CN107188927A - 一种竹节虾虾头多肽混合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种竹节虾虾头多肽混合物，其包含多肽Ⅰ和多肽Ⅱ；所述竹节虾虾头多肽混合物的分子量为200～1500Da，DPPH清除率大于85％；还涉及该竹节虾虾头多肽混合物的制备方法，其包括以下步骤：原料预处理；超声波辅助酶解；滤膜超滤处理以及凝胶柱处理。本发明的竹节虾虾头多肽混合物，其具有较强的抗氧化活性，并以竹节虾虾头为原料，解决了竹节虾加工过程中产生的下脚料问题；本发明将超声波处理和蛋白酶酶解结合，提高水解率，充分提取原料中的有效成分，提高提取率，且提取方式温和，不会对待提取的有效成分造成破坏，同时通过多重分离纯化、逐步筛选，获得抗氧化性强的竹节虾虾头多肽混合物。

Description

一种竹节虾虾头多肽混合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种竹节虾虾头多肽混合物及其制备方法。
背景技术
竹节虾(Penaeus japonicus)学名日本对虾，隶属于十足目、对虾科，是世界上三大养殖虾类中养殖面积和产量最大的对虾养殖品种，因其色彩艳丽且呈斑节状，故而得名，有“虾后”之誉。竹节虾不仅个体大，而且肉质鲜美，是海产品中的精品，因此很适合做寿司虾等产品。
目前，竹节虾大多数被加工成去头速冻虾肉制品，用于内销或出口，以致在加工过程中大约有35％的虾头下脚料产生，其中，虾头肉约占虾头下脚料重量的30％。由于虾头中含胃囊、口器等砂石硬质成分，无法直接食用，因此，如何对竹节虾加工中的虾头副产物进行深加工以提高产品附加值是目前亟待解决的问题。目前国内外学者对竹节虾的研究大多集中于育苗、养殖、生物学形态和习性等方面，如申请号为201410346224.8(公开号为CN104115772A)的中国发明专利《一种竹节虾的淡水养殖池管理方法》。
抗氧化性是近年来国内外科学工作者对多肽生物活性研究中的一个新课题，来源于食物蛋白的抗氧化肽，不但具有良好的抗氧化活性，而且安全性极高，因而在保健食品以及生物医药领域的应用前景十分广阔。例如：专利号为ZL201210230756.6(授权公告号为CN103524596A)的中国发明专利《一种鲨鱼蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途》、专利号为ZL201310152590.5(授权公告号为CN103194519A)的中国发明专利《一种豌豆蛋白酶解制备抗氧化肽的方法及应用》等专利均公开了食物蛋白来源的抗氧化肽。
高血压是对人类健康危害极大的一种疾病，可诱发一系列心脑血管疾病，严重时可导致死亡。血管紧张素转化酶(ACE)普遍存在哺乳动物组织中，是造成人体内血压升高的一大因素。ACE抑制剂能够抑制ACE的活性，达到降低血压的目的。目前，大多数高血压患者服用合成ACE抑制剂来控制血压的升高，合成ACE抑制剂具有作用强、见效快等特点，但对肾功能有一定的副作用。
从动植物资源中分离的ACE抑制肽，因其对正常血压没有影响，没有毒副作用等优点，因此具有十分广阔的应用前景。现有的ACE抑制肽主要由蛋白质经蛋白酶水解产生，采用的蛋白质种类繁多，主要为陆地蛋白质资源，如大豆蛋白、乳清蛋白、玉米蛋白等。此外，从海洋生物中提取蛋白制备ACE抑制肽也越来越受到人们的关注，如专利号为ZL201210176511.X(授权公告号为CN102690854B)的中国发明专利《一种利用虾壳制备血管紧张素转化酶抑制肽的方法》、专利号为ZL200610108298.3(授权公告号为CN1908009B)的中国发明专利《中国毛虾蛋白降压肽及其制备方法与应用》等。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种具有强抗氧化活性的竹节虾虾头多肽混合物。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种上述竹节虾虾头多肽混合物的制备方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种提高如上所述的竹节虾虾头多肽混合物在生物体内稳定性的方法。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种竹节虾虾头多肽混合物，其特征在于，所述竹节虾虾头多肽混合物包含多肽Ⅰ和多肽Ⅱ，该多肽Ⅰ的N端为Gly，C端为Pro，该多肽Ⅱ由疏水氨基酸组成且其C端为Phe；所述竹节虾虾头多肽混合物的分子量范围为200～1500Da，DPPH清除率大于85％。
