CN106801030A - 适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物，含有 4种维生素、2种氨基酸、2种细胞因子、3种蛋白、3种金属离子、4种激素、2种脂肪酸、4种抗氧化剂和其他物质；所述替代血清组合物的使用方法为：⑴配制含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基；⑵准备培养介质；⑶含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基的使用；⑷体外培养的肝样细胞的传代或收获。本发明提供了组分明确、可添加到DMEM/F12基础培养基中适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物；其使用方法操作步骤简单明确，利于肝样细胞体外无血清培养和扩增；能为肝样细胞在药物研究和临床治疗中的应用提供积极支持，具有良好的社会和经济效益。

Description

适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物及其使用方法
技术领域
本发明涉及现代生物技术之培养基技术领域，涉及动物细胞培养的无血清培养基，具体地说，是一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物及其使用方法。
技术背景
肝脏是人体内最大的器官，也是体内少有的具有再生能力的器官。肝脏承担着机体内重要的生理活动，具有糖原合成和分解、储藏维生素A、尿素合成、药物代谢和解毒等功能，对人体的新陈代谢具有至关重要的作用。肝细胞作为肝脏功能的主要行使者被广泛应用于基础研究和临床研究，现今的药物开发和研究以及肝细胞移植都需要大量具功能的肝细胞。但是，目前的肝细胞主要取自供体肝脏，来源非常有限。而通过体外增殖获得肝细胞不仅困难而且其肝功能会急剧下降。因此，本领域迫切需要拓展新的肝细胞的来源，以满足基础研究和临床应用的需求。
现有的研究表明：成纤维细胞在一定条件下可以转分化为特定的细胞类型。如果能够将来源于病人的成纤维细胞转分化为肝细胞或者是具有肝功能的细胞，不但可以解决肝细胞来源的问题，而且可以在细胞移植或者生物人工肝应用过程中避免潜在的免疫排斥等问题。目前，有研究机构通过限定转录因子诱导成纤维细胞向肝样细胞的直接转化，成功地将成纤维细胞诱导为具肝样功能的细胞，并通过SV40 Large T过表达，促进肝样细胞的增殖。
由转分化获得的肝样细胞具有与原代肝细胞类似的表型及功能，如分泌白蛋白、合成尿素、储存糖原、部分药物代谢和转运能力等，并且在体外可以长期稳定增殖和维持功能。现已证实，经过细胞移植，肝样细胞在生物体内不但具有再生能力并且不存在潜在的致瘤风险。这些研究均表明：肝样细胞有望代替原代肝细胞用于肝脏药物研究和临床应用。然而，在药物研究和临床应用中需要大量的功能肝细胞，如临床上为肝衰竭成人患者提供肝功能支持的生物人工肝系统常需要1010-1011功能肝细胞，而通过转分化通常只能获得106-107功能肝细胞；因此，需要在体外大量培养和扩增肝样细胞。
在体外培养动物细胞的过程中，培养基是细胞营养物质的唯一来源，因此，培养基的成分直接影响动物细胞的增殖和功能。由于不同动物细胞的代谢特性不同，它们对营养物质的需求也不同，故需要根据动物细胞的特性设计不同的、有特征的个性化培养基。目前，市场上有一些商业化的基础培养基可用于肝细胞的培养，例如：DMEM/F12和William E等，其中，William E培养基主要用于原代肝细胞的培养，而DMEM/F12培养基主要用于由ESC、iPSC等分化而来的肝样细胞的培养。这两种所述的基础培养基均具有一定的普适性，可用于许多种类细胞的培养，但培养基中必需添加动物来源的血清和其他添加剂。
血清是一种复杂的混合物，其中含有多种细胞粘附、生长和增殖所需的生长调节因子，能够补充基础培养基中没有或者量不足的营养成分，提供载体蛋白以结合维生素、脂质和金属离子等，还能提供蛋白酶抑制剂等。但是，由于血清来源于异种动物，成分不明，不同批次的血清差异较大，质量难以控制，且存在病毒感染、免疫排斥等风险，因此，采用含血清培养基培养的动物细胞在药物研究和临床应用上往往存在较大的限制。要实现肝样细胞在药物研究和临床治疗中的可靠或安全应用，在其体外培养过程中不能添加动物来源的血清。然而，作为由成纤维细胞转分化而来的肝样细胞是一种全新来源的细胞，目前还没有能支持其体外扩增和维持其功能的无血清培养基。
