CN105111282B

CN105111282B - 一种具有ace抑制活性的核桃肽及其制备方法

Info

Publication number: CN105111282B
Application number: CN201510578683.3A
Authority: CN
Inventors: 杜明; 刘猛; 王聪; 樊凤娇; 涂茂林; 石璞洁
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2035-09-11
Also published as: CN105111282A

Abstract

本发明公开了一种具有ACE抑制活性的核桃肽及其制备方法，所述核桃肽的氨基酸序列为EPNGLLLPGY，其制备方法如下：以核桃渣为原料，选取合适的蛋白酶、根据最佳酶解工艺制备核桃降血压肽粗产品、采用膜技术耦合层析技术对核桃降血压肽进行精细化制备、采用高效液相色谱法进一步纯化、采用真空冷冻干燥或者低温喷雾干燥技术进行最终产品的制备。本发明采用核桃渣为原料开发蛋白肽，原料丰富，价格低廉，可满足大规模工业化生产；该发明对于核桃蛋白产品多样化、核桃生物活性肽在功能性食品、保健食品或者药品中的开发利用具有重要的意义。

Description

一种具有ACE抑制活性的核桃肽及其制备方法

技术领域

本发明属于食源性蛋白深加工技术领域，涉及一种以核桃渣为原料制备具有ACE抑制活性的核桃肽及其方法。

背景技术

核桃又名胡桃、羌桃，与扁桃、腰果、榛子并列为世界著名的四大干果，具有很高的食用价值，在国外，核桃被称为健脑之果、长寿之果、美容之果。核桃的药用价值也很高，中医应用广泛。我国医学认为核桃性温、味甘、无毒，有健胃、补血、润肺、养神等功效。核桃是公认的优质植物蛋白资源，核桃蛋白的营养价值与动物蛋白相近。因此，为了很好地开发核桃资源，对核桃蛋白功能性质的研究极为重要。核桃仁营养丰富，根据对核桃仁成分的分析，核桃中除油脂占到65％-70％外，核桃优质蛋白质含量占到14％-17％，其可消化率达85％。核桃蛋白质还含有18种氨基酸，除含有人体必需的8种氨基酸外，精氨酸、谷氨酸、组氨酸和酪氨酸的含量也比较高，高的精氨酸摄入量和较低的赖氨酸与精氨酸比值均可有效降低动脉粥样硬化和冠心病的发生。制备生物活性肽的方法主要包括化学水解法和生物酶解法。生物酶解法与化学水解法相比，具有反应条件温和、氨基酸受损较少、可以获得特定肽段的优势。研究表明：采用适当的蛋白酶对食源性蛋白进行水解，可获得具有一定生物活性的肽，其活性主要包括抗氧化、提高免疫力、降血压活性等。降血压肽其来源很广泛，有大豆、玉米、小麦、水产、乳清蛋白等等，目前已从牛乳蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白、腐乳、丝蛋白、豌豆蛋白、胶原蛋白、蜂王浆、蛋黄及鱼贝类蛋白等食物蛋白的酶解产物或发酵制品中分离得到了各种ACE抑制肽，然而以核桃仁为原料制备的低分子肽制品却寥寥无几。

核桃一直被作为一种益智类食品深受消费者的青睐，开发核桃蛋白肽又可以增加产品附加值。另外，我国是核桃生产最大的国家，核桃制油后废弃了大量的核桃渣，采用核桃渣为原料开发核桃蛋白肽，原料非常丰富，价格低廉，可满足大规模工业化生产，同时减少了资源的浪费，提高了核桃制品的附加值，有效地弥补了核桃深加工的欠缺。所以，研究开发核桃生物活性肽具有广阔的前景。

目前已有发明专利涉及酶解核桃蛋白制备核桃降血压肽的技术，但均从不同方面体现出一定的不足：(1)这些技术制备的核桃活性肽进行纯化后的氨基酸序列鉴定，这对于研究者理解产品的生物学机制具有一定的限制；(2)有的产品活性较低、有的产品纯度较低，对于活性肽的深度开发应用具有一定的限制性；(3)有的技术并未涉及最终产品的干燥技术，这对于实现产品的工业化生产具有一定的障碍；有的技术使用的干燥技术为传统的喷雾干燥技术，对于活性肽产品的活性可能具有一定的影响。