作为优选，所述多肽Ⅰ的氨基酸序列为Gly-Asn-Gly-Leu-Pro，其具有强抗氧化性，DPPH清除率大于85％。
作为优选，所述多肽Ⅱ的氨基酸序列为His-Ala-Phe，其具有较强的抗氧化活性和强ACE抑制活性，其中ACE抑制率大于85％，使得本发明中的多肽混合物在具有强抗氧化活性的基础上，具有较好的ACE抑制活性。
作为优选，所述竹节虾虾头多肽混合物中多肽Ⅰ至少为17.13％，多肽Ⅱ至少为15.20％。
本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种如上所述的竹节虾虾头多肽混合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)原料预处理：将竹节虾虾头清洗干净，去除脂质成分，匀浆绞成肉糜备用；
(2)超声波辅助酶解：向上述肉糜加入超纯水制成溶液料液比为1:6～14w/v，调节pH值至中性，加入中性蛋白酶，45～65℃下超声波辅助酶解20～60min，酶解结束后，沸水灭活，离心取上清液得酶解溶液；
(3)滤膜超滤处理：将上述酶解溶液经滤膜超滤分离后，得分子量大于10kDa组、分子量范围为5～10kDa组、分子量范围为3～15kDa组以及分子量小于3kDa组，冻干后分别测定各组的DPPH清除率及还原力；
(4)凝胶柱处理：在滤膜超滤分离后获得的各组中，选取DPPH清除率最高的组分加超纯水配制成溶液，脱盐后，经Sephadex G-25凝胶柱分离纯化，收集各峰，冻干后测定各组的DPPH清除率，其中DPPH清除率最高的组分即为所需的竹节虾虾头多肽混合物。
作为优选，所述步骤(2)中，超声频率为10～30kHz。
作为优选，所述步骤(4)中，洗脱液为超纯水，流速为1.0mL·min-1。
本发明解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种提高如上所述的竹节虾虾头多肽混合物在生物体内稳定性的方法，其特征在于，在所述竹节虾虾头多肽混合物中加入鸡卵清蛋白，且该竹节虾虾头多肽混合物与鸡卵清蛋白的质量比为1:4～6。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明公开了一种竹节虾虾头多肽混合物，该多肽混合物包含多肽Ⅰ和多肽Ⅱ，该多肽Ⅰ的N端为Gly，C端为Pro，其中Pro能与氧结合或抑制脂质中氢的释放，延缓脂质的氧化过程，而Gly可使多肽Ⅰ对脂质自由基的捕捉作用增强；多肽Ⅱ由疏水氨基酸组成且的C端为Phe，使其具有与含不成对电子自由基的结合能力，可能发挥肽的抗氧化性；综上，使得本发明中的多肽混合物具有强抗氧化活性且DPPH清除率可达85％以上，可广泛应用于各种抗氧化产品中。
此外，本发明以竹节虾虾头为原料，来源广，成本低，解决了竹节虾加工过程中产生的下脚料问题，对进一步提高竹节虾的经济价值具有的理论意义，此外，本发明将超声波处理和蛋白酶酶解结合，提高水解率，充分提取原料中的有效成分，提高得率，且提取方式温和，不会对待提取的有效成分造成破坏，同时通过多重分离纯化、逐步筛选，获得具有强抗氧化活性的多肽混合物。
附图说明
图1为本发明实施例1中一定时间段内不同水解蛋白酶的水解度变化示意图；
图2为本发明实施例1中一定时间段内不同水解蛋白酶的DPPH清除率变化示意图；
图3为本发明实施例1中超声温度对竹节虾虾头酶解产物DPPH清除率和水解度的影响；
图4为本发明实施例1中超声时间对竹节虾虾头酶解产物DPPH清除率和水解度的影响；
图5为本发明实施例1中超声频率对竹节虾虾头酶解产物DPPH清除率和水解度的影响；
图6为本发明实施例1中料液比对竹节虾虾头酶解产物DPPH清除率和水解度的影响；
