CN104593317B

CN104593317B - 一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂

Info

Publication number: CN104593317B
Application number: CN201310531178.4A
Authority: CN
Inventors: 蔡木易; 林峰; 刘艳; 张海欣; 谷瑞增; 鲁军; 魏颖
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date: 2013-10-31
Filing date: 2013-10-31
Publication date: 2018-05-04
Anticipated expiration: 2033-10-31
Also published as: CN104593317A

Abstract

本发明提供一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂，所述大豆活性肽添加剂中分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比≥90%，并且所述低聚肽至少包括YE、ERQ、QDPQ、EGGAH、PQGAR、AAGGSN中的一种或多种。本发明的大豆活性肽添加剂可以与多种基础培养基进行复配，用于对多种动物细胞进行无血清培养，其不仅大大降低了细胞培养基的成本，减少了动物源成分所带来的污染等问题，还能够促进细胞增殖，提高细胞活力以及增强细胞产物的表达。

Description

一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂

技术领域

本发明涉及一种细胞培养基添加剂，特别是涉及一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂。

背景技术

大豆分离蛋白是以低温脱溶大豆粕为原料生产的一种全价蛋白类食品添加剂，其蛋白质含量高达90%以上，氨基酸种类近20种，并含有人体必需氨基酸。大豆活性肽是大豆蛋白质经微生物发酵、酸解或酶解等方法经分离、精制而得到的肽类混合物，其以小分子肽为主，此外还含有少量大分子肽、游离氨基酸、糖类和无机盐等成分。大豆活性肽因其良好的营养特性、保健特性及加工特性被广泛应用于食品、医药、日用化工等领域。

动物细胞是蛋白、病毒的表达载体，细胞的生存状态直接影响其表达量及质量，而细胞的生长状况由培养基的质量直接决定，因此只有高质量的培养基才能筛选、驯化出优质的细胞。普通的细胞培养基中通常含有牛血清等动物源成分，然而血清存在安全性风险高、批间差异大、质量不稳定、成本高等问题，此外血清中还含有一些对细胞产生毒性的物质以及大分子蛋白，不仅影响细胞的生长，还会增加工业化生产中目的产物分离纯化的难度，因此含血清的细胞培养基并不适合用于动物细胞大规模培养及抗体、疫苗等生物制品的制备。

自2003年在荷兰召开的题为“改进体外培养技术，替代胎牛血清”的会议号召在全世界范围内减少血清的使用，在生物药制备、疫苗生产、细胞培养等领域，采用无血清培养基和无血清培养已成为当今细胞培养领域的一大趋势，而开发适用于动物细胞无血清培养的优质添加剂显得尤为重要，尤其是非动物源的细胞培养添加剂更加符合当前的发展方向。

以大豆蛋白为原料，采用生物酶水解制得的大豆活性肽来源于植物蛋白，因此避免了血清等动物性成分中潜在的病毒微生物污染等问题；其制备工艺易于控制，批次间质量稳定，有利于提高细胞产品生产的稳定性；此外其不含大分子蛋白，有利于细胞产品下游分离纯化。然而，由于大豆活性肽营养物质丰富，在其加工及储藏过程中易受细菌微生物污染，进而产生大量细菌内毒素，将其作为细胞培养添加剂使用时会改变细胞形态、破坏细胞膜结构、诱导细胞凋亡等，对体外培养的细胞生长产生不利影响。除此之外，由于不同的加工工艺对制备的大豆活性肽产品的组成具有较大影响，而动物血清成分较为复杂，很多成分至今尚不清楚，因此无法确定某种或某些成分的存在或者缺失是否会对细胞的生长产生不良影响，从而给大豆活性肽在无血清培养基添加剂上的应用造成一定的困难。

发明内容

本发明提供了一种大豆活性肽添加剂及其应用，该大豆活性肽内毒素含量低，在作为细胞培养基添加剂应用时，可与多种基础培养基进行复配，用于对多种细胞系进行无血清培养，并且还能促进细胞增殖，提高细胞活力以及增强细胞产物表达。

本发明还提供一种用于细胞培养基的大豆活性肽的制备方法，其操作简便，酶解效率高，并且可将小分子的活性肽与大分子蛋白、细菌内毒素及小分子盐类进行高效地分离，适合大规模工业化生产。

本发明提供的一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂，其中分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比≥90%，并且所述低聚肽至少包括YE、ERQ、QDPQ、EGGAH、PQGAR、AAGGSN中的一种或多种。

进一步地，所述低聚肽还包括STPH、VGPQ、DVR、GF中的一种或多种。

进一步地，所述大豆活性肽添加剂中内毒素的含量<200EU/g，特别是内毒素含量<50EU/g。

根据本发明提供的大豆活性肽添加剂，其是通过依次采用非特异性蛋白酶和特异性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解后，经分离纯化制得的。

本发明所述的非特异性蛋白酶指的是对所作用的底物的特异性低、具有较宽的底物特异性的一类蛋白酶，如碱性蛋白酶，其可水解多种蛋白质分子的肽链生成多肽或氨基酸；又如菠萝蛋白酶，其能分解多种蛋白质以及肽、脂和酰胺等。本发明所述的特异性蛋白酶指的是底物特异性相对严格、仅能作用于蛋白质分子中某些特定肽键的一类蛋白酶，如羧肽酶催化水解含羧基的末端氨基酸所形成的肽键等。

