CN115651066B - 一种海参多肽、制作工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种海参多肽、制作工艺及其应用，所述海参多肽的氨基酸序列为：ALVYYKMMKTSRSTA。本发明创造性地从海参多肽混合物中发现活性成分，所得到的海参多肽具有强的抗氧化活性和成纤维细胞增殖活性，本发明所制备得到的海参多肽安全性高，为开发海参多肽相关制品提供了保障。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种海参多肽、制作工艺及其应用。
背景技术
海参含有丰富的蛋白质、氨基酸以及多种微量元素，自古以来都被人们视为滋补佳品，具有极高的营养价值。与大分子量的蛋白质相比，多肽具有分子量小、易吸收、无抗原性、具有多种生物学活性等特点，越来越受到人们的认可。近年来，在海参深加工中，海参多肽的制备技术成为热点。
多肽是分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，使蛋白质具有一定的生理功能。在人类的生命活动中，肽在体内的消化吸收优于游离的氨基酸，且有着区别于氨基酸的体内输送体系。某些短肽在提供人体生长、发育所必需的营养物质的同时，还能够防病治病，调节人体机能，这些具有生物活性的多肽被称为生物活性肽。研究发现，很多不同来源的多肽都具有抗氧化能力，如水解酪蛋白、大豆蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、油料种子蛋白、小麦醇溶蛋白和玉米蛋白等得到的多肽都具有一定的抗氧化性。
在本申请人的在先授权专利CN102907558B中，公开了一种海参多肽的加工方法，其特征在于：包括以下步骤：A、预处理：鲜海参经清洗后打浆、均质，制得海参浆；B、酶解：不调PH值，加入木瓜蛋白酶与复合蛋白酶，与鲜海参自身含有的自溶酶构成多酶体系进行酶解后，加入风味蛋白酶继续酶解至酶解完成；C、分级：经普通过滤、微滤后，采用超滤分级结合梯度稀释对海参多肽酶解液进行分级； D、包装：干燥完成后采用防潮包装。该发明中的木瓜蛋白酶和复合蛋白酶在酶解体系中具有协同作用，增强酶解效果，整个酶解过程方便操作，利于大规模生产需要，同时提高分离效率，获得高纯度高品质的分级海参多肽，且无有机溶剂的加入，安全性高，为开发海参多肽提供了保障。
上述方法所制备的海参多肽为混合物，其具体的活性成分并不清楚，使得产品的品质控制存在难度。而且，所制备的海参多肽中存在一定量没有生物活性的成分，使得该产品在使用时也存在一定的不便。
为了从海参多肽中获取具有明确结构的活性多肽，中国授权专利CN104402972B公开了一种海参抗氧化肽及其制备方法，该方法以海参肉或海参内脏蛋白为原料，通过对酸性蛋白酶的酶解，分离纯化得到特异性海参抗氧化肽，其氨基酸全序列为：MALSVL。该发明制得的海参抗氧化肽弥补了天然抗氧化剂所具有的缺陷，并且消除了公众对人工合成抗氧化剂的忧虑，为开发基于食品源的抗氧化多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定了基础。
然而，如何从海参多肽中获得更多活性更高的多肽，仍然是本领域技术人员亟待解决的技术问题。本发明申请正是针对该技术问题进行研发并基于该研发成果所完成的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗氧化活性和成纤维细胞增殖活性的海参多肽、制作工艺及其应用。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
本发明一方面涉及一种海参多肽，所述海参多肽的氨基酸序列是：ALVYYKMMKTSRSTA。
本发明还涉及一种食品，所述食品中含有上述海参多肽。对于食品中上述海参多肽的用量没有特别的限定，例如，可以是0.1wt%-1wt%之间。
本发明另一方面还涉及一种化妆品，所述化妆品中含有上述海参多肽。对于化妆品中上述海参多肽的用量没有特别的限定，例如，可以是0.01wt%-0.1wt%之间。
本发明另一方面还涉及上述海参多肽的制备方法，所述海参多肽通过酶解活海参得到海参多肽混合物；所述海参多肽混合物利用膜过滤系统进行超滤分离，利用分子量截留范围为1500Da和3000Da超滤膜依次对酶解产物进行分离，得到1500-3000 Da的酶解组分；所述酶解组用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离；收集具有最佳抗氧化活性的组分，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集62 %乙腈和38 %水（v/v）处的洗脱峰，得到本发明的海参多肽。
其中，在Sephadex G-50凝胶色谱分离时，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在215nm下进行测量
其中，在RP-HPLC反相高效液相色谱分离时，色谱柱为Gemini 5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。
需要说明的是，虽然可以通过海参制备本发明海参多肽，但本发明的海参多肽也可以通过固相合成法制备得到。
本发明另一方面还涉及上述海参多肽的应用，所述海参多肽用于制备抗氧化剂，或者用于制备具有抗氧化作用的化妆品。本发明还涉及上述海参多肽用于制备成纤维细胞增殖促进剂中的应用。
本发明的有益技术效果
本发明创造性的从海参多肽混合物中发现具体的活性成分，所得到的海参多肽具有强的抗氧化活性和成纤维细胞增殖活性，本发明所制备得到的海参多肽安全性高，为开发海参多肽相关制品提供了保障。
附图说明
图1是本发明的海参多肽清除DPPH自由基的“量-效”关系曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：制备海参多肽
（1）以鲜海参为原料，通过打浆、均质后制得海参浆，不调pH，木瓜蛋白酶与复合蛋白酶按照1：1的比例向海参浆中加入至质量分数2%，70℃酶解4小时后，100℃灭酶5分钟，酶解液冷却至45℃时加入风味蛋白酶至质量分数0.5%，酶解1小时，再于100℃灭酶5分钟，水解度达到77%。选择80目、150目、300目的滤材对酶解液进行初过滤后，选择20μm、5μm、1μm、0.45μm孔径的微滤膜进行负压过滤。