为实现动物细胞的无血清培养，往往需要在商业化基础培养基中补充一些血清替代物以促进细胞增殖、维持细胞功能。目前，在用的血清替代物常含有一些组成不确定的添加剂，例如蛋白水解物等。研究发现，在DMEM/F12基础培养基中添加B-27及其他组分可以促进肝样细胞的增殖和功能维持，但所述B-27作为成分不明的组分在临床应用中受到一定限制。因此，为满足肝样细胞在药物研究和临床治疗中的应用，需要开发成分明确的、适于肝样细胞体外无血清培养和扩增的血清替代物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物，其组分明确，可添加到商业化基础培养基中，能支持肝样细胞体外无血清培养和扩增。本发明的第二目的是，提供所述替代血清组合物的使用方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案。
一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物，含有多种维生素、氨基酸、细胞因子、蛋白、金属离子、激素、脂肪酸和抗氧化剂，其特征在于，其各种组分的含量为（以添加到基础培养基中的最终浓度计算，单位为毫克/升或微摩尔/升）：
半乳糖 1000～3000mg/L；
丙酮酸钠 100～120mg/L；
鸟氨酸 100～200mg/L；
脯氨酸 100～300mg/L；
转铁蛋白 5～10mg/L；
胰岛素 10～20mg/L；
牛血清白蛋白 50～2500mg/L；
TGF-α 0.02～0.05mg/L；
EGF 0.02～0.05mg/L；
ZnCl2 0.4～0.6mg/L；
ZnSO4·7H2O 0.6～0.8mg/L；
CuSO4·5H2O 0.1～0.4mg/L；
MnSO4 0.01～0.03mg/L；
孕酮 0.005～0.007mg/L；
肾上腺酮 0.01～0.04mg/L；
三碘甲状腺原氨酸 0.001～0.004mg/L；
地塞米松 8.0～11.0μM；
烟酰胺 500～700mg/L；
维生素H 1.0～2.0mg/L；
维生素A乙酸酯 0.1～0.3mg/L；
维生素E 1.0～2.0mg/L；
丁二胺 12.0～17.0mg/L；
乙醇胺 1.0～2.0mg/L；
亚硒酸钠 0.01～0.03mg/L；
过氧化氢酶 1.0～3.0mg/L；
谷胱甘肽 1.0～2.0mg/L；
超氧化物歧化酶 2.0～4.0mg/L；
肉碱 1.0～4.0mg/L；
亚麻酸 1.0～2.0mg/L；
亚油酸 1.0～2.0mg/L。
可选地，所述替代血清组合物以DMEM/F12为基础培养基。
为实现上述第二目的，本发明采取以下技术方案。
一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的使用方法，其特征在于，采用DMEM/F12为基础培养基，具体步骤如下：
（1）配制含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基
所述替代血清组合物含有多种维生素、氨基酸、细胞因子、蛋白、金属离子、激素、脂肪酸和抗氧化剂，其各种组分的含量为（以添加到基础培养基中的最终浓度计算，单位为毫克/升或微摩尔/升）：
半乳糖 1000～3000mg/L；
丙酮酸钠 100～120mg/L；
鸟氨酸 100～200mg/L；
脯氨酸 100～300mg/L；
转铁蛋白 5～10mg/L；
胰岛素 10～20mg/L；
牛血清白蛋白 50～2500mg/L；
TGF-α 0.02～0.05mg/L；
EGF 0.02～0.05mg/L；
ZnCl2 0.4～0.6mg/L；
ZnSO4·7H2O 0.6～0.8mg/L；
CuSO4·5H2O 0.1～0.4mg/L；
MnSO4 0.01～0.03mg/L；
孕酮 0.005～0.007mg/L；
肾上腺酮 0.01～0.04mg/L；
三碘甲状腺原氨酸 0.001～0.004mg/L；
地塞米松 8.0～11.0μM；
烟酰胺 500～700mg/L；
维生素H 1.0～2.0mg/L；
维生素A乙酸酯 0.1～0.3mg/L；
维生素E 1.0～2.0mg/L；
丁二胺 12.0～17.0mg/L；
乙醇胺 1.0～2.0mg/L；
亚硒酸钠 0.01～0.03mg/L；
过氧化氢酶 1.0～3.0mg/L；
谷胱甘肽 1.0～2.0mg/L；
