CN102924592B

CN102924592B - 鹰嘴豆种子中蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂的提取分离方法

Info

Publication number: CN102924592B
Application number: CN201210500059.8A
Authority: CN
Inventors: 麻浩; 王占奎; 顾爱星; 葛杰; 马洪雨; 苑炜
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2012-11-29
Publication date: 2014-12-31
Anticipated expiration: 2032-11-29
Also published as: CN102924592A

Abstract

本发明属于食品科学生物活性成分分离纯化领域，涉及一种鹰嘴豆种子中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的提取分离方法。本发明以鹰嘴豆成熟种子为材料，经提取液浸提-适温加热-硫酸铵分级沉淀-离子交换色谱-高效液相反相色谱对鹰嘴豆种子中所含蛋白类型α-淀粉酶抑制剂进行分离纯化。目前，经多次实验证明，采用此提取方法可分离到两种蛋白类型α-淀粉酶抑制剂，其中一个属鹰嘴豆清蛋白，分子量约为25.0kDa，具植物凝集素作用，在NCBI中基因序列号为gi339961380；另一个属鹰嘴豆球蛋白，分子量约为60.0kDa，在NCBI中基因序列号为gi75266099。该分离方法得到目的蛋白多，纯度高，α-淀粉酶抑制活性强，提取程序简便，是一套适用于鹰嘴豆种子中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的提取分离方法。

Description

鹰嘴豆种子中蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂的提取分离方法

技术领域

本发明属于食品科学生物活性成分分离纯化领域，涉及一种鹰嘴豆种子中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的提取分离方法，具体涉及一种以鹰嘴豆成熟种子为材料，经提取液浸提-适温加热-硫酸铵分级沉淀-离子交换色谱-高效液相反相色谱对鹰嘴豆种子中所含蛋白类型α-淀粉酶抑制剂进行分离纯化的新方法。

背景技术

α-淀粉酶抑制剂可有效地抑制人肠道内唾液中α-淀粉酶及胰淀粉酶的活性，阻碍食物中碳水化合物的水解和消化，降低人体糖分吸收以及血糖和血脂的含量，减少脂肪合成，减轻体重，这在医药和保健食品行业上，可用于开发糖尿病人专用食品，减肥药，食品添加剂等；同时由于α-淀粉酶抑制剂对哺乳动物、昆虫以及微生物的α-淀粉酶有很强的特异性抑制作用，其杀虫机理在于能抑制昆虫消化道内α-淀粉酶的活性，使昆虫食入的淀粉不能水解消化，从而阻断了昆虫的主要能量来源；而且α-淀粉酶抑制剂和昆虫淀粉消化酶结合形成EI复合物，也会刺激昆虫的消化腺过量分泌消化酶，通过神经系统的反馈，使昆虫产生厌食反应，导致发育不良或死亡，这在生物农药上，可为设计新型无毒无污染抗虫、抗菌药物，减少环境污染等提供良好的实验材料，在作物品质育种方面，可为转基因抗病虫农作物新品种的培育提供基因源，既具有重要的理论意义，又具有广阔的应用前景。

鹰嘴豆(Cicer arietinum)是世界上第三大豆科作物，极度耐旱耐瘠薄，主要种植在干旱和半干旱地区，在我国新疆已有2500年的种植历史，是我国维吾尔族人民喜爱的一种副食品，也是新疆维吾尔族人民常用药材，在新疆农业生产、人民生活和生态环境保护中有着重要作用。近年来鹰嘴豆种子中许多活性成分已引起国内外研究者的广泛重视和兴趣。因此，研究和开发鹰嘴豆籽粒中所含的蛋白质类α-淀粉酶抑制剂，这不仅可为鹰嘴豆的开发利用提供思路，促进新疆鹰嘴豆的生产，进一步发挥其在解决新疆土壤干旱、退化、沙化等问题中不可替代的作用；同时还可为其蛋白质类α-淀粉酶抑制剂在医药和保健食品行业、生物制药、生物农药开发以及作物抗病虫基因工程育种等方面应用提供理论和基因基础。