图7为本发明实施例1中超声时间和超声温度对酶解产物DPPH清除率影响的响应分析结果图；
图8为本发明实施例1中超声频率和超声温度对酶解产物DPPH清除率影响的响应分析结果图；
图9为本发明实施例1中料液比和超声温度对酶解产物DPPH清除率影响的响应分析结果图；
图10为本发明实施例1中超声频率和超声时间对酶解产物DPPH清除率影响的响应分析结果图；
图11为本发明实施例1中料液比和超声时间对酶解产物DPPH清除率影响的响应分析结果图；
图12为本发明实施例1中料液比和超声频率对酶解产物DPPH清除率影响的响应分析结果图；
图13为本发明实施例1中SHP4组分的Sephadex G-25层析图；
图14为本发明实施例1中SHP4组分的Sephadex G-25层析后各峰的DPPH清除率；
图15为本发明实施例3中SHP4-II组分的反相高效液相分离图谱；
图16为本发明实施例3中SHP-C组分的反相高效液相分离图谱；
图17为本发明实施例3中SHP-D组分的反相高效液相分离图谱；
图18为本发明实施例3中SHP-C组分分离纯化后的多肽质谱图。
图19为本发明实施例3中SHP-D组分分离纯化后的多肽质谱图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：竹节虾虾头多肽混合物的制备
1.1原料与试剂
原料：竹节虾虾头，购自舟山海圣生物有限公司。
试剂：胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶以及中性蛋白酶，上述蛋白酶均购于广西南宁庞博生物工程有限公司；Gly、Gly-Gly-Gly、维生素B12、抑肽酶、细胞色素C、牛血清白蛋白，乙腈(色谱级)、三氟乙酸(色谱级)、甲酸(色谱级)、色谱柱填料SephadexG-25(美国Sigma公司)；无水乙醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、盐酸、氢氧化钠等试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。
1.2仪器与设备
WATERS SYNAPT超高压液相色谱四级杆串联飞行时间质谱仪(美国Waters公司)；UPLC BEH C18柱(2.l ID×120mm)(美国Waters公司)；SunfireTM C18柱(4.6×250mm)(美国Waters公司)；Alliannce e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；AKTA purifier 100蛋白纯化系统(瑞典Amersham Biosciences公司)；HiTrapTM Desalting预装柱(美国GE公司)；2.6×100cm层析柱(北京满仓科技有限公司)；PelliconTM-2Mini Holder CatalogXX42PMINI超滤设备(美国MILLIPORE公司)；BT4K-ZL型冷冻干燥机(美国VIRTIS公司)；DL-720A超声波清洗器(上海双旭电子有限公司)；UV-8900紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；FJ300SH数显高速分散均质机(上海隆括仪器设备有限公司)。
1.3竹节虾虾头多肽混合物的提取分离
(1)原料预处理：将竹节虾虾头清洗干净，去除虾黄等脂质成分，用高速匀质机匀浆绞成肉糜备用。
(2)超声波辅助酶解：采用连续超声辅助酶解方式，并且通过超级恒温水浴实时控制超声辅助酶解温度，具体过程为：向上述肉糜加入超纯水制成溶液，料液比为1:6～14w/v，并调节pH值至中性，加入中性蛋白酶，45～65℃下超声波辅助酶解20～60min，，酶解结束后，沸水浴10min灭活，离心(4000r/min，10min)取上清液得酶解溶液(命名为SHP)，若离心后上清液中漂浮有少量油脂，可用吸管吸除。