超氧化物歧化酶 2.0～4.0mg/L；
肉碱 1.0～4.0mg/L；
亚麻酸 1.0～2.0mg/L；
亚油酸 1.0～2.0mg/L；
将所述的替代血清组合物各成分按一定剂量加入DMEM/F12中，溶于超纯水中，过滤除菌；
（2）准备培养介质
①将I型胶原溶解于0.6%（v/v）的冰醋酸溶液中，溶解液中I型胶原终浓度为0.1%（w/v），将溶解液用0.22μm滤膜过滤，然后向培养介质中加入50μl/cm2 I型胶原溶解液；
②如培养介质为多孔板或培养皿，将步骤（2）①的培养介质敞盖置于超净台中晾干；
③收集步骤（2）②的培养介质前须用紫外线照射培养介质30分钟，待用；
④如培养介质为培养瓶，将步骤（2）①的培养介质在室温下孵育2小时，之后将I型胶原溶液倒出，所述培养介质用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤后待用；
（3）含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基的使用
①将含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基先置于37℃恒温箱中预热15分钟；
②将肝样细胞重悬于步骤（1）配制的含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基中，加入步骤（2）②或④的培养介质里；
③将步骤（3）②含肝样细胞的培养介质置于37℃、5%CO2、饱和水蒸气的培养箱中培养，培养过程中每2 天换液一次，培养4～6天后传代或收获肝样细胞；
（4）体外培养的肝样细胞的传代或收获
培养4～6天后，弃去步骤（3）③的培养介质里的培养上清液，加入PBS洗涤一次，按25～100μl/cm2加入0.05%（w/v）胰酶溶液至培养介质并进行细胞消化，待细胞消化后，按与胰酶溶液体积1:1的比例加入含胰重组抑肽酶（10 EPU/ml）的步骤（1）所述的无血清培养基。
进一步，步骤（1）所述的含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基中DMEM/F12基础培养基的量为12000mg/L。
进一步，所述培养介质为多孔板、培养皿和/或培养瓶。
进一步，所述肝样细胞以1.2～2×104cells/cm2的密度接入胶原包被的培养介质中。
本发明的积极效果是：
（1）提供了组分明确、可添加到商业化基础培养基DMEM/F12中的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物。
（2）提供所述替代血清组合物的使用方法，其操作步骤简单明确，能支持肝样细胞体外无血清培养和扩增。
（3）能为肝样细胞在药物研究和临床治疗中的应用提供积极的支持，具有良好的社会效益和经济效益。
附图说明
图1是采用实施例1的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基培养肝样细胞1天后的细胞形态图。
图2是采用实施例1的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基培养肝样细胞4天后的细胞形态图。
图3是采用实施例1的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基培养的肝样细胞合成白蛋白的检测图。
图4是采用实施例1的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基培养的肝样细胞糖原积累的检测图。
图5是采用实施例1的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基培养的肝样细胞脂质摄取的检测图。
图6是采用实施例2的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基与含1%胎牛血清的HMM培养基培养肝样细胞的生长曲线对比图。
图7是采用实施例2的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基与含1%胎牛血清的HMM培养基培养的肝样细胞白蛋白表达对比图。
图8是采用实施例3的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基与含1%胎牛血清的HMM培养基培养肝样细胞的扩增倍数对比图。