在本发明具体方案中，所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种，所述特异性蛋白酶选自羧肽酶、风味蛋白酶中的一种或两种；特别是，所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶中的两种或两种以上，所述特异性蛋白酶选自羧肽酶和风味蛋白酶。本发明先采用特异性蛋白酶对大豆蛋白进行酶解，然后采用非特异性蛋白酶对酶解产物进一步进行酶解，两者配合使用能够达到较高的酶解效率，并且酶解液中的活性肽、特别是小分子量的活性肽的含量高。

进一步地，所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～6000单位，其中包括0～1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000单位酶量的碱性蛋白酶、500～2000单位酶量的中性蛋白酶和0～1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的两种或多种；所述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～3000单位，其中包括500～2000单位酶量的羧肽酶和1000～2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种。在本发明中，各蛋白酶的酶活力单位定义为：在试验条件下，每分钟水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位；并且所述每克蛋白中的蛋白具体指的是大豆分离蛋白中的蛋白，即大豆分离蛋白中每含有1克蛋白时加入相应单位酶量的各蛋白酶。

采用本发明所述非特异性蛋白酶和特异性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解，可以产生多种分子量小于1000道尔顿的低聚肽，本领域技术人员可以根据现有技术中的常规技术手段从酶解液中分离纯化出所述低聚肽，例如离心、微滤、超滤等。在本发明具体方案中，所述分离纯化包括离心、微滤、阳离子交换、纳滤和超滤中的一种或多种；特别是，本发明所述分离纯化具体为：对酶解液依次进行离心、微滤、阳离子交换、纳滤和超滤，其中所述微滤采用孔径为50～500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截留分子量为100～300道尔顿的滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000～13000道尔顿的滤膜进行。

本发明还提供上述大豆活性肽添加剂在细胞无血清培养上的应用。

进一步地，所述细胞包括CHO细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。

本发明还提供上述大豆活性肽添加剂在促进细胞增殖、提高细胞活力和/或增强细胞产物表达上的应用。

进一步地，所述细胞选自CHO细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。

本发明还提供一种无血清培养基，包括上述任一所述的大豆活性肽添加剂，所述大豆活性肽添加剂在所述无血清培养基中的浓度为0.01～20g/L，优选为1～10g/L，进一步优选为2～4g/L。

本发明还提供上述任一所述的大豆活性肽添加剂的制备方法，包括如下步骤：

1）首先采用非特异性蛋白酶对大豆分离蛋白进行第一酶解处理，制得第一酶解液；然后采用特异性蛋白酶对所述第一酶解液进行第二酶解处理，制得大豆蛋白酶解液；

2）将所述大豆蛋白酶解液进行离心，依次对离心上清液进行微滤、阳离子交换、纳滤和超滤，制得大豆活性肽；其中所述微滤采用孔径为50～500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截留分子量为100～300道尔顿的滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000～13000道尔顿的滤膜进行。

根据本发明所提供的制备方法，所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～6000单位，其中包括0～1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000单位酶量的碱性蛋白酶、500～2000单位酶量的中性蛋白酶和0～1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的两种或多种；所述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～3000单位，其中包括500～2000单位酶量的羧肽酶和1000～2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种。本领域技术人员可以根据所采用的酶的组成来调节所述第一酶解处理和第二酶解处理的条件，如酶解温度和pH值等。

进一步地，所述步骤1）具体包括：将大豆分离蛋白与水混合制成蛋白溶液后，以每克蛋白2000～6000单位的酶量向所述蛋白溶液中加入所述非特异性蛋白酶，于40～60℃下第一酶解处理1.5～4.5小时，制得第一酶解液；再以每克蛋白2000～3000单位的酶量向所述第一酶解液中加入所述特异性蛋白酶，于40～60℃下第二酶解处理2～3小时后，灭酶，制得大豆蛋白酶解液。所述灭酶可以具体为：将第二酶解处理后的酶解液加热至85～130℃保温10～20min。

进一步地，在进行所述第一酶解处理之前还包括：将所述蛋白溶液加热至90～95℃并保温15～60min，使蛋白溶液中的蛋白变性，有利于后续的酶解处理。

根据本发明所提供的制备方法，步骤2）所述离心的转速为4000～12000r/min，所述离心可以采用碟式分离机进行。

根据本发明所提供的制备方法，步骤2）中所述微滤具体包括：先采用孔径为200～500nm的滤膜对所述离心上清液进行第一微滤，制得第一微滤液，然后采用孔径为50～200nm的滤膜对所述第一微滤液进行第二微滤，制得第二微滤液。

进一步地，所述第一微滤和第二微滤所采用的滤膜为陶瓷膜；操作压力（过膜压力）为10～30psi；所述第一微滤液和所述第二微滤液中蛋白质的含量为1～5%，本发明中所述蛋白质的含量为质量含量，如果所述蛋白质含量过低会增加微滤的时间，降低生产效率，而蛋白质含量过高则会增加滤膜的过滤负担，降低滤膜的使用寿命，发明人经研究发现，蛋白质含量在1～5%的范围内较为适合。此外，本发明采用两步陶瓷膜过滤，即依次进行初步过滤和深度过滤，初步过滤用于去除离心未除去的可溶性的大分子蛋白质，而深度过滤主要目的是进一步纯化，以去除杂蛋白等物质，两步过滤不仅可以提高过滤效率，而且过滤效果好。