(3)滤膜超滤处理：将上述酶解溶液通过0.45μm滤膜微滤分离，先后截留分子量为10kDa、5kDa和3kDa的滤膜超滤组分，得分子量大于10kDa组、分子量范围为5～10kDa组、分子量范围为3～15kDa组以及分子量小于3kDa组，冻干后分别测定各组的DPPH清除率。其中DPPH清除率的测定方法如下：取1mL水解液，加入1mL新配制浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液，混匀后在室温避光条件下反应20min，在517nm处测定吸光值为As；空白组为1mL无水乙醇代替DPPH溶液，测吸光值为Ax；对照组为1mL蒸馏水代替样品，测定吸光值为Ao；以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液进行空白调零。所有测定值均为三次平均值，DPPH自由基的清除率(DSA)计算公式为：
DSA＝[1-(As-Ax)/Ao]×100％
(4)凝胶柱处理：在滤膜超滤分离后获得的各组中，选取DPPH清除率最高的组加超纯水配制成溶液，经HiTrapTM Desalting预装柱脱盐后，经Sephadex G-25凝胶柱分离纯化，收集各峰，冻干后测定各组的DPPH清除率，其中DPPH清除率最高的组分即为所需的竹节虾虾头多肽混合物，凝胶柱分离纯化中洗脱液为超纯水，流速为1.0mL·min-1。
1.3.1水解酶的筛选
选择胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶以及中性蛋白酶五种蛋白水解酶，上述五种蛋白水解酶分别在各自最适条件下酶解竹节虾头，1～8h范围内各时间点酶解竹节虾头的水解度和DPPH自由基清除能力变化分别如图1和图2所示。
由图1可见，中性蛋白酶酶解得到的酶解液和碱性蛋白酶得到酶解液水解度相当。由图2可见，中性蛋白酶在其最适条件下的达到酶解过程中酶解液的DPPH自由基清除能力最好。综上所述，中性蛋白酶是竹节虾头抗氧化活性肽较为理想的蛋白酶。
1.3.2超声条件的确定
(1)超声温度对竹节虾虾头酶解产物抗氧化活性的影响：在超声时间为40min、超声频率为20kHz、料液比为1:8(w/v)的条件下，超声温度分别设定为45℃、50℃、55℃、60℃、65℃。
(2)超声时间对竹节虾虾头酶解产物抗氧化活性的影响：在超声温度为55℃、超声频率为20kHz、料液比为1:8(w/v)的条件下，超声时间分别设定为20min、30min、40min、50min、60min。
(3)超声频率对竹节虾虾头酶解产物抗氧化活性的影响：在超声温度为55℃、料液比为1:8(w/v)，超声时间为40min的条件下，超声频率分别设定为10kHz、15kHz、20kHz、25kHz、30kHz，。
(4)料液比对竹节虾虾头酶解产物抗氧化活性的影响：在超声温度为55℃、超声时间为40min、超声频率为20kHz的条件下，将料液比分别设定为1:6、1:8、1:10、1:12、1:14(w/v)。每组优化实验均进行三次平行实验，最终取平均值。
在单因素试验基础上，采用Design-Expert.8.0.5b软件进一步优化，以超声温度、超声时间、超声频率、料液比4个因素为自变量，酶解产物的DPPH清除率为响应值，设计四因素三水平试验，因素水平见表1。
表1响应面试验设计
超声温度对竹节虾虾头酶解产物DPPH清除率和水解度的影响如图3所示，由图3可知，超声温度对DPPH清除率及水解度有较大的影响。当超声温度小于55℃时，酶解产物的水解度随着温度的升高而增加，至55℃时，其水解度达到最高值(54.05％)，超过55℃时，水解度随着温度的升高呈下降趋势。当超声温度为55、60℃时，DPPH清除率分别为61.26％、62.00％，两者无显著性差异。这是因为适当的升温可以促进酶的活力，使水解更加充分，但过高的温度则会抑制酶活。综合考虑，本发明选择55℃为适宜的超声温度。
超声时间对竹节虾虾头酶解产物DPPH清除率和水解度的影响如图4所示，由图4可知，在超声时间为20～60min的时间范围内，虾头酶解产物的DPPH清除率和水解度均呈先上升后下降的趋势。这是因为时间过短会导致酶解反应不够充分，而时间过长酶解产物则容易转化为其他副产物，影响其得率。当超声时间为40min时，两者均达到最高值，水解度为51.28％，DPPH清除率为67.72％。因此，本发明选择40min为最佳超声时间。