由于鹰嘴豆种子蛋白含量丰富，从众多的种子蛋白中分离得到具有α-淀粉酶抑制剂活性的蛋白物质具有很大的难度，各项纯化技术过程的选择和优化条件需要合理选择和合理的参数设置。以新疆鹰嘴豆种子为材料，建立适用于鹰嘴豆种子中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的分离纯化技术，可为开发利用鹰嘴豆重要种质资源和优良保健成分提供实验基础和参考。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种鹰嘴豆种子中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的提取分离方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种适宜于鹰嘴豆种子中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的提取分离方法，包含如下步骤：

（1）采用成熟收获的鹰嘴豆种子，晒干，磨碎的豆粉；

（2）制备的豆粉，按5mL蛋白提取液：1g豆粉比例加入预冷的蛋白提取液，4℃充分搅拌混合3h；蛋白提取液为pH=8.0，且含有500mmol/L NaCl、2mmol/L PMSF、1％β-巯基乙醇和10mmol/L EDTA-Na₂的10mmol/L的Tris-HCl缓冲液；

（3）混合物于12000×g，4℃下离心10min，取上清液；

（4）上清液70℃水浴5min，期间不断摇动使液体受热均匀，于12000×g，4℃下离心10min，取上清液，即为α-淀粉酶抑制剂的粗提液；

（5）将α-淀粉酶抑制剂粗提液进行硫酸铵分级沉淀，收集各级沉淀物；

（6）分别取具有较高α-淀粉酶抑制活性的硫酸铵饱和度60％-80％和80％-100％的分级沉淀透析除盐，透析结束后冷冻干燥；

（7）对两种透析除盐后的硫酸铵分级蛋白沉淀，分别利用离子交换色谱进行蛋白纯化分离，收集具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白进行透析除盐，并在冷冻干燥机上冷冻干燥。

所述的离子交换色谱条件如下：

①液相色谱仪采用AKTA prime蛋白纯化系统，离子交换柱为HiPrep16/10Q XL；

②缓冲液A为20mmol/L的Tris-HCl，pH=8.0，缓冲液B为1.0mol/L的NaCl；

③用Tris-HCl（20mmol/L，pH=8.0）溶解蛋白粉末，蛋白浓度为40mg/mL，上样体积为2mL，缓冲液流速为3mL/min，洗脱体积为200mL；

④洗脱方式采用梯度洗脱；

（8）硫酸铵饱和度60％-80％分级蛋白沉淀上样活性峰出峰时间为37min，硫酸铵饱和度80％-100％分级蛋白沉淀上样活性峰出峰时间也为37min。对上一步得到的两种具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白，分别进一步采用高效反相液相色谱法进行蛋白纯化分离，收集具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白成分真空冷冻干燥，即制备得到两种蛋白类型α-淀粉酶抑制剂冻干粉。所述的高效反相液相色谱条件如下：

①液相色谱仪采用AKTA purifier液相系统；

②缓冲液A为含0.05％TFA的超纯水，缓冲液B为含0.05％TFA的乙腈；

③用超纯水溶解蛋白粉末，蛋白浓度为5mg/mL，上样体积为100μL，缓冲液流速为1.0mL/min，洗脱梯度乙腈5％-100％；

④洗脱方式采用梯度洗脱。

（9）从硫酸铵饱和度80％-100％分级蛋白沉淀分离得到的具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白浓缩后经SDS-PAGE电泳，测得其分子量约为25.0kDa，此SDS-PAGE电泳蛋白条带经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（MALDI TOF-TOF）鉴定，并根据获得的肽段信息，经网上搜索比对NCBI数据库，确定该纯化所得蛋白为一种鹰嘴豆清蛋白，具植物凝集素作用，其在NCBI中基因序列号为gi|339961380；从硫酸铵饱和度60％-80％分级蛋白沉淀分离得到的具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白浓缩后经SDS-PAGE电泳，测的其分子量约为60kDa，此SDS-PAGE电泳蛋白条带经LC-MS/MS鉴定，并根据获得的肽段信息，经网上搜索比对NCBI数据库，确定此蛋白为一种鹰嘴豆球蛋白，其在NCBI中基因序列号为gi|75266099。