图9是采用实施例4的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基培养肝样细胞的生长图。
具体实施方式
以下结合附图介绍本发明适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的具体实施方式，提供4个实施例。但是应该指出，本发明的实施不限于以下的实施方式。
实施例1
一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的使用方法，其具体步骤如下：
（1）配制适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物
所述替代血清组合物含有多种维生素、氨基酸、细胞因子、蛋白、金属离子、激素、脂肪酸和抗氧化剂，其各种组分的含量为（以添加到基础培养基中的最终浓度计算，单位为毫克/升或微摩尔/升）：
半乳糖 1000mg/L；
丙酮酸钠 100mg/L；
鸟氨酸 100mg/L；
脯氨酸 200mg/L；
转铁蛋白 5mg/L；
胰岛素 15mg/L；
牛血清白蛋白 500mg/L；
TGF-α 0.02mg/L；
EGF 0.05mg/L；
ZnCl2 0.6mg/L；
ZnSO4·7H2O 0.6mg/L；
CuSO4·5H2O 0.2mg/L；
MnSO4 0.01mg/L；
孕酮 0.007mg/L；
肾上腺酮 0.04mg/L；
三碘甲状腺原氨酸 0.002mg/L；
地塞米松 8.0μM；
烟酰胺 500mg/L；
维生素H 2.0mg/L；
维生素A乙酸酯 0.3mg/L；
维生素E 1.0mg/L；
丁二胺 15.0mg/L；
乙醇胺 1.5mg/L；
亚硒酸钠 0.02mg/L；
过氧化氢酶 1.0mg/L；
谷胱甘肽 2.0mg/L；
超氧化物歧化酶 3.0mg/L；
肉碱 1.0mg/L；
亚麻酸 2.0mg/L；
亚油酸 1.0mg/L；
将所述的替代血清组合物各成分按一定剂量加入DMEM/F12中，DMEM/F12基础培养基的量为12000mg/L，溶于超纯水中；过滤除菌。
（2）培养介质的准备
①将I型胶原溶解于0.6%（v/v）的冰醋酸溶液中，溶解液中I型胶原终浓度为0.1%（w/v），将溶解液用0.22μm滤膜过滤，然后向24孔板中加入50μl/cm2 I型胶原溶解液。
②将步骤（2）①的24孔板敞盖置于超净台中晾干。
③收集步骤②的24孔板前须用紫外线照射培养介质30分钟，待用。
（3）含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基的使用
①含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基在使用前，应将盛装该培养基的试剂瓶置于37℃恒温箱中预热15分钟。
②将肝样细胞重悬于含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基中，以2×104cells/cm2的密度接入胶原包被的24孔板内。
③将接种了肝样细胞的24孔板置于37℃、5%CO2、饱和水蒸气的培养箱中培养，培养1 天后开始观察并记录肝样细胞的形态和生长情况；培养2天后换液；培养4天后观察并记录肝样细胞的形态和生长情况，并检测肝样细胞的白蛋白合成、糖原积累和脂质吸收（低密度脂蛋白，LDL）。
培养1天后肝样细胞的形态参见图1，培养4天后肝样细胞的形态参见图2，在培养过程中细胞均呈上皮样。与培养1天的肝样细胞相比，经过4天体外培养的肝样细胞数量有明显的增长，这说明实施例1的含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基能够维持肝样细胞形态，支持肝样细胞的体外生长。
对实施例1采用含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基培养的肝样细胞的功能检测为：
肝样细胞白蛋白免疫荧光检测结果见图3，图中亮色的部分表明培养的细胞具有合成白蛋白的能力。
肝样细胞糖原PAS染色的结果见图4，图中深色的部分表明培养的细胞具有累积糖原的能力。
肝样细胞DiI-ac-LDL染色的结果见图5，图中亮色的部分表明培养的细胞具有摄入低密度脂蛋白的能力。