根据本发明所提供的制备方法，步骤2）中所述阳离子交换可以具体包括：将阳离子交换树脂装入层析柱中，用蒸馏水清洗3～5倍柱体积后，将所述过滤液以0.5～3cm/min的线性流速加入到层析柱中，用蒸馏水清洗2～5倍柱体积，再用1M的NaCl溶液以1～5cm/min的线性流速进行洗脱，收集洗脱液，制得纯化液；其中，所述阳离子交换树脂可以为氢型阳离子交换树脂，例如D001型阳离子交换树脂，在本发明具体方案中采用D001-FD型阳离子交换树脂。本发明采用离子交换对上述过滤液进行进一步分离纯化，其可以将过滤液中的活性肽进一步与其它带弱电、带相反电荷、不带电的杂质（如淀粉等）进行有效地分离，从而更好地保证了活性肽产品的纯度及品质。

根据本发明所提供的制备方法，步骤2）中所述纳滤具体包括：采用截留分子量为100～300道尔顿的卷式膜将经所述阳离子交换后的离心上清液浓缩至蛋白质含量为5～10%后进行洗滤，使经洗滤后的离心上清液中无机盐的含量≤5%；再将经洗滤后的离心上清液浓缩至蛋白质含量为20～40%。发明人发现直接进行纳滤处理时效果较差，可能是由于纳滤膜孔径较小，容易被活性肽分子所堵塞，因此发明人在进行纳滤时加入了洗滤的步骤，并且经发明人研究发现，洗滤之前控制溶液中的蛋白质含量为5～10%时可以获得较好的纳滤效果。

根据本发明所提供的制备方法，步骤2）中所述超滤采用采用截留分子量为5000～13000道尔顿的卷式膜进行，其中操作压力为10～30psi，用以进一步去除处理液中的内毒素。

进一步地，在进行所述超滤之后还包括干燥，制得水分含量为1.5～5%的大豆活性肽。

本发明方案的实施，至少具有以下优势：

1、本发明的大豆活性肽中低聚肽含量高，并且内毒素含量低，其在作为细胞培养基添加剂应用时，可灵活地与多种基础培养基进行复配使用，并且无需额外添加血清，可用于对多种动物细胞进行无血清培养。

2、本发明的制备方法操作简便，酶解效率高，酶解液中小分子活性肽的含量高，此外其可将小分子活性肽与酶解液中的大分子蛋白、细菌内毒素及小分子盐类进行高效地分离，适合大规模工业化生产。

3、本发明的无血清培养基配制简便，成本低廉，其能用于培养多种细胞系，此外还能够促进细胞增殖，提高细胞活力以及增强细胞产物的表达。

附图说明

图1为实施例1大豆活性肽的高效液相色谱图；

图2为试验例1培养的CHO细胞的细胞密度图；

图3为试验例1培养的CHO细胞的抗体表达量图；

图4为试验例2培养的CHO细胞的细胞活力图；

图5为试验例3培养的Vero细胞的细胞密度图；

图6为试验例4培养的杂交瘤细胞的抗体表达量图；

图7为试验例5培养的HEK-293细胞的细胞活力图；

图8为试验例6培养的BHK-21细胞的细胞密度图；

图9为试验例7培养的MARC-145细胞的细胞密度图；

图10为试验例8培养的MDCK细胞的细胞活力图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、酶解处理

向蛋白质含量≥90%的大豆分离蛋白中加入12倍的去离子水，混合均匀后，升温至90℃，保温15～20分钟后，降温至50℃时，调节蛋白溶液的pH值至6.5～7.5，以每克蛋白质3500单位的酶量向所述蛋白溶液中加入由中性蛋白酶PROTAMEX（诺维信公司）和菠萝蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司）混合而成的复合非特异性蛋白酶（其中中性蛋白酶PROTAMEX和菠萝蛋白酶的酶量分别为2000单位和1500单位），于50℃下保温第一酶解处理4.5小时，制得第一酶解液；调节第一酶解液的pH值为7.5～8.5后，再以每克蛋白质2500单位的酶量向所述第一酶解液中加入由风味蛋白酶FLAVOURZYME500MG（诺维信公司）和羧肽酶ACCELERZYME CPG（DSM公司）混合而成的复合特异性蛋白酶（其中风味蛋白酶FLAVOURZYME500MG和羧肽酶ACCELERZYME CPG的酶量分别为1500单位和1000单位），于50℃下保温第二酶解处理2小时后，将酶解液加热到110～120℃，保温15～20min进行灭酶，制得大豆蛋白酶解液。

2、微滤

将大豆蛋白酶解液置入碟式分离机中，在4000～12000r/min的转速下进行离心，以对大豆蛋白酶解液进行液渣分离，收集离心上清液备用；

采用孔径为200～500nm的陶瓷膜对离心上清液进行第一微滤（初步滤清），控制第一微滤的时间为1～3h，操作压力为10～30psi，制得蛋白含量为1～5%的第一微滤液；

采用孔径为50～200nm的陶瓷膜对第一微滤液进行第二微滤（深度过滤），控制第二微滤的时间为1～3h，操作压力为10～30psi，制得蛋白含量为1～5%的第二微滤液。

3、阳离子交换

将食品行业专用的D001-FD型阳离子交换树脂（浙江争光实业股份有限公司）装入层析柱中，用蒸馏水清洗3～5倍柱体积后，将所述第二微滤液以0.5～3cm/min的线性流速加入到层析柱中，控制进样体积为层析柱体积的20～100%，用蒸馏水清洗2～5倍柱体积，再用1M的NaCl溶液以1～5cm/min的线性流速进行洗脱，收集洗脱液，制得纯化液。