其中步骤（1）所述的豆粉优选磨碎至能过60目筛。

所述的硫酸铵分级沉淀优选包含如下步骤：

①将α-淀粉酶抑制剂粗提液在冰水浴中平衡到0℃，逐渐加入硫酸铵粉末，当溶液中硫酸铵饱和度达到40％时，继续冰浴中静置2h；

②4℃下12000×g离心30min，收集沉淀并做标记，上清液重新返回0℃冰水浴；

③继续向上清液中加入硫酸铵固体直到达到饱和度60％，继续冰浴中静置2h；

④重复步骤②一次；

⑤继续向上清液中加入硫酸铵固体直到达到饱和度80％，继续冰浴中静置2h；

⑥重复步骤②一次；

⑦继续向上清液中加入硫酸铵固体直到达到饱和度100％，继续冰浴中静置2h；

⑧重复步骤②一次；

所述的α-淀粉酶抑制剂活性测定采用如下方法：

25μL的人唾液α-淀粉酶与等体积的蛋白类型α-淀粉酶抑制剂提取液于37℃水浴中共培养30min后，加入400μL的1％可溶性淀粉溶液，37℃水浴中继续处理10min后，加入250μL 的DNS溶液终止反应，迅速经沸水浴处理10min，用流水冷却，加水稀释到一定的体积，546nm下测定吸光值，蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的相对抑制率（即α-淀粉酶抑制剂活性）的计算公式表示如下：

相对抑制率（％）=（A_对照-A_样品）/A_对照×100

其中，A_对照|代表酶的吸光值；A_样品代表样品的吸光值。

所述的高效反相液相色谱法优选使用Resource RPC反相柱。

有益效果

由于鹰嘴豆种子中富含多种蛋白，从众多种类的鹰嘴豆蛋白中分离获得具有α-淀粉酶抑制剂活性的蛋白物质成为挖掘鹰嘴豆应用价值的重大挑战，本发明建立了一套适合于鹰嘴豆中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的分离纯化方法。

本套发明方法首先对鹰嘴豆种子中总蛋白进行制备，然后再采用硫酸铵分级沉淀—离子交换色谱—高效反相液相色谱方法对其中所含蛋白类型α-淀粉酶抑制剂进行分离提取。经本发明方法可从鹰嘴豆种子中分离制备到两种蛋白类型α-淀粉酶抑制剂，制备的蛋白量多、纯度好、α-淀粉酶抑制剂的抑制活性高，是一种可广泛应用于植物种子中蛋白类型α-淀粉酶抑制剂分离制备的新工艺。

附图说明

图1Desi型鹰嘴豆种子中硫酸铵分级蛋白沉淀（60％-80％）离子交换色谱分离图谱（箭头所指此峰共收集到3管，α-淀粉酶抑制活性测定结果分别为：45.45％、44.67％和42.42％）。

图2Desi型鹰嘴豆种子中硫酸铵分级蛋白沉淀（80％-100％）离子交换色谱分离图谱（箭头所指此峰所测定的α-淀粉酶抑制活性为87.42％）。

图3Desi型鹰嘴豆种子蛋白经硫酸铵分级蛋白沉淀（60％-80％）以及离子交换色谱分离后的活性部分高效液相反相色谱分离图（箭头所示部分为具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白组分）。

图4Desi型鹰嘴豆种子蛋白经硫酸铵分级蛋白沉淀（60％-80％）以及离子交换色谱-高效液相反相色谱分离后的活性部分SDS-PAGE电泳图（箭头所示部分为具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白组分）。

图5Desi型鹰嘴豆种子蛋白经硫酸铵分级蛋白沉淀（80％-100％）以及离子交换色谱分离后的活性部分高效液相反相色谱分离图（箭头所示部分为具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白组分）。

图6Desi型鹰嘴豆种子蛋白经硫酸铵分级蛋白沉淀（80％-100％）以及离子交换色谱-高效液相反相色谱分离后的活性部分SDS-PAGE电泳图（箭头所示部分为具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白组分）。