发明内容

根据目前核桃蛋白肽开发利用中存在的技术问题，本发明提供了一种具有ACE抑制活性的核桃肽及其制备方法。本发明对于核桃蛋白产品多样化、核桃生物活性肽在功能性食品、保健食品或者药品中的开发利用具有重要的意义。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，以核桃渣为原料，选取合适的蛋白酶、根据最佳酶解工艺制备核桃降血压肽粗产品、采用膜技术耦合层析技术对核桃降血压肽进行精细化制备、并采用高效液相色谱法进一步纯化制备、并采用真空冷冻干燥技术或者低温喷雾干燥技术进行最终产品的制备。具体制备步骤如下：

一、核桃渣前处理：取压榨油后的核桃渣(也称为核桃粕)进行粉碎，过30～100目筛子，得粉碎核桃渣样品。

二、核桃粗蛋白的制备：取粉碎后核桃渣与3～5倍重量的水混合，浸泡10～30分钟后制浆，然后用1mol/L NaOH将其pH调至7.5～9.0，在45～65℃水浴中搅拌0.5～2h，3000～6000rpm离心10min，去除油层提取上清液，将上清液的pH调到4～5，静置30～60min后，4000～8000rpm离心15～30min，采用适量去离子水洗涤至中性(pH7.0)，获得核桃粗蛋白，用95％的乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用。

三、活性肽的酶解制备：(1)配制质量百分比为3～5％的核桃蛋白溶液，充分搅拌，调节pH为1.2～2.0；(2)按照质量百分比为2～3％的添加量加入胃蛋白酶，35～40℃水浴1～2h，反应过程中调控体系pH保持在1.2～2.0；(3)反应结束后，调pH至4.5，4000～8000rpm离心5～10min，取上清液，调pH至7.0，经过3-5kD的再生纤维素膜过滤，取穿透液保存在4℃环境中备用。

四、核桃活性肽的初步纯化制备：(1)首先采用凝胶过滤层析纯化：取超滤后的核桃多肽用超纯水配成10～20mg/mL，经0.1或者0.22μm膜过滤，样品经Sephadex G-15凝胶层析柱分离，装载的样品体积为柱体积的2～10％(根据样品浓度调整)，洗脱溶液采用超纯水，洗脱速度为2～5mL/min，洗脱液体积为柱体积的1～3倍，检测波长为220nm。采用高效液相色谱法进行活性检测，对ACE具有较高抑制活性的即视为具有较高活性。收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。(2)再采用离子交换层析进行纯化：浓缩后的样品进一步采用强阴离子交换层析HiTrap Mono Q进行纯化。该层析柱预先用pH为8.0的Tris-HCl溶液平衡(缓冲溶液A)，缓冲溶液B为含有0.5～1mol/L NaCl的缓冲溶液A。装载的样品体积为柱体积的20％～50％(根据样品浓度及填料的饱和吸附量进行调整)，采用两步线性洗脱的方式进行洗脱，采用含有30～50％缓冲溶液B的混合溶液线性洗脱10～20倍柱体积，再用100％缓冲溶液B线性洗脱5～8倍柱体积，洗脱流速0.5～2mL/min。检测波长为220nm。采用高效液相色谱法进行活性检测，对ACE具有较高抑制活性的即视为具有较高活性。收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。

五、核桃活性肽的精致纯化制备：采用高效液相色谱法对核桃活性肽进行精致纯化：将由离子交换层析纯化得到的具有较强活性的样品按照重量体积比为1～5∶1(W/V)溶于含有0.1～0.2％三氟乙酸(TFA)的超纯水中，采用0.1～0.22μm滤膜过滤。流动相A为0.1～0.2％TFA-H₂O，流动相B为0.1～0.2％TFA-CH₃CN，所用洗脱溶剂需采用0.1～0.22μm滤膜过滤并超声处理，防止色谱柱中产生气泡。待基线平稳后开始上样，上样量为50～100μL。色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(9.4mm×250mm，胶粒大小5μm，孔径大小为300目)。采用二元流动相梯度洗脱系统，在30～50min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％到100％按线性关系增长。系统流速0.5～3.5mL/min，检测波长215nm，室温检测。收集各组分进行活性检测，其中活性最高组分经过多次制备收集。

