胶原蛋白酶液；
所述的发酵滤液的获得是：在初始发酵液中加入就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌的量为初始发酵液的体积百分数的3—5%，接种混合物在35—45℃、150—250rpm搅拌转速的条件下密封发酵3—6天，滤去残渣后获得发酵滤液；
将所述的发酵滤液中加入10—20%海藻糖、0.5—1%的麦芽湖精和1—5%甘油，在零下50—零下30℃温度下预冻2—5h，然后在零下70—零下60℃冷肼温度和小于150pa真空度下冷冻干燥10—5小时，直接得到胶原蛋白肽。
4.根据权利要求3所述的用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，其特征在于：
所述的胶原蛋白酶酶解是：在东海乌参胶原蛋白中，先加入东海乌参胶原蛋白重量的1—3%胃蛋白酶，在超声波辅助催化下酶解3—4h，再加入东海乌参胶原蛋白重量的0.5—2%丝氨酸蛋白酶，在超声波辅助催化下酶解1—2h；
所述的EDTA浸泡液为0.25—0.35M、pH7.6—7.9；所述的乙酸含量为0.6—1M；
所述的添加剂由5—7重量份食盐、5—10重量份果糖、4—8重量份盐酸硫铵素、10—16重量份谷氨酰胺以及10—14重量份丝氨酸组成，添加剂的加入量为上清液重量的11—14%；
所述的接种混合液中还加入有发酵种子培养基，加入量为初始发酵液的20—30%。
5.根据权利要求4所述的用微生物蛋白酶酶解制备东海乌参胶原蛋白抗氧化肽方法，其特征在于：所述的发酵种子培养基的原料按以下重量份计：30份大豆蛋白胨、50份富硒酵母、60份天冬酰胺、55份蛋氨酸、5份牛肉粉、5份葡萄糖、1份氯化钠、0.1份磷酸二氢钾，1000份水；所述发酵种子培养基中在混合有就地堆肥地芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌后，摇床160r/min，培养45—50h，发酵液中的芽孢杆菌大于108cfu/mL。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN109457005A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-12 | 胜田(福清)食品有限公司 | 一种分步高效制备海参内脏抗氧化肽的制备方法 |
| CN113082192A (zh) * | 2021-04-29 | 2021-07-09 | 北京瀚梅生物科技有限公司 | 胶原蛋白与脂肪干细胞的组合物在制备药物或者化妆品中的用途 |
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