CN110713974A - 一种干细胞培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种干细胞培养基及其制备方法，包括基质培养基与添加剂，基础培养基为DMEM/F12液体培养基，以基质培养基为准，向基质培养基中添加的添加剂成分为氯化铁、氨酰胺、葡萄糖、枸杞提取物、西红柿提取物、维生素C、胰岛素、橄榄油提取物及生长因子；本发明的干细胞培养基所用的添加剂成分为氯化铁、氨酰胺、葡萄糖、枸杞提取物、西红柿提取物、维生素C、胰岛素、橄榄油提取物及生长因子，因而不含有动物的血清，方便后期对干细胞进行分离；本发明提供的培养基能进一步提高干细胞的培养效率，降低培养基的使用成本；提高脂肪干细胞的增殖活性及脂肪干细胞的生长能力。

Description

一种干细胞培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体为一种干细胞培养基及其制备方法。
背景技术
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞，通常培养干细胞通常需要添加胎牛血清基质，基质含有各种细胞和各种蛋白成分，蛋白质的成分难以确定，对后期干细胞的分离造成较大难度，且容易引发造血干细胞造成干扰，增值能力较差等问题，为此我们提供一种干细胞培养基及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：一种干细胞培养基，包括基质培养基与添加剂，所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基，以基质培养基为准，向所述基质培养基中添加的添加剂成分为氯化铁、氨酰胺、葡萄糖、枸杞提取物、西红柿提取物、维生素C、胰岛素、橄榄油提取物及生长因子；
所述各添加剂成分的浓度为：氯化铁3-8mg/mL、氨酰胺20-30mg/mL、萄糖5-10mg/mL、枸杞提取物6-10mg/mL、西红柿提取物15-20mg/mL、维生素C5-12mg/mL、胰岛素1-3mg/mL、橄榄油提取物12-17mg/mL及生长因子3-5mg/mL。
优选的，所述西红柿提取物所需成分主要为谷胱甘肽。
优选的，所述橄榄油提取物所需成分主要为脂肪酸。
优选的，所述枸杞提取物所需成分主要为原花青素。
优选的，所述添加剂的浓度为氯化铁3mg/mL、氨酰胺20mg/mL、萄糖5mg/mL、枸杞提取物6mg/mL、西红柿提取物15mg/mL、维生素C5mg/mL、胰岛素1mg/mL、橄榄油提取物12mg/mL及生长因子3mg/mL。
优选的，所述添加剂的浓度为氯化铁5mg/mL、氨酰胺24mg/mL、萄糖7mg/mL、枸杞提取物8mg/mL、西红柿提取物16mg/mL、维生素C7mg/mL、胰岛素1.7mg/mL、橄榄油提取物13mg/mL及生长因子3.7mg/mL。
优选的，所述添加剂的浓度为氯化铁7mg/mL、氨酰胺27mg/mL、萄糖8.6mg/mL、枸杞提取物8.8mg/mL、西红柿提取物18mg/mL、维生素C9mg/mL、胰岛素2.1mg/mL、橄榄油提取物15mg/mL及生长因子4.3mg/mL。
优选的，所述氯化铁8mg/mL、氨酰胺30mg/mL、萄糖10mg/mL、枸杞提取物10mg/mL、西红柿提取物20mg/mL、维生素12mg/mL、胰岛素3mg/mL、橄榄油提取物17mg/mL及生长因子5mg/mL。
优选的，一种干细胞培养基的制备方法,包括以下步骤：
一、取部分脂肪组织，剪碎后再清洗，放入离心机中进行离心，离心转速为1500-2500r/min，离心时间为5-10min，之后用吸管吸取上层的组织块吸出；
二、将取出的组织块均匀地铺在培养皿中，倒入培养基，并用保温箱进行培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为12小时，；
三、每隔12小时对原培养皿进行更换，弃用原培养皿，更换新培养皿，并将干细胞接种与新的培养皿中进行培养，待细胞长到85-90％融合度后消化，按1：4比例传代。
本发明的有益效果：
1、本发明的干细胞培养基所用的添加剂成分为氯化铁、氨酰胺、葡萄糖、枸杞提取物、西红柿提取物、维生素C、胰岛素、橄榄油提取物及生长因子，因而不含有动物的血清，方便后期对干细胞进行分离；
2、本发明提供的培养基能进一步提高干细胞的培养效率，降低培养基的使用成本；
3、提高脂肪干细胞的增殖活性及脂肪干细胞的生长能力。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种干细胞培养基，包括基质培养基与添加剂，基础培养基为DMEM/F12液体培养基，以基质培养基为准，向基质培养基中添加的添加剂成分为氯化铁、氯化铁为无机盐，用于补充组织培养过程中需要无机盐，氨酰胺、葡萄糖、枸杞提取物、西红柿提取物、维生素C、胰岛素、橄榄油提取物及生长因子；
各添加剂成分的浓度为：氯化铁3-8mg/mL、氨酰胺20-30mg/mL、萄糖5-10mg/mL、枸杞提取物6-10mg/mL、西红柿提取物15-20mg/mL、维生素C5-12mg/mL、胰岛素1-3mg/mL、橄榄油提取物12-17mg/mL及生长因子3-5mg/mL。