上述功能检测的结果反映出：肝样细胞经实施例1含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基培养后仍具有合成白蛋白、储存糖原和摄入脂质的肝特异功能。
实施例2
一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的使用方法，其具体步骤如下：
（1）配制适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物
所述替代血清组合物各种组分的含量为（以添加到基础培养基中的最终浓度计算，单位为毫克/升或微摩尔/升）：
半乳糖 3000mg/L；
丙酮酸钠 100mg/L；
鸟氨酸 200mg/L；
脯氨酸 150mg/L；
转铁蛋白 7.0mg/L；
胰岛素 11.0mg/L；
牛血清白蛋白 1000mg/L；
TGF-α 0.03mg/L；
EGF 0.03mg/L；
ZnCl2 0.5mg/L；
ZnSO4·7H2O 0.7mg/L；
CuSO4·5H2O 0.3mg/L；
MnSO4 0.02mg/L；
孕酮 0.006mg/L；
肾上腺酮 0.03mg/L；
三碘甲状腺原氨酸 0.003mg/L；
地塞米松 10.0μM；
烟酰胺 600mg/L；
维生素H 1.0mg/L；
维生素A乙酸酯 0.2mg/L；
维生素E 2.0mg/L；
丁二胺 15.0mg/L；
乙醇胺 1.5mg/L；
亚硒酸钠 0.01mg/L；
过氧化氢酶 2.0mg/L；
谷胱甘肽 2.0mg/L；
超氧化物歧化酶 3.0mg/L；
肉碱 2.0mg/L；
亚麻酸 1.0mg/L；
亚油酸 1.0mg/L；
将所述的替代血清组合物各成分按一定剂量加入DMEM/F12中，DMEM/F12基础培养基的量同实施例1，溶于超纯水中；过滤除菌。
（2）培养介质的准备
（同实施例1）。
（3）含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基的使用（基本同实施例1）
①（同实施例1）。
②将肝样细胞重悬于含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基中，以1.5×104cells/cm2（等于3×104cells/ml）的密度接入胶原包被的24孔板内。
③将接种了肝样细胞的24孔板置于37℃、5%CO2、饱和水蒸气的培养箱中培养8天。8天中每天取24孔板中的3个孔，洗净培养基，加入1ml PBS洗涤一遍，按100μl/cm2加入200μl 0.05%（w/v）胰酶消化，待细胞消化后，按1:1比例加入200μl含胰重组抑肽酶（10 EPU/ml）的上述无血清培养基；吹匀细胞悬液后，用血球计数板计数，绘制细胞生长曲线。设置对照组。所述对照组为采用含1%胎牛血清的HMM培养基（Hui Lijian等开发的肝样细胞含血清培养基，Cell Stem Cell. 2014, 14, 370-384）培养的肝样细胞。
④肝样细胞培养的8天中每2天取24孔板中的培养基上清液，用human albuminELISA kit（bethyl）分别测定肝样细胞培养2、4、6、8天时培养基上清液中白蛋白的含量。
对实施例2采用含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基培养的肝样细胞的比较分析为：
（1）实施例2采用所述无血清培养基培养的肝样细胞与含1%胎牛血清的HMM培养基培养的肝样细胞的生长曲线对比情况见图6。图6结果表明：实施例2培养的肝样细胞最高活细胞密度达29.1×104cells/ml；含1%胎牛血清的HMM培养基培养的肝样细胞最高活细胞密度达32.1×104cells/ml；肝样细胞在上述两种培养基中均能扩增10倍左右。因此，实施例2在采用所述的无血清培养基中肝样细胞的扩增能力与在含1%胎牛血清的HMM培养基中是基本相当的。
（2）实施例2采用所述无血清培养基与含1%胎牛血清的HMM培养基培养的肝样细胞白蛋白表达的对比情况见图7。图7结果表明：肝样细胞在上述两种培养基中白蛋白的表达量是基本相当的。
实施例3
一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的使用方法，其具体步骤如下：
（1）配制适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物
所述替代血清组合物各种组分的含量为（以添加到基础培养基中的最终浓度计算，单位为毫克/升或微摩尔/升）：
