CN105586311B - 一种用于培养人脂肪干细胞的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了ー种用于培养人脂肪干细胞的培养基，该培养基由如下组分组成：DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、还原型谷胱甘肽、亚油酸、青霉素，链霉素，L‑谷氨酰胺，碱性成纤维细胞生长因子，维生素C和植物提取多肽组成。本发明的培养基具有培养速度，细胞保持较好的完整性和活性。该培养基能够用于大规模的细胞培养，成本低廉方便配制。

Description

一种用于培养人脂肪干细胞的培养基
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人脂肪干细胞的培养基。
背景技术
脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细胞的特点。人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖1倍。多次传代(10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15%。
由于人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周以上，达到一定的数量需要3周左右。人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能。所以为保证实验的连续性，必须随时提供大量的实验或组织工程用的种子细胞。因此，对于细胞培养基的需求非常强烈。
目前常用的ADSCs培养是利用饲养层细胞与采用含10%胎牛血清的培养基进行培养。这种培养干细胞方法的缺点是方法复杂，提取的干细胞数量少，纯度不高，继代增殖缓慢，更要紧的是使用饲养层细胞和动物血清容易导致干细胞污染，特别是动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒将对人体健康构成极大地风险，这样培养出的干细胞不适于直接应用于临床。因此，开发一种合适的有效的培养基变得迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供一种人脂肪干细胞培养基，克服使用血清制备细胞培养基的缺点和风险。大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵,是构成动物细胞培养生产成本的主要部分之一。
本发明提供一种特别适合于人脂肪干细胞培养基，该培养基由如下组分组成：DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、还原型谷胱甘肽、亚油酸、青霉素，链霉素，L-谷氨酰胺，碱性成纤维细胞生长因子，维生素 C和植物提取多肽组成。
其中，各组分的具体用量分别为青霉素100IU/ml，链霉素100μ g/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子l0ng/ml，维生素 C 50μ g/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL、还原型谷胱甘肽浓度为10μg/mL、亚油酸浓度为5μg/mL，植物提取多肽30μg/ml。
本发明另外提供一种培养人脂肪干细胞的方法，包括将人脂肪干细胞加入到所述的人脂肪干细胞培养基进行培养的步骤。
本发明另外提供一种获得植物多肽，该多肽从天然植物川西喜冬草中提取，川西喜冬草常绿小草本状半灌木，其叶片稍肥厚有光泽，申请人推测其就有较强的耐逆和抗旱抗氧化的功效。申请人通过分离该植物叶片通过制备蛋白库功能分析发现，该植物提取的多肽具有稳定人脂肪干细胞，促进干细胞生长，保持干细胞正常生长状态的功效。
本发明另外提供一种获得植物多肽的方法，(1)将川西喜冬草叶片清洗干净，绞碎，榨汁，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，加酶量15000IU/g叶片，酶解温度45°C，pH值7.0，酶解时间2h，酶解完成后92°C灭酶13min ；(2)灭酶后的物料过滤除去不溶物，得到溶液，所得多肽溶液加入4%活性炭吸附脱色，用葡聚糖G-50(Sephadex G-50)进行多肽分离，20mmol/LHCl溶液洗脱，流速1.3mL/分钟，分别收集不同时间段的洗脱产物，调节溶液至pH7.0，10000转/分钟离心15分钟，经大孔树脂DA201-C脱盐处理后，真空浓缩，上清液冷冻干燥备用；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，回收小分子量的条带，其中经过功能验证，共得到27个小肽的序列具有促进细胞生长的功能。根据色谱柱中不同的峰值分离时间，可以批量获得相应的小肽，也可人工合成所述的多肽。所述多肽的序列如SEQ ID NO：1-27所示。分别命名为CXXDC-1~27。
该培养基提供结合蛋白、多肽类物质、维生素参与细胞代谢，可以起到供应营养、中和、解毒的效果。该培养基不含动物血清，不含动物血清内潜在动物源性内毒素或病毒，方便应用于临床。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器试剂皆可通过商业途径获得。
实施例1:不加多肽的培养基配制
1)制备预定量1000mL,取900mL高糖型DMEM细胞培养液(厂家:Sigma)，加入青霉素100IU/ml，链霉素100μ g/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子l0ng/ml，维生素 C 50μ g/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL、还原型谷胱甘肽10μg/mL、亚油酸5μg/mL。
2)调 pH 值:用 5% NaHCO3 调节 pH 到 7.0，用DMEM细胞培养液定容到1000ml。