（2）利用膜过滤系统对海参多肽溶液进行超滤分离，利用分子量截留范围为1500Da和3000Da超滤膜依次对酶解产物进行分离，得到1500-3000 Da的酶解组分。
（3）将得到的酶解产物用Sephadex G-50（长100cm，直径2.6cm）凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.5ml/min，洗脱峰在215nm下进行测量；收集具有最佳抗氧化活性的组分，利用RP-HPLC反相高效液相色谱进行再进一步的分离，所用色谱柱为Gemini5μ C18，上样量为100μL，流速为1ml/min，检测波长为215nm。洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，收集62 %乙腈和38 %水（v/v）处的洗脱峰，得到本发明的海参多肽。
（4）利用蛋白质固相序列分析仪测定上述海参多肽的氨基酸全序列，结果显示其多肽序列为ALVYYKMMKTSRSTA 。
实施例2：海参多肽抗氧化活性测定
利用DPPH（1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl）自由基清除率测定法研究上述海参多肽的抗氧化活性。配制浓度为1×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。将2mL, 0.1mM的DPPH无水乙醇溶液加入到含有2mL不同浓度海参多肽样品的洁净试管中，混匀。室温下放置30min后，于517 nm处测定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越强，每个浓度测3次，取平均值。
清除率（%）=[1-(Ai-Aj)/A 0]×100%
式中，A0为2 mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的样品溶剂所形成的空白对照；Ai为2mL，0.1mM的DPPH无水乙醇溶液+2mL的海参多肽样品；Aj为2mL的无水乙醇+2 mL的海参多肽样品。
实验结果如图1所示，可以看出，32μg/mL海参多肽样品可以实现50%的自由基清除率。
实施例3：海参多肽促进成纤维细胞增殖
（1）成纤维细胞的培养：NIH/3T3细胞株（购于中国科学院细胞库）传代时先倒出细胞培养液，用2mL PBS清洗两次细胞，弃去液体，加入1mL质量分数0.25％的胰蛋白酶消化液3分钟至细胞完全脱壁，将细胞悬液转移至离心管中，加入2mL完全培养液终止消化，1000转/分钟离心5分钟。离心完毕后，弃去上清，加入2mL培养基充分吹打，控制细胞浓度为每1mL含1.0～5.0×105个细胞，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养。传代后24～36小时用于药理学活性测定。以上操作均在无菌条件下进行。
（2）海参多肽对成纤维细胞的作用：细胞传代24～36小时，弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成每1mL含6.0×104个细胞的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养。24小时后换成维持培养液，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养24小时。制成的细胞培养板弃去维持液，加入质量浓度为10ng/mL海参肽溶液，每孔100μL，并设置空白对照组(只加入100μL的维持培养液)和阳性对照组(加入质量浓度为10ng/mL的bFGF维持培养液)100μL，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养48小时。每孔加入MTT溶液10μL，于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度条件下培养5小时。以上操作均在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入二甲基亚砜100μL，混匀后在酶标仪上以630nm为参比波长，在570nm处测定吸光度，记录测定结果。
细胞增值率＝(实验组吸光值A570-空白对照组吸光值A570)/空白对照组吸光值A570×100％。
实验结果显示，阳性对照组的细胞增值率为21.6%，实验组的细胞增值率为39.8%。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种海参多肽，所述海参多肽的氨基酸序列为：ALVYYKMMKTSRSTA。
2.一种化妆品，所述化妆品中含有权利要求1所述的海参多肽。
3.根据权利要求2所述的化妆品，其特征在于，所述海参多肽在所述化妆品中的用量介于0.01wt%-0.1wt%之间。
4.权利要求1所述海参多肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：通过酶解活海参得到海参多肽混合物；所述海参多肽混合物利用膜过滤系统进行超滤分离，利用分子量截留范围为1500Da和3000Da超滤膜依次对酶解产物进行分离，得到1500-3000 Da的酶解组分；所述酶解组用Sephadex G-50凝胶色谱进行分离；收集具有最佳抗氧化活性的组分，利用RP-HPLC反相高效液相色谱分离，进行梯度洗脱，洗脱液自含10%乙腈和90%水（v/v）的混合液开始，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，收集62 %乙腈和38 %水（v/v）处的洗脱峰，得到海参多肽。
5.权利要求1所述海参多肽的制备方法，其特征在于，所述海参多肽通过固相合成法制备得到。
6.权利要求1所述海参多肽的应用，其特征在于，所述海参多肽用于制备具有抗氧化作用的化妆品。
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