半乳糖 2000mg/L；
丙酮酸钠 120mg/L；
鸟氨酸 200mg/L；
脯氨酸 300mg/L；
转铁蛋白 10.0mg/L；
胰岛素 20.0mg/L；
牛血清白蛋白 2500mg/L；
TGF-α 0.05mg/L；
EGF 0.05mg/L；
ZnCl2 0.5mg/L；
ZnSO4·7H2O 0.8mg/L；
CuSO4·5H2O 0.4mg/L；
MnSO4 0.03mg/L；
孕酮 0.007mg/L；
肾上腺酮 0.04mg/L；
三碘甲状腺原氨酸 0.004mg/L；
地塞米松 11.0μM；
烟酰胺 700mg/L；
维生素H 1.5mg/L；
维生素A乙酸酯 0.3mg/L；
维生素E 1.5mg/L；
丁二胺 17.0mg/L；
乙醇胺 2.0mg/L；
亚硒酸钠 0.03mg/L；
过氧化氢酶 3.0mg/L；
谷胱甘肽 1.0mg/L；
超氧化物歧化酶 4.0mg/L；
肉碱 4.0mg/L；
亚麻酸 2.0mg/L；
亚油酸 2.0mg/L；
将所述的替代血清组合物各成分按一定剂量加入DMEM/F12中，无血清培养基中DMEM/F12基础培养基的量和无血清培养基制备方法同实施例1。
（2）培养介质的准备
①将I型胶原溶解于0.6%（v/v）的冰醋酸溶液中，溶解液中I型胶原终浓度为0.1%（w/v），将溶解液用0.22μm滤膜过滤，然后向培养皿中加入50μl/cm2 I型胶原溶解液。
②将步骤（2）①的培养皿敞盖置于超净台中晾干。
③收集步骤（2）②的培养皿前须用紫外线照射培养介质30分钟，待用。
（3）含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基的使用（基本同实施例1）
①（同实施例1）。
②将肝样细胞以1×105cells/ml（1.2×104cells/cm2）的密度接入胶原包被的培养皿内，接种体积为10ml。
③将接种了肝样细胞的培养皿置于37℃、5%CO2、饱和水蒸气的培养箱中培养，每2天换一次液，培养4 天后进行传代，每次传代时对肝样细胞进行计数。设置其对照组。所述对照组为采用含1%胎牛血清的HMM培养基培养的肝样细胞。
（4）体外培养的肝样细胞的传代：吸净培养基后，加入5ml PBS洗涤一遍，之后吸净PBS。在培养皿中按25μl/cm2加入2ml 0.05%（w/v）胰酶，置于37℃培养箱中消化5min。当轻拍培养皿即有细胞掉落时，在实施例3的无血清培养基的实验组中加入2ml胰重组抑肽酶（10EPU/ml），而在含1%胎牛血清的HMM培养基的对照组中按照1:1的比例加入含血清培养基，以终止消化。将悬液中的细胞聚团吹散后，加入离心管中，离心后弃去上清液，加入10ml含本发明的替代血清组合物的无血清培养基或者含有1%胎牛血清的HMM培养基，吹匀计数，并以1×105cells/ml的密度接入胶原包被的培养皿中，置于37℃、5%CO2、饱和水蒸气的培养箱中继续培养传代，重复上述操作。
对实施例3采用所述无血清培养基培养的肝样细胞与含1%胎牛血清的HMM培养基培养的肝样细胞连续传代时细胞增殖倍数的对比情况见图8。图8表明：肝样细胞在实施例3的无血清培养基中连续传代两次，细胞增殖倍数分别为11.2±0.6和11.2±0.8倍。而在含1%胎牛血清的HMM培养基的对照组中，肝样细胞的增殖倍数分别为11.6±0.4和12.0±0.6倍。因此，实施例3证明：在实施例3的无血清培养基中肝样细胞是可以连续传代的。此外，对于同一代次培养的肝样细胞，在实施例3的无血清培养基中和在含有1%胎牛血清的HMM培养基中的扩增倍数无显著差异。
实施例4
一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的使用方法，基本同实施例3。
所不同的是：
（1）配制适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物
所述替代血清组合物各种组分的含量为（以添加到基础培养基中的最终浓度计算，单位为毫克/升或微摩尔/升）：
半乳糖 2000mg/L；
丙酮酸钠 110mg/L；
鸟氨酸 150mg/L；
脯氨酸 100mg/L；
转铁蛋白 10.0mg/L；
胰岛素 10.0mg/L；
牛血清白蛋白 50mg/L；
TGF-α 0.05mg/L；
EGF 0.02mg/L；
ZnCl2 0.4mg/L；
ZnSO4·7H2O 0.8mg/L；
CuSO4·5H2O 0.1mg/L；