西红柿提取物所需成分主要为谷胱甘肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。
橄榄油提取物所需成分主要为脂肪酸，能提供热量，是很好的能量来源，同时能保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理功能。
枸杞提取物所需成分主要为原花青素，具有强抗氧化、消除自由基的作用。
添加剂的浓度为氯化铁3mg/mL、氨酰胺20mg/mL、萄糖5mg/mL、枸杞提取物6mg/mL、西红柿提取物15mg/mL、维生素C5mg/mL、胰岛素1mg/mL、橄榄油提取物12mg/mL及生长因子3mg/mL。
添加剂的浓度为氯化铁5mg/mL、氨酰胺24mg/mL、萄糖7mg/mL、枸杞提取物8mg/mL、西红柿提取物16mg/mL、维生素C7mg/mL、胰岛素1.7mg/mL、橄榄油提取物13mg/mL及生长因子3.7mg/mL。
添加剂的浓度为氯化铁7mg/mL、氨酰胺27mg/mL、萄糖8.6mg/mL、枸杞提取物8.8mg/mL、西红柿提取物18mg/mL、维生素C9mg/mL、胰岛素2.1mg/mL、橄榄油提取物15mg/mL及生长因子4.3mg/mL。
氯化铁8mg/mL、氨酰胺30mg/mL、萄糖10mg/mL、枸杞提取物10mg/mL、西红柿提取物20mg/mL、维生素12mg/mL、胰岛素3mg/mL、橄榄油提取物17mg/mL及生长因子5mg/mL。
一种干细胞培养基的制备方法，包括以下步骤：
一、取部分脂肪组织，剪碎后再清洗，放入离心机中进行离心，离心转速为1500-2500r/min，离心时间为5-10min，之后用吸管吸取上层的组织块吸出；
二、将取出的组织块均匀地铺在培养皿中，倒入培养基，并用保温箱进行培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为12小时，；
三、每隔12小时对原培养皿进行更换，弃用原培养皿，更换新培养皿，并将干细胞接种与新的培养皿中进行培养，待细胞长到85-90％融合度后消化，按1：4比例传代。
对比例1：
添加剂的浓度为氯化铁3mg/mL、氨酰胺20mg/mL、萄糖5mg/mL、枸杞提取物6mg/mL、西红柿提取物15mg/mL、维生素C5mg/mL、胰岛素1mg/mL、橄榄油提取物12mg/mL及生长因子3mg/mL；
一种干细胞培养基的制备方法,包括以下步骤：
一、取部分脂肪组织，剪碎后再清洗，放入离心机中进行离心，离心转速为1500-2500r/min，离心时间为5-10min，之后用吸管吸取上层的组织块吸出；
二、将取出的组织块均匀地铺在培养皿中，倒入培养基，并用保温箱进行培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为12小时，；
三、每隔12小时对原培养皿进行更换，弃用原培养皿，更换新培养皿，并将干细胞接种与新的培养皿中进行培养，待细胞长到85-90％融合度后消化，按1：4比例传代。
实施例1：
添加剂的浓度为氯化铁3mg/mL、氨酰胺20mg/mL、萄糖5mg/mL、枸杞提取物6mg/mL、西红柿提取物18mg/mL、维生素C5mg/mL、胰岛素1mg/mL、橄榄油提取物12mg/mL及生长因子3mg/mL，
一种干细胞培养基的制备方法,包括以下步骤：
一、取部分脂肪组织，剪碎后再清洗，放入离心机中进行离心，离心转速为1500-2500r/min，离心时间为5-10min，之后用吸管吸取上层的组织块吸出；
二、将取出的组织块均匀地铺在培养皿中，倒入培养基，并用保温箱进行培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为12小时，；
三、每隔12小时对原培养皿进行更换，弃用原培养皿，更换新培养皿，并将干细胞接种与新的培养皿中进行培养，待细胞长到85-90％融合度后消化，按1：4比例传代。
实施例2：
添加剂的浓度为氯化铁3mg/mL、氨酰胺20mg/mL、萄糖5mg/mL、枸杞提取物6mg/mL、西红柿提取物15mg/mL、维生素C7mg/mL、胰岛素1mg/mL、橄榄油提取物12mg/mL及生长因子3mg/mL；
一种干细胞培养基的制备方法,包括以下步骤：
一、取部分脂肪组织，剪碎后再清洗，放入离心机中进行离心，离心转速为1500-2500r/min，离心时间为5-10min，之后用吸管吸取上层的组织块吸出；
二、将取出的组织块均匀地铺在培养皿中，倒入培养基，并用保温箱进行培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为12小时，；
三、每隔12小时对原培养皿进行更换，弃用原培养皿，更换新培养皿，并将干细胞接种与新的培养皿中进行培养，待细胞长到85-90％融合度后消化，按1：4比例传代。
实施例3：
添加剂的浓度为氯化铁3mg/mL、氨酰胺20mg/mL、萄糖5mg/mL、枸杞提取物6mg/mL、西红柿提取物15mg/mL、维生素C5mg/mL、胰岛素1mg/mL、橄榄油提取物17mg/mL及生长因子3mg/mL；
一种干细胞培养基的制备方法,包括以下步骤：
一、取部分脂肪组织，剪碎后再清洗，放入离心机中进行离心，离心转速为1500-2500r/min，离心时间为5-10min，之后用吸管吸取上层的组织块吸出；