4、纳滤、超滤

采用截留分子量为100～300道尔顿的卷式膜将所述纯化液浓缩至蛋白质含量为5～10%，然后加入蒸馏水进行洗滤，共洗滤初始体积的3～5倍，使经洗滤后的纯化液中无机盐的含量低于5%，再进一步将其浓缩至蛋白含量为20～40%时，收集浓缩液；

采用截留分子量为5000～13000道尔顿的卷式膜对所述浓缩液进行超滤，以去除浓缩液中的内毒素，制得内毒素含量低于50EU/g的大豆活性肽溶液。

5、干燥处理

将大豆活性肽溶液进行喷雾干燥，控制喷雾干燥净化空气进口温度为120～180℃，出口温度为65～90℃，制得水分含量为1.5%～5%的淡黄色粉末状大豆活性肽。

6、检测

采用常规方法对制得的大豆活性肽基础理化成分进行分析；采用申请号为200510103360.5的中国发明专利中所述方法对制得的大豆活性肽中各组分的分子量分布及氨基酸含量进行检测，结果分别见表1、表2和表3。

采用RP-HPLC（岛津LC-20A高效液相色谱仪，日本SHIMADZU公司）对制得的大豆活性肽进行分离后，采用Q-TOF2质谱仪（英国Micromass公司）对其主要组分进行一级结构鉴定，具体方法如下：

取上述制得的大豆活性肽样品1g，用流动相A定容至100mL，超声振荡10min使样品充分溶解混匀后，将其配制成0.1mg/mL的大豆活性肽溶液，用孔径为0.2μm的聚四氟乙烯过滤膜过滤后，进样；其中色谱条件为：流动相A：V（水）:V（三氟乙酸）=100:0.1；流动相B：V（乙腈）:V（水）:V（三氟乙酸）=80:20:0.1；检测波长：UV220nm；流速：0.6mL/min；柱温：32℃；进样体积：50μL；图1为制得的大豆活性肽的高效液相色谱图。

分管收集各个组分峰（至少收集图1中序号为1～6的组分峰），利用氮吹仪除去有机溶剂，冷冻干燥制成粉末后进行质谱检测，其中质谱条件为：离子化方式：纳升电喷雾正离子；雾化气体：N2；碰撞气体：Ar；源温：80℃；锥孔电压：50V；TOF加速电压：9.1kV；MCP检测器电压：2150V；毛细管电压：800V；MS和MS/MS的质量准确度：0.1Da；在一级质谱扫描得到ESI-MS质谱图后，从ESI-MS质谱图中选出待测离子，然后进行ESI-MS/MS分析，质谱图经质谱仪的MaxEnt3转换后，由Peptide Sequencing推导出肽段序列，大豆活性肽主要组分的一级结构如表4所示。

由表1～3结果可知：本实施例制得的大豆活性肽中总蛋白含量达到94%以上，其中分子量在1000Da以下的低聚肽占总蛋白的质量百分比达到93%以上，并且富含19种氨基酸。由表4结果可知：大豆活性肽中含有二肽、三肽、四肽、五肽和六肽，其中以二肽、三肽、四肽为主，其主要成分包括：QDPQ、ERQ、STPH、EGGAH、VGPQ、DVR、GF等，并且从大豆活性肽中首次鉴定出的肽包括YE（分子量310.31Da）、ERQ（分子量431.50Da）、QDPQ（分子量486.48Da）、EGGAH（分子量469.45Da）、PQGAR（分子量527.58Da）、AAGGSN（分子量475.46Da）。

实施例2

除酶解处理具体为：向蛋白质含量≥90%的大豆分离蛋白中加入9倍的去离子水，混合均匀后，升温至90～95℃，保温55～60分钟后，降温至50～55℃时，调节蛋白溶液的pH值为7～8，以每克蛋白质3000单位的酶量向所述蛋白溶液中加入由木瓜蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司）和碱性蛋白酶ALKALINE PROTEASE CONCENTRATE（DSM公司）混合而成的复合非特异性蛋白酶（其中木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶ALKALINE PROTEASECONCENTRATE的酶量分别为1000单位和2000单位），于50～55℃下保温第一酶解处理2.5小时，制得第一酶解液；调节第一酶解液的pH值为8～9后，再以每克蛋白质2000单位的酶量向所述第一酶解液中加入由风味蛋白酶FLAVOURZYME500MG（诺维信公司）和羧肽酶Validase FP Conc.（DSM公司）混合而成的复合特异性蛋白酶（其中风味蛋白酶FLAVOURZYME500MG和羧肽酶ValidaseFP Conc.的酶量均为1000单位），于50～55℃下保温第二酶解处理3小时后，将酶解液加热到90～100℃，保温15～20min进行灭酶，制得大豆蛋白酶解液外，其它同实施例1，制得水分含量为1.5%～5%的淡黄色粉末状大豆活性肽。

经检测，本实施例制得的大豆活性肽中分子量在1000Da以下的低聚肽占总蛋白的质量百分比达到92%以上，内毒素含量低于50EU/g，其富含表3中的19种氨基酸，此外还含有表4中的18种一级结构的多肽，基础理化成分及各组分的分子量分布结果分别见表1和表2。