MnSO4 0.03mg/L；
孕酮 0.005mg/L；
肾上腺酮 0.01mg/L；
三碘甲状腺原氨酸 0.001mg/L；
地塞米松 11.0μM；
烟酰胺 700mg/L；
维生素H 2.0mg/L；
维生素A乙酸酯 0.1mg/L；
维生素E 2.0mg/L；
丁二胺 12.0mg/L；
乙醇胺 1.0mg/L；
亚硒酸钠 0.03mg/L；
过氧化氢酶 3.0mg/L；
谷胱甘肽 1.5mg/L；
超氧化物歧化酶 2.0mg/L；
肉碱 1.0mg/L；
亚麻酸 1.5mg/L；
亚油酸 1.5mg/L；
将所述的替代血清组合物各成分按一定剂量加入DMEM/F12中，无血清培养基中DMEM/F12基础培养基的量和无血清培养基配制方法同实施例1。
（2）培养介质的准备
①将I型胶原溶解于0.6%（v/v）的冰醋酸溶液中，溶解液中I型胶原终浓度为0.1%（w/v），将溶解液用0.22μm滤膜过滤，然后向培养瓶中加入50μl/cm2 I型胶原溶解液。
②将步骤（2）①的培养瓶在室温下孵育2小时，之后将I型胶原溶液倒出，培养瓶用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤后待用。
（3）含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基的使用（基本同实施例1）
①（同实施例1）。
②将肝样细胞重悬于含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基中，以1×105cells/ml（1.3×104cells/cm2）的密度接入胶原包被的培养瓶内，接种体积为10ml。
③将接种了肝样细胞的培养瓶置于37℃、5%CO2、饱和水蒸气的培养箱中培养，每2天换一次液，培养6天后收获肝样细胞。
（4）体外培养的肝样细胞的收获：吸净培养上清液后，加入5ml PBS洗涤，之后吸净PBS。在培养瓶中按40μl/cm2加入3ml 0.05%（w/v）胰酶，消化细胞。当细胞脱离培养瓶时，加入3ml胰重组抑肽酶（10EPU/ml）以终止消化。将悬液中的肝样细胞聚团吹散，加入离心管中，离心后弃去上清液，加入10ml含本发明的替代血清组合物的无血清培养基，获得细胞悬液。
对实施例4采用所述无血清培养基培养的肝样细胞接种时和培养6后的细胞数对比情况见图9。图9结果表明：肝样细胞在实施例4的无血清培养基中培养6天，培养瓶中细胞数从接种时1×106个增加到11.9×106个。实施例4证明：在实施例4的无血清培养基中肝样细胞可以生长并增殖。

Claims (6)

1.一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物，含有多种维生素、氨基酸、细胞因子、蛋白、金属离子、激素、脂肪酸和抗氧化剂，其特征在于，其各种组分的含量为（以添加到基础培养基中的最终浓度计算，单位为毫克/升或微摩尔/升）：
半乳糖 1000～3000mg/L；
丙酮酸钠 100～120mg/L；
鸟氨酸 100～200mg/L；
脯氨酸 100～300mg/L；
转铁蛋白 5～10mg/L；
胰岛素 10～20mg/L；
牛血清白蛋白 50～2500mg/L；
TGF-α 0.02～0.05mg/L；
EGF 0.02～0.05mg/L；
ZnCl2 0.4～0.6mg/L；
ZnSO4·7H2O 0.6～0.8mg/L；
CuSO4·5H2O 0.1～0.4mg/L；
MnSO4 0.01～0.03mg/L；
孕酮 0.005～0.007mg/L；
肾上腺酮 0.01～0.04mg/L；
三碘甲状腺原氨酸 0.001～0.004mg/L；
地塞米松 8.0～11.0μM；
烟酰胺 500～700mg/L；
维生素H 1.0～2.0mg/L；
维生素A乙酸酯 0.1～0.3mg/L；
维生素E 1.0～2.0mg/L；
丁二胺 12.0～17.0mg/L；
乙醇胺 1.0～2.0mg/L；
亚硒酸钠 0.01～0.03mg/L；
过氧化氢酶 1.0～3.0mg/L；
谷胱甘肽 1.0～2.0mg/L；
超氧化物歧化酶 2.0～4.0mg/L；
肉碱 1.0～4.0mg/L；
亚麻酸 1.0～2.0mg/L；
亚油酸 1.0～2.0mg/L。
2.如权利要求1所述的适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物，其特征在于，所述替代血清组合物以DMEM/F12为基础培养基。