二、将取出的组织块均匀地铺在培养皿中，倒入培养基，并用保温箱进行培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为12小时，；
三、每隔12小时对原培养皿进行更换，弃用原培养皿，更换新培养皿，并将干细胞接种与新的培养皿中进行培养，待细胞长到85-90％融合度后消化，按1：4比例传代。
实施例4：
添加剂的浓度为氯化铁3mg/mL、氨酰胺20mg/mL、萄糖5mg/mL、西红柿提取物15mg/mL、维生素C5mg/mL、胰岛素1mg/mL、橄榄油提取物12mg/mL及生长因子3mg/mL；
一种干细胞培养基的制备方法,包括以下步骤：
一、取部分脂肪组织，剪碎后再清洗，放入离心机中进行离心，离心转速为1500-2500r/min，离心时间为5-10min，之后用吸管吸取上层的组织块吸出；
二、将取出的组织块均匀地铺在培养皿中，倒入培养基，并用保温箱进行培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为12小时；
三、每隔12小时对原培养皿进行更换，弃用原培养皿，更换新培养皿，并将干细胞接种与新的培养皿中进行培养，待细胞长到85-90％融合度后消化，按1：4比例传代。
将对比例及实施例1-4制备得到的原代脂肪干细胞离心收集，重悬计数，并计算活率。结果见表1。
表1
Figure BDA0002286702390000071
由上可知，50ml组织最终获得原代脂肪干细胞5.1×107-5.9×107个，存活率为98.8～99.4％。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims (9)

1.一种干细胞培养基，包括基质培养基与添加剂，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12液体培养基，以基质培养基为准，向所述基质培养基中添加的添加剂成分为氯化铁、氨酰胺、葡萄糖、枸杞提取物、西红柿提取物、维生素C、胰岛素、橄榄油提取物及生长因子；
所述各添加剂成分的浓度为：氯化铁3-8mg/mL、氨酰胺20-30mg/mL、萄糖5-10mg/mL、枸杞提取物6-10mg/mL、西红柿提取物15-20mg/mL、维生素C5-12mg/mL、胰岛素1-3mg/mL、橄榄油提取物12-17mg/mL及生长因子3-5mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种干细胞培养基,其特征在于，所述西红柿提取物所需成分主要为谷胱甘肽。
3.根据权利要求1所述的一种干细胞培养基,其特征在于，所述橄榄油提取物所需成分主要为脂肪酸。
4.根据权利要求1所述的一种干细胞培养基,其特征在于，所述枸杞提取物所需成分主要为原花青素。
5.根据权利要求1所述的一种干细胞培养基,其特征在于，所述添加剂的浓度为氯化铁3mg/mL、氨酰胺20mg/mL、萄糖5mg/mL、枸杞提取物6mg/mL、西红柿提取物15mg/mL、维生素C5mg/mL、胰岛素1mg/mL、橄榄油提取物12mg/mL及生长因子3mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种干细胞培养基,其特征在于，所述添加剂的浓度为氯化铁5mg/mL、氨酰胺24mg/mL、萄糖7mg/mL、枸杞提取物8mg/mL、西红柿提取物16mg/mL、维生素C7mg/mL、胰岛素1.7mg/mL、橄榄油提取物13mg/mL及生长因子3.7mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种干细胞培养基,其特征在于，所述添加剂的浓度为氯化铁7mg/mL、氨酰胺27mg/mL、萄糖8.6mg/mL、枸杞提取物8.8mg/mL、西红柿提取物18mg/mL、维生素C9mg/mL、胰岛素2.1mg/mL、橄榄油提取物15mg/mL及生长因子4.3mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种干细胞培养基,其特征在于，所述氯化铁8mg/mL、氨酰胺30mg/mL、萄糖10mg/mL、枸杞提取物10mg/mL、西红柿提取物20mg/mL、维生素12mg/mL、胰岛素3mg/mL、橄榄油提取物17mg/mL及生长因子5mg/mL。
9.一种干细胞培养基的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：
一、取部分脂肪组织，剪碎后再清洗，放入离心机中进行离心，离心转速为1500-2500r/min，离心时间为5-10min，之后用吸管吸取上层的组织块吸出；
二、将取出的组织块均匀地铺在培养皿中，倒入培养基，并用保温箱进行培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为12小时；
三、每隔12小时对原培养皿进行更换，弃用原培养皿，更换新培养皿，并将干细胞接种与新的培养皿中进行培养，待细胞长到85-90％融合度后消化，按1：4比例传代。
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