3)过滤除菌:采用0.45um和0.22um滤膜各一张,上层为0.45um,下层为0.22um,以保证过滤效果。
实施例2 多肽的提取
将川西喜冬草叶片清洗干净，绞碎，榨汁，加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，加酶量15000IU/g叶片，酶解温度45°C，pH值7.0，酶解时间2h，酶解完成后92°C灭酶13min ；灭酶后的物料过滤除去不溶物，得到溶液，所得多肽溶液加入4%活性炭吸附脱色，用葡聚糖G-50(Sephadex G-50)进行多肽分离，20mmol/L HCl溶液洗脱，流速1.3mL/分钟，分别收集不同时间段的洗脱产物，调节溶液至pH7.0，10000转/分钟离心15分钟，经大孔树脂DA201-C脱盐处理后，真空浓缩，上清液冷冻干燥备用；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，回收小分子量的条带，其中经过功能验证，共得到27个小肽的序列具有稳定人脂肪干细胞，促进干细胞生长，保持干细胞正常生长状态的功效。根据色谱柱中不同的峰值分离时间，可以批量获得相应的小肽，也可人工合成所述的多肽。所述多肽的序列如SEQ ID NO：1-27所示。分别命名为CXXDC-1~27。
实施例3 含有多肽的培养基的配制
1)制备预定量1000mL,取900mL高糖型DMEM细胞培养液(厂家:Sigma)，加入青霉素100IU/ml，链霉素100μ g/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子l0ng/ml，维生素 C 50μ g/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL、还原型谷胱甘肽10μg/mL、亚油酸5μg/mL，CXXDC-1多肽30μg/ml。
2)调 pH 值:用 5% NaHCO3 调节 pH 到 7.0，用DMEM细胞培养液定容到1000ml。
3)过滤除菌:采用0.45um和0.22um滤膜各一张,上层为0.45um,下层为0.22um。制备得到的培养基为CXXDC-1培养基。
按照上述相同的方法，分别制备CXXDC-2~27的培养基。
实施例4 本发明培养基与常规有血清培养基培养与效果的比较
将1 X 106个的脂肪干细胞分别接种到30组盛有不同的培养基的直径100mm培养皿中，每组10个培养皿，混匀；其中第一组-第27组分别有10个培养皿，加入CXXDC-2~27的培养基5mL ；
第28组10个培养皿，加入培养基 mTeSR1（购买自杭州百通生物技术有限公司，货号05850）5mL ；
第29组10个培养皿，加入高糖型DMEM细胞培养液 5mL ；
第30组10个培养皿，加入CN 102732477 B专利文献中的脂肪干细胞培养基5mL。
将细胞放在在37°C，5% CO2的培养箱中进行培养；置于倒置式显微镜观察，每隔3天用移液管吸去上层培养基，加入新的培养基，继续培养。
细胞计数:每天在各组中取一个培养皿放入洁净工作台，然后用移液管吸弃培养基。PBS洗涤2次，加入1ml 0.25%Trypsin-EDTA，倒置显微镜下发现贴壁细胞分离后，加入4ml含有10%FBS的基础培养基终止胰酶作用。台盼蓝(Typan Blue)染色血细胞计数板计数活细胞数，10皿取平均值。结果如下：
培养基种类 1天个数10<sup>6</sup>） 3天个数（10<sup>6</sup>） 6天个数（10<sup>6</sup>） 10天个数（10<sup>6</sup>）
CXXDC-1 1.3 2.5 55.3 52.0
CXXDC-2 1.2 2.4 54.3 51.7
CXXDC-3 1.3 2.3 54.0 51.2
CXXDC-4 1.4 2.5 55.4 52.1
CXXDC-5 1.2 2.4 54.1 51.8
CXXDC-6 1.2 2.5 55.6 52.3
CXXDC-7 1.3 2.4 54.2 51.6
CXXDC-8 1.2 2.5 55.6 52.2
CXXDC-9 1.3 2.5 55.7 52.6
CXXDC-10 1.2 2.4 54.3 51.4
CXXDC-11 1.2 2.3 53.2 51.0
CXXDC-12 1.3 2.5 55.6 52.1
CXXDC-13 1.2 2.4 54.7 51.3
CXXDC-14 1.25 2.3 53.0 51.1
CXXDC-15 1.2 2.4 54.7 51.6
CXXDC-16 1.3 2.5 55.8 52.6
CXXDC-17 1.2 2.4 54.2 51.4
CXXDC-18 1.2 2.3 53.1 51.0
CXXDC-19 1.2 2.3 53.2 51.1
CXXDC-20 1.3 2.4 54.4 51.3
CXXDC-21 1.2 2.5 55.7 52.4
CXXDC-22 1.2 2.4 54.2 51.7
CXXDC-23 1.3 2.6 56.3 52.8
CXXDC-24 1.2 2.5 55.7 52.7
CXXDC-25 1.3 2.5 55.1 52.9
CXXDC-26 1.2 2.7 57.3 52.8
CXXDC-27 1.2 2.7 57.6 52.8
培养基 mTeSR1 1.1 1.1 30.5 29.8
高糖型DMEM细胞培养液 1.0 1.0 2.1 1.9
CN 102732477 B中的脂肪干细胞培养基 1.1 1.05 37.1 34.1
实验结果表明，本发明的培养基能够有效地培养人脂肪干细胞。并且细胞生长曲线与现有技术的S形稍有不同，几乎为7字型，进入对数生长期的时间更短，并且细胞的饱和浓度更高。之后细胞增长减速进入平台区，凋亡的细胞并不是很多，保持了更长的细胞稳定期。
实施例5细胞形态学分析
取实施例4的高峰期之后的的细胞进行显微镜检测，发现1-27和30组培养基培养的细胞形态完全相同。而28组合29组的细胞已经呈现过早分化的状态。取培养10天后的细胞检测发现，1-27组的细胞形态仍然完好，基本很少出现凋亡细胞。而28和29组有较多的凋亡细胞，30组也出现较大比例的凋亡细胞，这说明，本发明的细胞培养基具有较好的保持细胞完整性和维持细胞活性的功能。