3.一种适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的使用方法，其特征在于，采用DMEM/F12为基础培养基，具体步骤如下：
（1）配制含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基
所述替代血清组合物含有多种维生素、氨基酸、细胞因子、蛋白、金属离子、激素、脂肪酸和抗氧化剂，其各种组分的含量为（以添加到基础培养基中的最终浓度计算，单位为毫克/升或微摩尔/升）：
半乳糖 1000～3000mg/L；
丙酮酸钠 100～120mg/L；
鸟氨酸 100～200mg/L；
脯氨酸 100～300mg/L；
转铁蛋白 5～10mg/L；
胰岛素 10～20mg/L；
牛血清白蛋白 50～2500mg/L；
TGF-α 0.02～0.05mg/L；
EGF 0.02～0.05mg/L；
ZnCl2 0.4～0.6mg/L；
ZnSO4·7H2O 0.6～0.8mg/L；
CuSO4·5H2O 0.1～0.4mg/L；
MnSO4 0.01～0.03mg/L；
孕酮 0.005～0.007mg/L；
肾上腺酮 0.01～0.04mg/L；
三碘甲状腺原氨酸 0.001～0.004mg/L；
地塞米松 8.0～11.0μM；
烟酰胺 500～700mg/L；
维生素H 1.0～2.0mg/L；
维生素A乙酸酯 0.1～0.3mg/L；
维生素E 1.0～2.0mg/L；
丁二胺 12.0～17.0mg/L；
乙醇胺 1.0～2.0mg/L；
亚硒酸钠 0.01～0.03mg/L；
过氧化氢酶 1.0～3.0mg/L；
谷胱甘肽 1.0～2.0mg/L；
超氧化物歧化酶 2.0～4.0mg/L；
肉碱 1.0～4.0mg/L；
亚麻酸 1.0～2.0mg/L；
亚油酸 1.0～2.0mg/L；
将所述的替代血清组合物各成分按一定剂量加入DMEM/F12中，溶于超纯水中，过滤除菌；
（2）准备培养介质
①将I型胶原溶解于0.6%（v/v）的冰醋酸溶液中，溶解液中I型胶原终浓度为0.1%（w/v），将溶解液用0.22μm滤膜过滤，然后向培养介质中加入50μl/cm2 I型胶原溶解液；
②如培养介质为多孔板或培养皿，将步骤（2）①的培养介质敞盖置于超净台中晾干；
③收集步骤（2）②的培养介质前须用紫外线照射培养介质30分钟，待用；
④如培养介质为培养瓶，将步骤（2）①的培养介质在室温下孵育2小时，之后将I型胶原溶液倒出，所述培养介质用磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤后待用；
（3）含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基的使用
①将含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的培养基先置于37℃恒温箱中预热15分钟；
②将肝样细胞重悬于步骤（1）配制的含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基中，加入步骤（2）②或④的培养介质里；
③将步骤（3）②含肝样细胞的培养介质置于37℃、5%CO2、饱和水蒸气的培养箱中培养，培养过程中每2 天换液一次，培养4～6天后传代或收获肝样细胞；
（4）体外培养的肝样细胞的传代或收获
培养4～6天后，弃去步骤（3）③的培养介质里的培养上清液，加入PBS洗涤一次，按25～100μl/cm2加入0.05%（w/v）胰酶溶液至培养介质并进行细胞消化，待细胞消化后，按与胰酶溶液体积1:1的比例加入含胰重组抑肽酶（10 EPU/ml）的步骤（1）所述的无血清培养基。
4.如权利要求3所述的使用方法，其特征在于，步骤（1）所述的含适于肝样细胞体外培养的替代血清组合物的无血清培养基中DMEM/F12基础培养基的量为12000mg/L。
5.如权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述培养介质为多孔板、培养皿和/或培养瓶。
6.如权利要求3所述的使用方法，其特征在于，所述肝样细胞以1.2～2×104cells/cm2的密度接入胶原包被的培养介质中。
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