六、核桃活性肽的干燥：高活性组分收集后，采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩并通过真空冷冻干燥法进行核桃活性肽的制备，控制冷阱温度-73～-40℃，真空度0.01～0.5mbar，时间3～24h，制得产品即为具有ACE抑制活性的核桃肽产品；或者通过低温喷雾干燥进行，活性多肽溶液的固形物含量范围为15～40％，真空度达到-0.01～-0.06MPa，进风温度为95～145℃，进料速度根据机器情况进行调整，物料温度控制在30～60℃。

相关检测方法：

(1)多肽(蛋白质)含量测定：

采用凯氏定氮法测定各类样品中多肽(蛋白质)含量。

(2)蛋白质提取率计算：

(3)蛋白质水解度计算

(4)样品活性测定：

高效液相色谱法测定肽活性：取不同浓度的溶液10μL，加入5μLACE溶液，在37℃条件下保持5min后加入50μL HHL溶液开始反应，在37℃条件下反应30min后加入85μL1.0moL/L HCl中止反应，得到反应液。将该反应液用0.45μm滤膜过滤后用于HPLC分析。同时用10μLpH 8.3的硼酸缓冲液替代溶液制备反应液，作为空白对照组。色谱条件：zORBAx 300SB-c18分析用色谱柱(4.6mm i.d.×150mm，填料粒径为5μm)，柱温25℃，流动相为乙腈-超纯水(体积比为25∶75，各含0.05％(体积分数)三氟乙酸及0.1％(体积分数)三乙胺)，流速0.5mL/min，检测波长228nm，自动进样，进样量5μL。对应的实验结果见表1。

不同浓度的经过纯化的核桃降血压肽对ACE酶的抑制率情况如表1所示。根据回归关系曲线计算，纯化后核桃降血压肽的ACE酶抑制率的IC₅₀值为40.5μg/mL。

表1核桃降血压肽活性测定结果

序号	样品浓度μg/mL	ACE抑制活性(％)
			1	0	0
2	20	28.1
			3	40	51.8
4	60	60.7
			5	80	72.5
6	100	79.6
			7	120	86.4

(5)质谱测定序列

采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行测定；反射检测方式；飞行管长3m；氮激光器波长337nm；加速电压20kV，反射电压23kV。基质采用a-氰基-4-羟基肉桂酸(a-CCA)；溶剂采用三氟乙酸(TFA)、乙腈(CAN)和超纯水。将a-CCA溶于含0.1％TFA的50％ ACN溶液中，制成饱和溶液，离心，取1μL上清液与1μL样品等体积混合，取1μL送入离子源中进行质谱检测，以此测定出该活性肽的氨基酸序列为EPNGLLLPGY。

(6)BLAST检索证实

将序列测定结果在用Blast软件在相应的NCBI数据库中所报道的ACE抑制活性肽的氨基酸残基序列比对检索，其首页地址为http://www.ncbi.nlm.nih.gov。研究发现该序列是首次发现，证明了该活性肽为新产品。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、采用核桃渣为原料开发蛋白肽，原料非常丰富，价格低廉，可满足大规模工业化生产。

2、本发明采用强阴离子交换层析梯度洗脱的方法，结合超滤浓缩、凝胶过滤层析和高效液相色谱相结合的方法分离出高活性的核桃肽。

3、生物活性肽它具有主动吸收、吸收速度快、吸收完整和低耗等特点。另外活性肽还具有提高免疫力、抗氧化、降低血压等功能，从生理功能上优于氨基酸和蛋白质，肽是取代氨基酸等营养物质的新兴营养品。降血压肽是能够抑制血管紧张素转换酶(Angiotension converting enzyme，简称ACE)活性的肽类，ACE是多功能酶，在体内肾素-血管紧张素系统(RAS)和激肽释放酶-激肽系统(KKS)中，对血压的调节起重要的平衡作用。在RAS系统中，ACE酶可使无活性的血管紧张素I转化为有活性的血管紧张素II，血管紧张素II可使血压升高。KKS系统是一个降血压系统，舒缓激肽是由激肽原产生的具有降血压功能的活性肽，ACE可以使舒缓激肽灭活。所以抑制ACE活性对降血压有积极的作用。降血压肽正是通过抑制ACE的活性来达到降血压的目的。