实施例6表面抗原分析
取用1-27组培养基培养的原代脂肪干细胞，去掉培养液，用1: 1的2.5%的胰蛋白酶溶液和0.0296EDTA溶液混合消化，用含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤后制成每100ul含有1 X 1O6个单细胞悬液，等分为7份，分别加入7个Eppendorf管中并编号，一号管加入共20μ L的FITC Mouse IgGl、APC_CY7Mouse IgG2b和染色缓冲液用于检测由于抗体非特异性结合产生的背景作为对照，其他试管分别加入CD29、CD34、44、45、105、HLA.DR单克隆抗体各20 μ L，每管分别加入细胞悬液100 μ L (含1 X 1O6个细胞)，室温孵育25min，用含1%BSA的PBS洗涤后，流式细胞仪检测。分析结果:流式细胞仪分析原代人脂肪干细胞六种表面抗原29，34，44，CD45，CD105和HLA.DR,结果表明使用无血清培养基培养出的细胞具有人脂肪干细胞特性。HLA.DR阴性，排除该类细胞是成纤维细胞。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明造构思的前 提下，还可以做出若干改变和改进，这些都属于发明的保护范围。
序列表
〈110〉李倩
〈120〉一种用于培养人脂肪干细胞的培养基
〈160〉27
〈210〉1
〈211〉18
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-1
PHVTYCSVDIPDSWLKSE
〈210〉2
〈211〉18
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-2
IWKWARPLCWNWHMQYMH
〈210〉3
〈211〉18
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-3
RCWTAMSLDPTPYSNGYA
〈210〉4
〈211〉18
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-4
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〈210〉5
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〈210〉6
〈211〉18
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〈210〉7
〈211〉17
〈212〉PRT
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〈400〉CXXDC-7
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〈210〉8
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〈212〉PRT
〈213〉人工序列
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HVQTVEGLGMPQRRTP
〈210〉9
〈211〉17
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-9
QVFAHQQMEKTGMVQRG
〈210〉10
〈211〉16
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-10
RGPQRAWTEGPSCIKR
〈210〉11
〈211〉17
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-11
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〈210〉12
〈211〉16
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-12
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〈210〉13
〈211〉17
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-13
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〈210〉14
〈211〉16
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
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〈211〉17
〈212〉PRT
〈213〉人工序列
〈400〉CXXDC-15
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〈400〉CXXDC-27
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Claims (3)

1.一种用于人脂肪干细胞培养的培养基，该培养基在高糖型DMEM细胞培养液的基础上加入青霉素100IU/ml，链霉素100μg/ml，L-谷氨酰胺2mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子l0ng/ml，维生素C 50μg/ml，人血清白蛋白13μg/mL，转铁蛋白6μg/mL,还原型谷胱甘肽10μg/mL,亚油酸5μg/mL和多肽30μg/ml组成，所述的多肽如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述的培养基在用于培养人脂肪干细胞中的用途。
3.一种多肽，其序列如SEQ ID NO：1所示。
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