超声频率对竹节虾虾头酶解产物DPPH清除率和水解度的影响如图5所示，图5可知，随着超声频率的增加，竹节虾虾头酶解产物的DPPH清除率和水解度先升高后降低，当超声频率为20kHz时，水解度和DPPH清除率最高，分别为55.15％和62.21％。这是因为随着超声频率的增加，酶和底物碰撞频率也随之增加，最终加快了酶解反应速率，但是若超声频率过大时，酶构象会发生改变，反而降低酶活，影响了酶解效果。因此，本发明选择20kHz为最佳超声频率。
料液比对竹节虾虾头酶解产物DPPH清除率和水解度的影响如图6所示，图6可知，当料液比小于1:10(w/v)时，竹节虾虾头酶解产物的DPPH清除率随着料液比的增加不断增大，当料液比大于1:10(w/v)时，DPPH清除率则不断减小。在料液比在1:6～1:8(w/v)的范围内，虾头酶解产物的水解度呈上升趋势，当料液比大于1:8(w/v)时，则水解度几乎不再增加。一般情况下，料液比过大或过小都会影响酶催化速度以及产物分子的扩散。综合考虑，本发明选取料液比1:10(w/v)较适宜，并且当料液比为1:10(w/v)时，DPPH清除率为64.66％，水解度为55.67％。
1.3.3竹节虾虾头酶解条件的响应面优化
(1)响应面分析及回归模型
综合前期的单因素试验结果，选择超声温度(A)、超声时间(B)、超声频率(C)、料液比(D)作为变量，以Design-Expert.8.0.5b软件设计中心组合试验，探究酶解的最佳工艺，试验次数为29，其中5个为中心点，试验设计和结果如表2所示。对酶解数据进行多项式回归分析，拟合得到二次回归方程：
Y＝68.40+1.27A+0.80B+3.81C-3.94D+3.52AC-11.68CD-14.43A2-11.57B2-11.23C2-14.63D2。
表2中心组合设计及结果
将上述二次回归方程进行方差分析检验，由表3方差分析的影响因素结果可知，超声温度(A)、超声时间(B)、超声频率(C)、料液比(D)4个因素在酶解过程中均起重要作用。模型F值42.27(p<0.0001)，表明该二次方程模型显著，失拟项p＝0.1353>0.05，表明失拟性不显著，综上所述，回归方程对实际试验的拟合度较高，此方程可应用于实际试验。
通过3D响应面图可以更清晰比较各个因素对响应值的影响程度。由图7～图12的Design-Expert.8.0.5b软件处理得到的响应面分析结果可知，该模型存在最大值。根据所得模型对各因素进行优化，得到最佳工艺条件为：超声温度55.35℃，超声时间40.60min，超声频率21.55kHz，料液比1:9.48(w/v)，此条件下的DPPH清除率预测值是69.58％。
一般情况下，若响应面分析法所建数学模型与实际实验值拟合度不高，则利用该模型推断进行最佳化分析所得方案可能与实际值有一定出入，为了验证该方案的可靠性，因此有必要对推断方案进行试验。将试验条件修正为超声温度55℃，超声时间40min，超声频率20kHz，料液比1:10(w/v)，以该条件做3次平行进行酶解验证，结果表明，DPPH清除率的平均值为69.50％±1.58％，通过SPSS Statistics 19软件计算，在设定显著性水平p<0.01前提下，预测值和实际值无显著性差异，表明该模型方程拟合试验数据较好，该预测模型可行。
表3回归系数模型及方差分析
注:＊＊表示差异极显著(P＜0.01)；*表示差异显著(P＜0.05)。
然而，实际试验操作中会产生热效应，尤其是超声过程中产生的热效应对酶解产物的活性会有较大影响，原因可能是随着温度升高，分子活动加强，化学键不稳定，多肽易脱氢而无法与自由基结合，从而降低酶解产物的抗氧化活性。
具体对本发明而言，由后续的实施例2可知，本发明中的虾头多肽混合物主要包括以下两种多肽：SHP-D(Gly-Asn-Gly-Leu-Pro)和SHP-C(His-Ala-Phe)。其中，SHP-D随着温度升高，分子活动加强，化学键不稳定，酶解产物易脱氢产生氢离子，无法与自由基结合，从而降低多肽的抗氧化活性，同时多肽结构Gly和Asn中的氨基和末尾的羧基易脱氢产生氢离子，进一步导致酶解产物的抗氧化活性降低；SHP-C随着分子热运动加强，多肽中精氨酸的C＝NH结构发生异构化变为C-NH2，与另外一个多肽中丙氨酸的羰基形成两个分子内环状氢键，加上苯丙氨酸中苯环的疏水性，使得多肽分子空间结构增大，与ACE结合困难，因此对ACE的抑制作用降低。