4、核桃一直被作为一种益智类食品深受消费者的青睐，开发核桃蛋白肽又可以增加产品附加值。所以，研究开发核桃生物活性肽具有广阔的前景。

附图说明

图1为从核桃渣中分离纯化具有ACE抑制活性的核桃肽流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

具体实施方式一：如图1所示，本实施方式的具有ACE抑制活性的核桃多肽的制备方法为：

一、核桃渣前处理：取压榨油后的核桃渣(也称为核桃粕)进行粉碎，过30目筛子，得粉碎核桃渣样品。

二、核桃粗蛋白的制备：取粉碎后核桃渣与3倍重量的水混合，浸泡10分钟后制浆，然后用1mol/LNaOH将其pH调至7.5，在45℃水浴中搅拌0.5h，3000rpm离心10min，去除油层提取上清液，将上清液的pH调到4.5，静置30min后，4000rpm离心20min，采用适量去离子水洗涤至中性(pH7.0)，获得核桃粗蛋白，用95％的乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用。

三、活性肽的酶解制备：配制3％的蛋白溶液，充分搅拌，调节pH为1.2。按照2％添加量加入胃蛋白酶，37℃水浴1h，反应过程中调控体系pH保持在1.2。反应结束后，调pH至4.5，4000rpm离心5min，取上清液，调pH至7.0，经过3kD的再生纤维素膜过滤，取穿透液保存在4℃环境中备用。

四、核桃活性肽的初步纯化制备：(1)取超滤后的核桃多肽用超纯水配成10mg/mL，经0.1μm膜过滤，样品经Sephadex G-15凝胶层析柱分离，装载的样品体积为柱体积的10％，洗脱溶液采用超纯水，洗脱速度为2mL/min，洗脱液体积为柱体积的1倍，检测波长为220nm。收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。(2)浓缩后的样品进一步采用强阴离子交换层析HiTrap Mono Q进行纯化。该层析柱预先用pH为8.0的Tris-HCl溶液平衡(缓冲溶液A)，缓冲溶液B为含有0.5mol/L NaCl的缓冲溶液A。装载的样品体积为柱体积的20％，采用两步线性洗脱的方式进行洗脱，采用含有30％B的混合溶液线性洗脱10倍柱体积，再用100％B线性洗脱5倍柱体积，洗脱流速0.5mL/min。检测波长为220nm。收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。

五、核桃活性肽的精致纯化制备：采用高效液相色谱法对核桃活性肽进行精致纯化：将由离子交换层析纯化得到的具有较强活性的样品按照重量体积比为1∶1(W/V)溶于含有0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯水中，采用0.1μm滤膜过滤。流动相A为0.1％TFA-H₂O，流动相B为0.1％TFA-CH₃CN，所用洗脱溶剂需采用0.1μm滤膜过滤并超声处理。待基线平稳后开始上样，上样量为50μL。色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(9.4mm×250mm，胶粒大小5μm，孔径大小为300目)。采用二元流动相梯度洗脱系统，在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％到100％按线性关系增长。系统流速0.5mL/min，检测波长215nm，室温检测。

六、核桃活性肽的真空冷冻干燥：高活性组分收集后，采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩并通过真空冷冻干燥法进行核桃活性肽的制备，控制冷阱温度-73℃，真空度0.01mbar，时间3h，制得产品即为具有ACE抑制活性的核桃肽产品，其序列为EPNGLLLPGY，ACE酶抑制率的IC₅₀值为40.5μg/mL。

具体实施方式二：如图1所示，本发明的具有ACE抑制活性的核桃多肽的制备方法为：

一、核桃渣前处理：取压榨油后的核桃渣(也称为核桃粕)进行粉碎，过50目筛子，得粉碎核桃渣样品。

二、核桃粗蛋白的制备：取粉碎后核桃渣与4倍的水混合，浸泡20分钟后制浆，然后用1mol/LNaOH将其pH调至8.5，在55℃水浴中搅拌1h，4000rpm离心10min，去除油层提取上清液，将上清液的pH调到4.5，静置30min后，5000rpm离心20min，采用适量去离子水洗涤至中性(pH7.0)，获得核桃粗蛋白，用95％的乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用。