实施例3

除酶解处理具体为：向蛋白质含量≥90%的大豆分离蛋白中加入10倍的去离子水，混合均匀后，升温至95℃，保温35～40分钟后，降温至45～50℃时，调节蛋白溶液的pH值为7～8，并以每克蛋白质4500单位的酶量向所述蛋白溶液中加入由木瓜蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司）、菠萝蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司）和碱性蛋白酶Novozym37071（诺维信公司）混合而成的复合非特异性蛋白酶（其中木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶的酶量分别为1000单位、1500单位和2000单位），于45～50℃下保温第一酶解处理3.5小时，制得第一酶解液；再以每克蛋白质3000单位的酶量向所述第一酶解液中加入由羧肽酶Validase FP Conc.（DSM公司）和风味蛋白酶MAXZPRO XF（DSM公司）组成的复合特异性蛋白酶（羧肽酶Validase FP Conc.和风味蛋白酶MAXZPRO XF的酶量均为1500单位），于45～50℃下保温第二酶解处理2小时后，将酶解液加热到120～130℃，保温10～15min进行灭酶，制得大豆蛋白酶解液外，其它同实施例1，制得水分含量为1.5%～5%的淡黄色粉末状大豆活性肽。

表1本发明大豆活性肽的基础理化成分

项目	实施例1	实施例2	实施例3
				总蛋白质（干基，%）	94.13±0.53	92.33±0.33	93.25±0.43
脂肪（%）	0.04±0.01	0.06±0.02	0.05±0.02
				灰分（%）	2.30±0.26	3.30±0.19	2.96±0.26
水分（%）	2.90±0.19	3.00±0.20	3.02±0.15

表2本发明大豆活性肽的分子量分布

分子量范围	实施例1	实施例2	实施例3
				10000Da以上（%）	0.05±0.01	0.06±0.01	0.04±0.01
3000-10000Da（%）	0.16±0.02	0.20±0.03	0.23±0.01
				1000-3000Da（%）	6.42±0.15	7.33±0.18	7.63±0.11
500-1000Da（%）	29.54±0.55	30.66±0.33	32.36±0.40
				140-500Da（%）	60.70±0.72	59.45±0.63	57.76±0.69
140Da以下（%）	3.13±0.20	2.30±0.12	1.98±0.19
				1000Da以下	93.37±0.89	92.41±0.96	92.10±0.75

表3实施例1大豆活性肽的氨基酸含量

氨基酸名称（缩写/代号）	含量（g/100g）	氨基酸名称	含量（g/100g）
				天冬氨酸（Asp/D）	4.36±0.05	亮氨酸（Leu/L）	21.72±0.09
苏氨酸（Thr/T）	1.90±0.03	酪氨酸（Tyr/Y）	4.26±0.10
				丝氨酸（Ser/S）	1.75±0.02	苯丙氨酸（Phe/F）	8.06±0.07
总谷氨酸（Gln/Q+Glu/E）	5.11±0.07	赖氨酸（Lys/K）	9.22±0.11
				甘氨酸（Gly/G）	3.87±0.05	组氨酸（His/H）	1.59±0.04
丙氨酸（Ala/A）	3.12±0.04	精氨酸（Arg/R）	2.41±0.07
				缬氨酸（Val/P）	11.24±0.08	脯氨酸（Pro/P）	0.47±0.05
甲硫氨酸（Met）	4.28±0.05	半胱氨酸（Cys/C）	1.05±0.05

异亮氨酸（Ile/I）	8.10±0.08	色氨酸（Trp/W）	0.08±0.02
				总量	92.59±1.42

表4实施例1大豆活性肽主要组分的一级结构

序号	序列	分子量	序号	序列	分子量
						1	QDPQ	486.48	10	AAGGSN	475.46
2	ERQ	431.50	11	DVTR	489.53
						3	STPH	440.46	12	DYR	452.47
4	EGGAH	469.45	13	LEE	389.40
						5	VGPQ	399.45	14	PQLR	512.61
6	DVR	388.42	15	EGL	317.34
						7	YE	310.31	16	DSSE	436.38
8	GF	222.24	17	QPGGH	496.51
						9	PQGAR	527.58	18	TPE	345.35

对照例1

按照申请号为200510103360.5的中国发明专利中所述方法制备的大豆低聚肽粉作为对照例1，其具体包括：

向蛋白质含量≥90%的大豆分离蛋白中加入12倍的去离子水，混合均匀后，调pH值至7.0～9.0，加入大豆分离蛋白重量2%的复合蛋白酶（市售），于40～60℃酶解处理6小时，将酶解液在135℃加热15s进行灭酶，制得大豆蛋白酶解液；将大豆蛋白酶解液置入碟式分离机中，在4000～12000r/min的转速下进行离心，以对大豆蛋白酶解液进行液渣分离，收集离心上清液，用孔径为0.1～0.5um的陶瓷膜对离心上清液进行过滤分离，收集透过液后，采用截留分子量为10000道尔顿的中空纤维膜对所述透过液进行过滤，收集透过液并浓缩至固形物含量为30～40%，再用活性碳脱色去苦，经喷雾干燥，制得大豆低聚肽粉，经检测，大豆低聚肽粉中分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比为82.6%，细菌内毒素的含量＞2000EU/g。

试验例1

1、无血清培养基配制

分别将实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽与DMEM/F12（体积比1：1）培养基分别用无热原的超纯水溶解，配制浓度为常规浓度的4倍；分别将配制的肽溶液与DMEM/F12培养基进行混合，并加超纯水至最终体积的95%，调整pH到7.2～7.3，定容至最终体积，用0.22μm滤膜除菌，制得相应的无血清培养基，其中实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽在其各自的无血清培养基的浓度均为2g/L，其分别作为试验组1～3和对照组，同时以不添加大豆活性肽的DMEM/F12培养基作为空白组。