因此，本发明在上述最佳工艺条件的基础上将超声波辅助酶解条件调整为：超声温度为52℃，超声时间为35min，料液比为1:9，超声温度和超声时间的调整能从一定程度上减少热效应对多肽的影响，从而进一步保证酶解产物的抗氧化活性和ACE抑制活性，有效避免其生物活性降低，从而保证其生物学价值。
1.3.4超声辅助酶解和非超声辅助酶解的比较
由表4可知，在非超声辅助酶解的条件下，当酶解时间为2h时，其水解度最高，为34.19％；而超声波辅助酶解仅需40min，水解度就达到52.14％，说明超声辅助酶解不仅能提高酶解程度，还缩短了酶解时间，节约能源。在试验的设计范围内，超声辅助酶解虾头得到的酶解产物，其DPPH清除率最高达68.34％，比非超声辅助酶解高18.21％，说明超声辅助酶解还能够提高酶解产物的抗氧化活性。
表4超声辅助酶解和非超声辅助酶解的比较结果
1.3.5超滤处理
以超声温度55℃，超声时间40min，超声频率20kHz，料液比1:10(w/v)的优化条件制备酶解产物SHP，利用超滤分离设备对SHP进行初步分离，分别得到SHP1、SHP2、SHP3、SHP4四个组分，分别测定不同相对分子质量的抗氧化活性，结果表明，酶解产物的相对分子质量大小对其抗氧化活性具有显著性影响。其中，SHP4(<3kDa)组分的DPPH清除率和还原性均最高，分别为73.35％和0.66(如表5所示)，同时对各组分的ACE抑制活性进行测定，SHP4同样高于其他组分。可见，本发明中的竹节虾虾头多肽混合物除具有较强的抗氧化活性外，可能还具有较强的ACE抑制活性。因此，将SHP4确定为进一步研究对象。其中ACE抑制活性的测定参照Cushman(Cushman D W，Cheung H S.Spectrophoto metric assay and prprtes ofthe angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J].Biochem Pharm acol，1971，20：637-1648)的方法进行改进。以Hippuryl-His-Leu为底物，测定多肽超滤液对ACE的抑制活性，多肽HHL在ACE酶的催化下快速地分解产生马尿酸(Hip)和二肽(His-Leu，HL)，马尿酸在228nm处有最大吸收值。
表5不同相对分子质量组分的抗氧化活性
注：DPPH清除率和还原力测定肽和BHT的浓度均为2mg·mL-1。
1.3.6凝胶柱处理
将超滤分离得到的SHP4组分通过Sephadex G-25凝胶层析柱分离，以超纯水为洗脱液，样品浓度为20mg·mL-1，上样量为5.0mL，流速为1.0mL·min-1，用自动收集器收集，每管2.0mL。将同一峰的收集液合并，经冷冻干燥后分别测定各个峰的DPPH清除率。
由图13可知，经过Sephadex G-25凝胶层析分离后，样品分离得到SHP4-I、SHP4-II、SHP4-III、SHP4-IV 4个组分，组分SHP4-I最先被洗脱出来，代表该组分多肽分子量最大，组分SHP4-IV最后洗脱出来，代表分子量最小，组分SHP4-II的峰面积最大，说明该组分多肽在4个组分中含量最高。如图14所示，在多肽含量为2.0mg·mL-1时，4个组分的DPPH清除率分别为43.51％±3.45％、83.04％±2.61％、58.29％±1.67％、24.61％±3.71％，其中，组分SHP4-II的DPPH清除率最高，表明该组分含有更多具有抗氧化活性的多肽，同时对各组分的ACE抑制活性进行测定，SHP4-II同样高于其他组分。即为本发明所需的竹节虾虾头多肽混合物。将该组分的抗氧化活性与超滤液相比，DPPH清除率提高了7.83％，与标样BHT相当，说明Sephadex G-25凝胶层析达到了进一步纯化的作用。
实施例2竹节虾虾头多肽混合物分子量测定