三、活性肽的酶解制备：配制4％的蛋白溶液，充分搅拌，调节pH为1.5。按照2％添加量加入胃蛋白酶，37℃水浴1.5h，反应过程中调控体系pH保持在1.5。反应结束后，调pH至4.5，5000rpm离心5min，取上清液，调pH至7.0，经过5kD的再生纤维素膜过滤，取穿透液保存在4℃环境中备用。

四、核桃活性肽的初步纯化制备：(1)首先采用凝胶过滤层析纯化：取超滤后的核桃多肽用超纯水配成15mg/mL，经0.22μm膜过滤，样品经Sephadex G-15凝胶层析柱分离，装载的样品体积为柱体积的5％(根据样品浓度调整)，洗脱溶液采用超纯水，洗脱速度为3mL/min，洗脱液体积为柱体积的2倍，检测波长为220nm。采用高效液相色谱法进行活性检测，收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。(2)再采用离子交换层析进行纯化。浓缩后的样品进一步采用强阴离子交换层析HiTrap Mono Q进行纯化。该层析柱预先用pH为8.0的Tris-HCl溶液平衡(缓冲溶液A)，缓冲溶液B为含有0.7mol/L NaCl的缓冲溶液A。装载的样品体积为柱体积的30％，采用两步线性洗脱的方式进行洗脱，采用含有50％B的混合溶液线性洗脱15倍柱体积，再用100％B线性洗脱6倍柱体积，洗脱流速1mL/min。检测波长为220nm。采用高效液相色谱法进行活性检测，收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。

五、核桃活性肽的精致纯化制备：采用高效液相色谱法对核桃活性肽进行精致纯化：将由离子交换层析纯化得到的具有较强活性的样品按照重量体积比为3∶1(W/V)溶于含有0.15％三氟乙酸(TFA)的超纯水中，采用0.15μm滤膜过滤。流动相A为0.15％TFA-H2O，流动相B为0.15％TFA-CH3CN，所用洗脱溶剂需采用0.1μm滤膜过滤并超声处理。待基线平稳后开始上样，上样量为80μL。色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(9.4mm×250mm，胶粒大小5μm，孔径大小为300 目)。采用二元流动相梯度洗脱系统，在30min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％到100％按线性关系增长。系统流速2mL/min，检测波长215nm，室温检测。

六、核桃活性肽的真空冷冻干燥：高活性组分收集后，采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩并通过真空冷冻干燥法进行核桃活性肽的制备，控制冷阱温度-63℃，真空度0.05mbar，时间12h，制得产品即为具有ACE抑制活性的核桃肽产品，其序列为EPNGLLLPGY，ACE酶抑制率的IC₅₀值为40.5μg/mL。

具体实施方式三：如图1所示，本发明的具有ACE抑制活性的核桃多肽的制备方法为：

一、核桃渣前处理：取压榨油后的核桃渣(也称为核桃粕)进行粉碎，过100目筛子，得粉碎核桃渣样品。

二、核桃粗蛋白的制备：取粉碎后核桃渣与5倍的水混合，浸泡30分钟后制浆，然后用1mol/LNaOH将其pH调至9.0，在65℃水浴中搅拌2h，6000rpm离心10min，去除油层提取上清液，将上清液的pH调到4.5，静置30min后，8000rpm离心20min，采用适量去离子水洗涤至中性(pH7.0)，获得核桃粗蛋白，用95％的乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用。

三、活性肽的酶解制备：配制5％的蛋白溶液，充分搅拌，调节pH为2.0。按照3％添加量加入胃蛋白酶，37℃水浴2h，反应过程中调控体系pH保持在2.0。反应结束后，调pH至4.5，8000rpm离心5min，取上清液，调pH至7.0，经过5kD的再生纤维素膜过滤，取穿透液保存在4℃环境中备用。