2、细胞培养

向2L生物反应器中分别加入上述试验组1～3、对照组和空白组的培养基，并将活力高于95%的CHO细胞接种于反应器中进行悬浮培养，其中培养条件为：37℃，5%二氧化碳；定时取样，并采用流式细胞术和反相高效液相色谱进行细胞密度、抗体表达量的检测，结果见图2、图3。

如图2和图3所示，相对于对照组和空白组，试验组1～3的培养基在相同的培养时间内可以获得更高的细胞密度以及抗体表达量；特别是，细胞在培养至第4天时，试验组1～3的细胞密度分别为空白组的151%、148%、134%，而对照组的细胞密度仅为空白组的114%；细胞在培养至第6天时，试验组1～3的细胞抗体表达量分别为空白组的116%、116%、117%，而对照组的细胞抗体表达量仅为空白组的108%。由此说明：本发明实施例1～3制得的大豆活性肽在作为细胞培养基添加剂使用时细胞生长状态良好，其可为CHO细胞提供全面的营养，并且部分成分的肽还可能作为细胞生长代谢的功能因子，有利于促进细胞增殖及增强细胞产物表达。本发明采用大豆蛋白酶解产物制备细胞培养基添加剂，其成本远远低于使用血清；并且此培养基添加剂来源于植物成分，安全性高。

试验例2

1、无血清培养基配制

分别将实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽与IMDM基础培养基分别用无热原的超纯水溶解，配制浓度为常规浓度的4倍；分别将配制的肽溶液与IMDM基础培养基进行混合，并加超纯水至最终体积的95%，调整pH到7.2～7.3，定容至最终体积，用0.22μm滤膜除菌，制得相应的无血清培养基，其中实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽在其各自的无血清培养基的浓度均为4g/L，其分别作为试验组1～3和对照组，同时以不添加大豆活性肽的IMDM基础培养基作为空白组。

2、细胞培养

向摇瓶中分别加入上述试验组1～3、对照组和空白组的培养基，将生长状况良好的CHO细胞接种于摇瓶中进行培养，培养条件为：37℃，5%二氧化碳，摇瓶转速为100rpm；定时取样，采用流式细胞术AO/PI染色法及ELISA法进行细胞活力及抗体表达量的检测，结果见图4。

如图4所示，相对于对照组和空白组，试验组1～3的培养基在相同的培养时间内可以获得更高的细胞活力，特别是在培养至第10天时，试验组1～3的细胞活力分别为80%、79%、77%，对照组的细胞活力为69%，空白组的细胞活力显著下降，仅为43%；此外，试验组1～3的抗体表达量相对空白组分别增加了33%、29%、31%，而对照组的抗体表达量相对空白组仅增加了9%。由此说明：本发明实施例1～3制得的大豆活性肽可为CHO细胞提供全面的营养，并且在一定程度上解决细胞因缺乏血清而造成的过早死亡及形态不饱和等问题，从而有利于提高细胞的活力及增强细胞产物表达。

试验例3

1、无血清培养基配制

分别将实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽与DMEM（高糖）培养基分别用无热原的超纯水溶解，配制浓度为常规浓度的4倍；分别将配制的肽溶液与DMEM（高糖）培养基进行混合，并加超纯水至最终体积的95%，调整pH到7.2～7.3，定容至最终体积，用0.22μm滤膜除菌，制得相应的无血清培养基，其中实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽在其各自的无血清培养基的浓度均为0.1g/L，其分别作为试验组1～3和对照组，同时以不添加大豆活性肽的DMEM（高糖）培养基作为空白组。

2、细胞培养

向细胞培养板中分别加入上述试验组1～3、对照组和空白组的培养基，并将活力高于95%的非洲绿猴肾细胞（Vero）接种于细胞培养板中进行培养，培养条件为：37℃，5%二氧化碳；培养24h后，采用MTT法进行细胞密度检测，结果见图5。

如图5所示，试验组1～3的Vero细胞增殖迅速、代谢旺盛，其细胞密度分别为空白组的120.0%、120.4%、119.8%，而对照组的Vero细胞密度仅为空白组的106.0%，说明添加有本发明大豆活性肽添加剂的培养基在用于培养Vero细胞时，在相同的培养时间内可以获得更高的细胞密度。

试验例4

分别将实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽与DMEM/F12（体积比1：1）培养基分别用无热原的超纯水溶解，配制浓度为常规浓度的4倍；分别将配制的肽溶液与DMEM/F12培养基进行混合，并适量添加维生素、脂肪酸、微量元素，然后加超纯水至最终体积的95%，调整pH到7.2～7.3，定容至最终体积，用0.22μm滤膜除菌，制得相应的无血清培养基，其中实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽在其各自的无血清培养基的浓度均为5g/L，其分别作为试验组1～3和对照组，同时以向DMEM/F12培养基中添加相同量的维生素、脂肪酸、微量元素作为空白组。

向2L生物反应器中分别加入上述试验组1～3、对照组和空白组的培养基，并将活力高于95%的杂交瘤细胞接种于反应器中进行悬浮培养，其中培养条件为：工作体积1L，溶氧（DO）控制在50%饱和空气浓度，接种密度2.5×10⁵cells/mL，温度37℃，搅拌速度90rpm；在培养6天后收获抗体，并采用ELISA方法进行抗体表达量的检测，结果见图6。