以AKTA蛋白纯化系统凝胶色谱法测定竹节虾虾头多肽混合物分子量分布，选择Gly、Gly-Gly-Gly、维生素B12、抑肽酶、细胞色素C、牛血清白蛋白作为标准样品。AKTA蛋白纯化系统色谱条件为：流动相：0.05mol/L(pH7.2)磷酸盐缓冲液；分析柱：Superdex75 10/300GL预装柱；色谱设备：AKTA蛋白纯化系统；流速：1mL/min；检测波长：220nm。测得竹节虾虾头多肽混合物分子量为200～1500Da。
实施例3竹节虾虾头多肽混合物成分分析
3.1反相高效液相色谱处理
将上述SHP4-II组分加超纯水配制成溶液，经滤膜过滤后用反相高效液相进行分离纯化，收集各洗脱峰，浓缩后分别测定各组的DPPH清除率。反相高效液相色谱的色谱条件为：采用C18色谱柱4.6×250mm，5μm，A相为含0.1％三氟乙酸的乙腈，B相为含0.1％三氟乙酸的超纯水，柱温25℃，流速1.0mL·min-1，洗脱条件如表6所述。
表6 RP-HPLC洗脱条件
时间/min 流速/(mL·min-1) A/％ B/％
0 1.0 0 100
8 1.0 0 100
25 1.0 15 85
35 1.0 30 70
40 1.0 0 100
组分SHP4-II经RP-HPLC进一步纯化分离后，得到SHP-A、SHP-B、SHP-C、SHP-D4个主要肽峰(如图15所示)。分别收集4个峰，冻干后以DPPH清除率为指标测定其抗氧化活性，同时以ACE抑制率为指标测定其ACE抑制活性，结果得：在多肽含量为1.5mg·mL-1时，4个组分的DPPH清除率分别为45.21％±1.25％、52.66％±2.19％、63.73％±2.01％、85.69％±3.12％，组分SHP-C和SHP4-D均具有较强的抗氧化活性，其中SHP4-D抗氧化活性最强；在多肽含量为1.5mg·mL-1时，4个组分的ACE抑制率分别为52.36±0.12％、68.45±0.27％、88.19±0.57％、70.27±0.24％，组分SHP-C和SHP4-D均具有较强的ACE抑制活性，其中SHP-C的ACE抑制活性最强。
收集组分SHP-C和组分SHP-D进行纯度检测分析，以含0.1％三氟乙酸的乙腈/含0.1％三氟乙酸的超纯水为流动相，流速1.0mL·min-1，洗脱模式为含0.1％三氟乙酸的乙腈在20min内浓度由0变化到20％的线性洗脱模式，根据检测结果可知，组分SHP-C和组分SHP-D均具有较好的分离度(如图16和图17所示)
3.2SHP-C和SHP-D结构鉴定
经反相高效液相分离纯化后的ACE抑制组分SHP-C(即多肽Ⅱ)和抗氧化组分SHP-D(即多肽Ⅰ)均采用UPLC-TOF-MS/MS技术进行结构鉴定，并采用Masslynx软件中peptidesequencing对其结构进行分析，结果表明，SHP-C从SHP-C组分鉴定出1个可靠性在90％以上的多肽序列，其结构为His-Ala-Phe(如图18所示)，分子量为372.99，并且其在竹节虾虾头多肽混合物中含量为17.13％，而从SHP-D组分鉴定出1个可靠性在90％以上的多肽序列，其结构为Gly-Asn-Gly-Leu-Pro(如图19所示)，分子量为466.99，并且其在虾虾头多肽混合物中含量为15.20％。
实施例4：竹节虾虾头多肽混合物生物稳定性测定
配制人工胃液以及人工肠液备用，其中人工胃液的配制过程如下：分别量取稀盐酸16.4mL，蒸馏水800mL，将它们进行混合，再加入胃蛋白酶10g，震荡均匀，置于容量瓶中，并定容至1000mL。人工肠液的配制：称取6.8g的磷酸二氢钾，将其溶解于500mL的蒸馏水中，用0.1mol/L的NaOH溶液调节pH值至6.8，并取10g的胰蛋白酶，将其溶解在一定量的蒸馏水中，震荡均匀，并且定容到1000mL。
配制相同浓度(10mg/ml)的鸡卵清蛋白溶液和竹节虾虾头多肽混合物溶液，以(1:4、1:5、1:6)的比例混合，再加入等量的配好备用的人工胃液或肠液，添加鸡卵清蛋白溶液和人工胃液(肠液)的竹节虾虾头多肽混合物溶液在37℃的水浴锅中静置3h，再在沸水浴中15min，在转速为5000r/min、温度为-4℃的条件下离心10min后，并测定其DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率，重复实验3次，鸡卵清蛋白对竹节虾虾头多肽混合物DPPH清除率的影响如表7所示，鸡卵清蛋白对竹节虾虾头多肽混合物ABTS清除率的影响如表8所示。