四、核桃活性肽的初步纯化制备：(1)首先采用凝胶过滤层析纯化：取超滤后的核桃多肽用超纯水配成20mg/mL，经0.22μm膜过滤，样品经Sephadex G-15凝胶层析柱分离，装载的样品体积为柱体积的2％(根据样品浓度调整)，洗脱溶液采用超纯水，洗脱速度为5mL/min，洗脱液体积为柱体积的3倍，检测波长为220nm。采用高效液相色谱法进行活性检测，收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。(2)再采用离子交换层析进行纯化。浓缩后的样品进一步采用强阴离子交换层析HiTrap Mono Q进行纯化。该层析柱预先用pH为8.0的Tris-HCl溶液平衡(缓冲溶液A)，缓冲溶液B为含有1mol/L NaCl的缓冲溶液A。装载的样品体积为柱体积的50％(根据样品浓度及填料的饱和吸附量进行调整)，采用两步线性洗脱的方式进行洗脱，采用含有50％B的混合溶液线性洗脱20倍柱体积，再用100％B线性洗脱8倍柱体积，洗脱流速2mL/min。检测波长为220nm。收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。

五、核桃活性肽的精致纯化制备：采用高效液相色谱法对核桃活性肽进行精致纯化：将由离子交换层析纯化得到的具有较强活性的样品按照重量体积比为5∶1(W/V)溶于含有0.2％三氟乙酸(TFA)的超纯水中，采用0.22μm滤膜过滤。流动相A为0.2％TFA-H₂O，流动相B为0.2％TFA-CH3CN，所用洗脱溶剂需采用0.22μm滤膜过滤并超声处理，防止色谱柱中产生气泡。待基线平稳后开始上样，上样量为100μL。色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(9.4mm×250mm，胶粒大小5μm，孔径大小为300目)。采用二元流动相梯度洗脱系统，在50min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％到100％按线性关系增长。系统流速3.5mL/min，检测波长215nm，室温检测。活性最高组分经过多次制备收集。

六、核桃活性肽的真空冷冻干燥：高活性组分收集后，采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩并通过真空冷冻干燥法进行核桃活性肽的制备，控制冷阱温度-40℃，真空度0.5mbar，时间24h，制得产品即为具有ACE抑制活性的核桃肽产品，其序列为EPNGLLLPGY，ACE酶抑制率的IC₅₀值为40.5μg/mL。

具体实施方式四：如图1所示，本发明的具有ACE抑制活性的核桃多肽的制备方法为：

二、核桃粗蛋白的制备：取粉碎后核桃渣与3倍的水混合，浸泡30分钟后制浆，然后用1mol/LNaOH将其pH调至9.0，在55℃水浴中搅拌2h，3000rpm离心10min，去除油层提取上清液，将上清液的pH调到4.5，静置30min后，4000rpm离心20min，采用适量去离子水洗涤至中性(pH7.0)，获得核桃粗蛋白，用95％的乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用。

三、活性肽的酶解制备：配制3％的蛋白溶液，充分搅拌，调节pH为2.0。按照3％添加量加入胃蛋白酶，37℃水浴1h，反应过程中调控体系pH保持在2.0。反应结束后，调pH至4.5，4000rpm离心5min，取上清液，调pH至7.0，经过3kD的再生纤维素膜过滤，取穿透液保存在4℃环境中备用。

四、核桃活性肽的初步纯化制备：(1)首先采用凝胶过滤层析纯化：取超滤后的核桃多肽用超纯水配成15mg/mL，经0.1μm膜过滤，样品经Sephadex G-15凝胶层析柱分离，装载的样品体积为柱体积的3％(根据样品浓度调整)，洗脱溶液采用超纯水，洗脱速度为3mL/min，洗脱液体积为柱体积的3倍，检测波长为220nm。采用高效液相色谱法进行活性检测，收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。(2)再采用离子交换层析进行纯化。浓缩后的样品进一步采用强阴离子交换层析HiTrap Mono Q进行纯化。该层析柱预先用pH为8.0的Tris-HCl溶液平衡(缓冲溶液A)，缓冲溶液B为含有1mol/L NaCl的缓冲溶液A。装载的样品体积为柱体积的20％，采用两步线性洗脱的方式进行洗脱，采用含有30％B的混合溶液线性洗脱15倍柱体积，再用100％B线性洗脱6倍柱体积，洗脱流速1.5mL/min。检测波长为220nm。收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。