如图6所示，试验组1～3抗体表达量相对空白组分别增加了42%、38%、29%，而对照组抗体表达量相对空白组仅增加了8%，说明添加本发明大豆活性肽的培养基在用于培养杂交瘤细胞时，在相同的培养时间内可以获得更高的抗体表达量。

试验例5

分别将实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽与MEM培养基分别用无热原的超纯水溶解，配制浓度为常规浓度的4倍；分别将配制的肽溶液与MEM培养基进行混合，并适量添加维生素、脂肪酸、微量元素，然后加超纯水至最终体积的95%，调整pH到7.2～7.3，定容至最终体积，用0.22μm滤膜除菌，制得相应的无血清培养基，其中实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽在其各自的无血清培养基的浓度均为7g/L，其分别作为试验组1～3和对照组，同时以MEM培养基添加相同量的维生素、脂肪酸、微量元素作为空白组。

向2L生物反应器中分别加入上述试验组1～3、对照组和空白组的培养基，并将活力高于95%的HEK-293细胞接种于反应器中进行悬浮培养，其中培养条件为：工作体积1L，溶氧（DO）控制在50%饱和空气浓度，接种密度2.0×10⁵cells/mL，温度37℃，搅拌速度80rpm；定时取样，并采用AO/PI染色法进行细胞活力的检测，结果见图7。

如图7所示，相对于对照组和空白组，试验组1～3的培养基所培养的HEK-293细胞在相同的培养时间内具有更高的细胞活力，说明本发明的大豆活性肽添加剂可以显著提高HEK-293细胞的活力。

试验例6

分别将实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽与DMEM（低糖）培养基分别用无热原的超纯水溶解，配制浓度为常规浓度的4倍；分别将配制的肽溶液与DMEM（低糖）培养基进行混合，并适量添加维生素、脂肪酸、微量元素，然后加超纯水至最终体积的95%，调整pH到7.0～7.2，定容至最终体积，用0.22μm滤膜除菌，制得相应的无血清培养基，其中实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽在其各自的无血清培养基的浓度均为3g/L，其分别作为试验组1～3和对照组，同时以DMEM（低糖）培养基添加相同量的维生素、脂肪酸、微量元素作为空白组。

向150ml摇瓶中分别加入上述试验组1～3、对照组和空白组的培养基，并将活力高于95%的BHK-21细胞接种于摇瓶中进行悬浮培养，其中培养条件为：工作体积40mL，接种密度为3.0×10⁵cells/mL，温度37℃，搅拌速度100rpm；定时取样，并采用细胞计数仪进行细胞密度的检测，结果见图8。

如图8所示，试验组1～3的细胞密度分别为空白组的125%、129%、123%，而对照组的细胞密度仅为空白组的107%，说明添加本发明大豆活性肽添加剂的培养基在用于培养BHK-21细胞时可以显著地提高其细胞密度，促进其增殖。

试验例7

分别将实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽与MEM培养基分别用无热原的超纯水溶解，配制浓度为常规浓度的4倍；分别将配制的肽溶液与MEM培养基进行混合，并适量添加维生素、脂肪酸、微量元素、乙醇胺、抗氧化剂，然后加超纯水至最终体积的95%，调整pH到7.0～7.2，定容至最终体积，用0.22μm滤膜除菌，制得相应的无血清培养基，其中实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽在其各自的无血清培养基的浓度均为6.5g/L，其分别作为试验组1～3和对照组，同时以MEM培养基添加相同量的维生素、脂肪酸、微量元素、乙醇胺、抗氧化剂作为空白组。

向2L生物反应器中分别加入上述试验组1～3、对照组和空白组的培养基，并将活力高于95%的MARC-145细胞接种于反应器中进行悬浮培养，其中培养条件为：工作体积1L，接种密度为2.0×10⁵cells/mL，溶氧（DO）控制在50%饱和空气浓度，温度37℃，搅拌速度80rpm；定时取样，并采用细胞计数仪进行细胞密度的检测，结果见图9。

如图9所示，相对于对照组和空白组，试验组1～3的培养基所培养的MARC-145细胞在相同的培养时间内具有更高的细胞密度，说明本发明的大豆活性肽添加剂有利于促进MARC-145细胞增殖。

试验例8

分别将实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽与DMEM（高糖）培养基分别用无热原的超纯水溶解，配制浓度为常规浓度的4倍；分别将配制的大豆活性肽溶液与DMEM（高糖）培养基溶液进行混合，并适量添加维生素、脂肪酸、微量元素，然后加超纯水至最终体积的95%，调整pH到7.0～7.2，定容至最终体积，用0.22μm滤膜除菌，制得相应的无血清培养基，其中实施例1～3的大豆活性肽和对照例1的大豆低聚肽在其各自的无血清培养基的浓度均为2.5g/L，其分别作为试验组1～3和对照组，同时以DMEM（高糖）培养基添加相同量的维生素、脂肪酸、微量元素作为空白组。

向150ml摇瓶中分别加入上述试验组1～3、对照组和空白组的培养基，并将活力高于95%的MDCK细胞接种于摇瓶中进行悬浮培养，其中培养条件为：工作体积40mL，接种密度为3.0×10⁵cells/mL，温度37℃，搅拌速度110rpm；定时取样，并采用AO/PI染色法进行细胞活力的检测，结果见图10。