表7竹节虾虾头多肽混合物DPPH清除率活性保持率/％
鸡卵清蛋白与竹节虾虾头多肽混合溶液的比例 胃蛋白酶 胰蛋白酶
未添加鸡卵清蛋白溶液 84.12±1.04 63.51±0.81
1:4 90.39±0.47 67.83±0.55
1:5 95.19±0.66 72.12±1.34
1:6 87.60±0.64 65.33±0.79
表8竹节虾虾头多肽混合物ABTS清除率活性保持率/％
鸡卵清蛋白与竹节虾虾头多肽混合溶液的比例 胃蛋白酶 胰蛋白酶
未添加卵清蛋白溶液 75.04±1.87 74.51±0.81
1:4 88.51±0.88 77.51±0.65
1:5 95.15±1.12 81.37±0.55
1:6 84.12±0.41 75.11±0.35
由上述表7和表8可知，添加鸡卵清蛋白在模拟胃液和肠液的环境下对竹节虾虾头多肽混合物均有较好的保护作用，并且与模拟肠液环境比较，鸡卵清蛋白在模拟胃液环境下对竹节虾虾头多肽混合物的生物活性具有更好的保护作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种竹节虾虾头多肽混合物及其制备方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 竹节虾（Penaeus japonicus）
<400> 1
Gly Asn Gly Leu Pro
1 5

Claims (8)

1.一种竹节虾虾头多肽混合物，其特征在于，所述竹节虾虾头多肽混合物包含多肽Ⅰ和多肽Ⅱ，该多肽Ⅰ的N端为Gly，C端为Pro，该多肽Ⅱ由疏水氨基酸组成且其C端为Phe；所述竹节虾虾头多肽混合物的分子量为200～1500Da，DPPH清除率大于85％。
2.如权利要求1所述的竹节虾虾头多肽混合物，其特征在于，所述多肽Ⅰ的氨基酸序列为Gly-Asn-Gly-Leu-Pro。
3.如权利要求1所述的竹节虾虾头多肽混合物，其特征在于，所述多肽Ⅱ的氨基酸序列为His-Ala-Phe。
4.如权利要求1所述的竹节虾虾头多肽混合物，其特征在于，所述竹节虾虾头多肽混合物中多肽Ⅰ至少为17.13％，多肽Ⅱ至少为15.20％。
5.一种如权利要求1或2或3或4所述的竹节虾虾头多肽混合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)原料预处理：将竹节虾虾头清洗干净，去除脂质成分，匀浆绞成肉糜备用；
(2)超声波辅助酶解：向上述肉糜加入超纯水制成溶液，料液比为1:6～14w/v，调节pH值至中性，加入中性蛋白酶，45～65℃下超声波辅助酶解20～60min，酶解结束后，沸水灭活，离心取上清液得酶解溶液；
(3)滤膜超滤处理：将上述酶解溶液经滤膜超滤分离后，得分子量大于10kDa组、分子量范围为5～10kDa组、分子量范围为3～15kDa组以及分子量小于3kDa组，冻干后分别测定各组的DPPH清除率；
(4)凝胶柱处理：在滤膜超滤分离后获得的各组中，选取DPPH清除率最高的组加超纯水配制成溶液，脱盐后，经Sephadex G-25凝胶柱分离纯化，收集各峰，冻干后测定各组的DPPH清除率，其中DPPH清除率最高的组分即为竹节虾虾头多肽混合物。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，超声频率为10～30kHz。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，洗脱液为超纯水，流速为1.0mL·min-1。
8.一种提高如权利要求1所述的竹节虾虾头多肽混合物在生物体内稳定性的方法，其特征在于包括以下步骤：将所述竹节虾虾头多肽混合物和鸡卵清蛋白分别配置成同浓度的溶液，并在配置的竹节虾抗氧化肽虾头多肽混合物溶液中加入上述鸡卵清蛋白溶液，且鸡卵清蛋白溶液与该竹节虾头多肽混合物溶液的体积比为1:4～6。
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