五、核桃活性肽的精致纯化制备：采用高效液相色谱法对核桃活性肽进行精致纯化：将由离子交换层析纯化得到的具有较强活性的样品按照重量体积比为3∶1(W/V)溶于含有0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯水中，采用0.22μm滤膜过滤。流动相A为0.1％TFA-H₂O，流动相B为0.1％TFA-CH₃CN，所用洗脱溶剂需采用0.22μm滤膜过滤并超声处理，防止色谱柱中产生气泡。待基线平稳后开始上样，上样量为100μL。色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱(9.4mm×250mm，胶粒大小5μm，孔径大小为300目)。采用二元流动相梯度洗脱系统，在40min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0％到100％按线性关系增长。系统流速3.5mL/min，检测波长215nm，室温检测。其中活性最高组分经过多次制备收集。

六、核桃活性肽的真空冷冻干燥：高活性组分收集后，采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩并通过真空冷冻干燥法进行核桃活性肽的制备，控制冷阱温度-55℃，真空度0.1mbar，时间18h，制得产品即为具有ACE抑制活性的核桃肽产品，其序列为EPNGLLLPGY，ACE酶抑制率的IC₅₀值为40.5μg/mL。

具体实施方式五：如图1所示，本发明的具有ACE抑制活性的核桃多肽的制备方法为：

四、核桃活性肽的初步纯化制备：(1)首先采用凝胶过滤层析纯化：取超滤后的核桃多肽用超纯水配成15mg/mL，经0.1μm膜过滤，样品经Sephadex G-15凝胶层析柱分离，装载的样品体积为柱体积的5％(根据样品浓度调整)，洗脱溶液采用超纯水，洗脱速度为3mL/min，洗脱液体积为柱体积的3倍，检测波长为220nm。采用高效液相色谱法进行活性检测，收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。(2)再采用离子交换层析进行纯化。浓缩后的样品进一步采用强阴离子交换层析HiTrap Mono Q进行纯化。该层析柱预先用pH为8.0的Tris-HCl溶液平衡(缓冲溶液A)，缓冲溶液B为含有1mol/L NaCl的缓冲溶液A。装载的样品体积为柱体积的20％，采用两步线性洗脱的方式进行洗脱，采用含有30％B的混合溶液线性洗脱15倍柱体积，再用100％B线性洗脱6倍柱体积，洗脱流速1.5mL/min。检测波长为220nm。收集活性较高的组分并采用截留分子量为500D的再生纤维素膜进行浓缩。

六、核桃活性肽的低温喷雾干燥：高活性组分收集后，通过低温喷雾干燥进行，活性多肽溶液的固形物含量范围为30％，真空度达到-0.04MPa，进风温度为120℃，进料速度为根据机器情况进行调整，这时物料温度将控制在40℃。制得产品即为具有ACE抑制活性的核桃肽产品，其序列为EPNGLLLPGY，ACE酶抑制率的IC₅₀值为40.5μg/mL。

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Claims

1.一种具有ACE抑制活性的核桃肽，其特征在于所述核桃肽的氨基酸序列为EPNGLLLPGY。

2.一种权利要求1所述具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，其特征在于所述制备方法步骤如下：

一、核桃渣前处理：取压榨油后的核桃渣进行粉碎，过30~100目筛子，得粉碎核桃渣样品；

二、核桃粗蛋白的制备：取粉碎后核桃渣与3~5倍重量的水混合，浸泡10~30分钟后制浆，然后调pH至7.5~9.0，在45~65℃水浴中搅拌0.5~2h，3000~6000rpm离心10min，去除油层提取上清液，将上清液的pH调到4~5，静置30~60min后，4000~8000rpm离心15~30min，采用去离子水洗涤至中性，获得核桃粗蛋白，用乙醇洗涤两次，冷冻干燥备用；