如图10所示，相对于对照组和空白组，试验组1～3的培养基所培养的MDCK细胞在相同的培养时间内具有更高的细胞活力，说明本发明的大豆活性肽添加剂能够显著提高MDCK细胞的活力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种用于细胞培养基的大豆活性肽添加剂，其特征在于，所述大豆活性肽添加剂中分子量小于1000道尔顿的低聚肽占总蛋白的质量百分比≥90%，并且所述低聚肽至少包括YE、ERQ、QDPQ、EGGAH、PQGAR和AAGGSN；

所述大豆活性肽添加剂是通过依次采用非特异性蛋白酶和特异性蛋白酶对大豆分离蛋白进行酶解后，经分离纯化制得的；其中，所述非特异性蛋白酶选自木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和菠萝蛋白酶中的一种或多种，所述特异性蛋白酶选自羧肽酶、风味蛋白酶中的一种或两种；

所述的大豆活性肽添加剂的制备方法，具体包括如下步骤：

2）将所述大豆蛋白酶解液进行离心，依次对离心上清液进行微滤、阳离子交换、纳滤和超滤，制得大豆活性肽；其中所述微滤采用孔径为50～500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截留分子量为100～300道尔顿的滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000～13000道尔顿的滤膜进行；

所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～6000单位，其中包括0～1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000单位酶量的碱性蛋白酶、500～2000单位酶量的中性蛋白酶和0～1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的两种或多种；所述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～3000单位，其中包括500～2000单位酶量的羧肽酶和1000～2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种；

所述步骤1）具体包括：将大豆分离蛋白与水混合制成蛋白溶液后，以每克蛋白2000～6000单位的酶量向所述蛋白溶液中加入所述非特异性蛋白酶，于40～60℃下第一酶解处理1.5～4.5小时，制得第一酶解液；再以每克蛋白2000～3000单位的酶量向所述第一酶解液中加入所述特异性蛋白酶，于40～60℃下第二酶解处理2～3小时后，灭酶，制得大豆蛋白酶解液；

步骤2）中所述微滤具体包括：先采用孔径为200～500nm的滤膜对所述离心上清液进行第一微滤，制得第一微滤液，然后采用孔径为50～200nm的滤膜对所述第一微滤液进行第二微滤，制得第二微滤液；

步骤2）中所述纳滤具体包括：采用截留分子量为100～300道尔顿的卷式膜将经阳离子交换后的离心上清液浓缩至蛋白质含量为5～10%后进行洗滤，使经洗滤后的离心上清液中无机盐的含量≤5%；再将经洗滤后的离心上清液浓缩至蛋白质含量为20～40%。

2.根据权利要求1所述的大豆活性肽添加剂，其特征在于，所述低聚肽还包括STPH、VGPQ、DVR、GF中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的大豆活性肽添加剂，其特征在于，所述大豆活性肽添加剂中内毒素的含量<200EU/g。

4.权利要求1至3中任一权利要求所述的大豆活性肽添加剂在细胞无血清培养上的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞包括CHO细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。

6.权利要求1至3中任一权利要求所述的大豆活性肽添加剂在促进细胞增殖、提高细胞活力和/或增强细胞产物表达上的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞包括CHO细胞、Vero细胞、HEK-293细胞、BHK-21细胞、MARC-145细胞、杂交瘤细胞、MDCK细胞中的一种或多种。

8.一种无血清培养基，其特征在于，包括权利要求1至3中任一权利要求所述的大豆活性肽添加剂，所述大豆活性肽添加剂在所述无血清培养基中的浓度为0.01～20g/L。

9.权利要求1至3中任一权利要求所述的大豆活性肽添加剂的制备方法，包括如下步骤：

2）将所述大豆蛋白酶解液进行离心，依次对离心上清液进行微滤、阳离子交换、纳滤和超滤，制得大豆活性肽；其中所述微滤采用孔径为50～500nm的滤膜进行，所述纳滤采用截留分子量为100～300道尔顿的滤膜进行，所述超滤采用截留分子量为5000～13000道尔顿的滤膜进行；所述非特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～6000单位，其中包括0～1000单位酶量的木瓜蛋白酶、500～2000单位酶量的碱性蛋白酶、500～2000单位酶量的中性蛋白酶和0～1500单位酶量的菠萝蛋白酶中的两种或多种；所述特异性蛋白酶的酶量为每克蛋白2000～3000单位，其中包括500～2000单位酶量的羧肽酶和1000～2000单位酶量的风味蛋白酶中的一种或两种；所述步骤1）具体包括：将大豆分离蛋白与水混合制成蛋白溶液后，以每克蛋白2000～6000单位的酶量向所述蛋白溶液中加入所述非特异性蛋白酶，于40～60℃下第一酶解处理1.5～4.5小时，制得第一酶解液；再以每克蛋白2000～3000单位的酶量向所述第一酶解液中加入所述特异性蛋白酶，于40～60℃下第二酶解处理2～3小时后，灭酶，制得大豆蛋白酶解液；步骤2）中所述微滤具体包括：先采用孔径为200～500nm的滤膜对所述离心上清液进行第一微滤，制得第一微滤液，然后采用孔径为50～200nm的滤膜对所述第一微滤液进行第二微滤，制得第二微滤液；步骤2）中所述纳滤具体包括：采用截留分子量为100～300道尔顿的卷式膜将经阳离子交换后的离心上清液浓缩至蛋白质含量为5～10%后进行洗滤，使经洗滤后的离心上清液中无机盐的含量≤5%；再将经洗滤后的离心上清液浓缩至蛋白质含量为20～40%。