三、活性肽的酶解制备：（1）配制质量百分比为3~5%的核桃蛋白溶液，充分搅拌，调节pH为1.2~2.0；（2）按照质量百分比为2~3%的添加量加入胃蛋白酶，35~40℃水浴1~2h，反应过程中调控体系pH保持在1.2~2.0；（3）反应结束后，调pH至4.5，4000~8000 rpm离心5~10min，取上清液，调pH至7.0，经过再生纤维素膜过滤，取穿透液保存在4℃环境中备用；

四、核桃活性肽的初步纯化制备：（1）采用凝胶过滤层析纯化：取超滤后的核桃多肽用超纯水配成10~20mg/mL，经膜过滤，样品经Sephadex G-15凝胶层析柱分离，采用高效液相色谱法进行活性检测，收集对ACE具有较高抑制活性的组分并采用再生纤维素膜进行浓缩；（2）采用离子交换层析进行纯化：浓缩后的样品进一步采用强阴离子交换层析HiTrap MonoQ进行纯化，采用高效液相色谱法进行活性检测，收集对ACE具有较高抑制活性的组分并采用再生纤维素膜进行浓缩；

五、核桃活性肽的精致纯化制备：采用高效液相色谱法对核桃活性肽进行精致纯化，收集各组分进行活性检测，其中活性最高组分经过多次制备收集；

六、核桃活性肽的干燥：高活性组分收集后，采用再生纤维素膜进行浓缩并通过真空冷冻干燥法或者采用低温喷雾干燥的方式进行核桃活性肽的制备，制得产品即为具有ACE抑制活性的核桃肽产品。

3.根据权利要求2所述的具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，其特征在于所述步骤三中，再生纤维素膜的截留分子量为3-5kD。

4.根据权利要求2所述的具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，其特征在于所述步骤四中，经0.1或者0.22μm膜过滤。

5.根据权利要求2所述的具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，其特征在于所述步骤四中，Sephadex G-15凝胶层析柱分离要求如下：装载的样品体积为柱体积的2~10%，洗脱溶液采用超纯水，洗脱速度为2~5mL/min，洗脱液体积为柱体积的1~3倍，检测波长为220nm。

6.根据权利要求2所述的具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，其特征在于所述步骤四和六中，再生纤维素膜的截留分子量为截留分子量为500D。

7.根据权利要求2所述的具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，其特征在于所述步骤四中，采用强阴离子交换层析HiTrap Mono Q进行纯化的方法如下：层析柱预先用缓冲溶液A平衡，装载的样品体积为柱体积的20%~50%，采用两步线性洗脱的方式进行洗脱，采用含有30%~50%缓冲溶液B的混合溶液线性洗脱10~20倍柱体积，再用100%缓冲溶液B线性洗脱5~8倍柱体积，洗脱流速0.5~2mL/min，检测波长为220nm。

8.根据权利要求7所述的具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，其特征在于所述缓冲溶液A为pH为8.0的Tris-HCl溶液，缓冲溶液B为含有0.5~1mol/L NaCl的缓冲溶液A。

9.根据权利要求2所述的具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，其特征在于所述步骤五中，采用高效液相色谱法对核桃活性肽进行精致纯化的方法如下：将由离子交换层析纯化得到的具有较强活性的样品按照重量体积比为1~5 ：1（W/V）溶于含有0.1%~0.2%三氟乙酸的超纯水中，采用0.1~0.22μm滤膜过滤，流动相A为0.1~0.2% TFA-H₂O，流动相B为0.1%~0.2% TFA-CH₃CN，所用洗脱溶剂需采用0.1~0.22μm滤膜过滤并超声处理，防止色谱柱中产生气泡；待基线平稳后开始上样，上样量为50~100μL，色谱柱为硅胶烷基键合相C18柱，采用二元流动相梯度洗脱系统，在30~50 min内，流动相B在洗脱剂中的含量从0%到100%按线性关系增长，系统流速0.5~3.5 mL/min，检测波长215 nm，室温检测。

10.根据权利要求2所述的具有ACE抑制活性的核桃肽的制备方法，其特征在于所述步骤六中，真空冷冻干燥条件如下：冷阱温度-73~-40℃，真空度0.01~0.5mbar，时间3~24h；低温喷雾干燥条件如下：溶液的固形物含量为15~40%，真空度达到-0.01~-0.06 MPa，进风温度为95~145℃，物料温度控制在30~60℃。