具体实施方式

实施例1：

采用美国Beckmen高速低温离心机、液相色谱AKTA系统。

(1)采用成熟收获的鹰嘴豆种子，晒干去除瘪粒和杂质后，采用籽粒饱满的种子，在实验室-20℃以下保存备用。

(2)将鹰嘴豆种子放入快速粉碎机中磨碎，过60目筛，获得精细豆粉，-20℃条件下保存备用。

(3)制备的精细豆粉，按5mL蛋白提取液：1g豆粉比例加入预冷的蛋白提取液，4℃充分搅拌混合3h。蛋白提取液配制方法：10mmol/L的Tris-HCl，pH=8.0（包含500mmol/L的NaCl，2mmol/L的PMSF，1％的β-巯基乙醇和10mmol/L的EDTA-Na₂）。

(4)混合物12000×g，4℃下离心10min，取蛋白提取上清液。

(5)蛋白提取上清液70℃水浴5min，期间不断摇动使液体受热均匀。

(6)重复步骤（4）一次，收集到的蛋白上清液即为α-淀粉酶抑制剂的粗提液，放置4℃备用。

(7)将α-淀粉酶抑制剂粗提液在冰水浴中平衡到0℃，逐渐加入硫酸铵粉末，充分搅拌均匀溶解，进行硫酸铵分级沉淀。硫酸铵分级沉淀具体操作步骤如下：

①当溶液中硫酸铵饱和度达到40％时（每100mL提取液中加入22.6g硫酸铵固体），继续冰浴中静置2h；

③继续向上清液中加入硫酸铵固体直到达到饱和度60％（每100mL上清液中加入15.3g硫酸铵固体），继续冰浴中静置2h；

④重复步骤②一次；

⑤继续向上清液中加入硫酸铵固体直到达到饱和度80％（每100mL上清液中加入12.9g硫酸铵固体），继续冰浴中静置2h；

⑥重复步骤②一次；

⑦继续向上清液中加入硫酸铵固体直到达到饱和度100％（每100mL上清液中加入13.9g 硫酸铵固体），继续冰浴中静置2h；

⑧重复步骤②一次。

(8)收集到的各组分蛋白沉淀物采用透析袋透析除盐，透析结束后在真空冷冻干燥机上冷冻干燥。

(9)分别取具有较高α-淀粉酶抑制活性的硫酸铵60％-80％分级沉淀(硫酸铵盐饱和度由60％增加到80％所沉淀的蛋白)和80％-100％分级沉淀(硫酸铵盐饱和度由80％增加到100％所沉淀的蛋白)，用于离子交换色谱进一步进行蛋白分离纯化，检测α-淀粉酶抑制活性，并分别收集具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白进行透析除盐，并在冷冻干燥机上冷冻干燥。

此过程中离子交换色谱条件如下：

①液相色谱仪采用AKTA prime蛋白纯化系统，离子交换柱为HiPrep16/10QXL；

②缓冲液A为20mmol/L的Tris-HCl，pH=8.0，缓冲液B为1.0mol/L的NaCl；

③上样体积为2mL，缓冲液流速为3mL/min，洗脱体积为200mL；

④洗脱方式采用梯度洗脱，洗脱梯度如图所示。

Desi型鹰嘴豆种子中硫酸铵分级蛋白沉淀（60％-80％）离子交换色谱分离图谱见图1，箭头所指此峰共收集到3管，α-淀粉酶抑制活性测定结果分别为：45.45％、44.67％和42.42％。Desi型鹰嘴豆种子中硫酸铵分级蛋白沉淀（80％-100％）离子交换色谱分离图谱见图2，箭头所指此峰所测定的α-淀粉酶抑制活性为87.42％。

(10)对上述两种具有α-淀粉酶抑制剂活性的蛋白，进一步分别采用高效反相液相色谱进行蛋白纯化分离，收集具有α-淀粉酶抑制活性的成分真空冷冻干燥，即制备得到两种蛋白类型α-淀粉酶抑制剂冻干粉。

此过程中高效反相液相色谱条件如下：

①液相色谱仪采用AKTA purifier液相系统，反相柱子为Resource RPC反相柱；

②缓冲液A为含0.05％TFA的超纯水，缓冲液B为含0.05％TFA的CAN；

③上样体积为100μL，缓冲液流速为1.0mL/min，洗脱梯度乙腈浓度（5％-100％）；

④洗脱方式采用梯度洗脱，洗脱梯度如图所示。

Desi型鹰嘴豆种子蛋白经硫酸铵分级沉淀（60％-80％）以及离子交换色谱分离后的活性部分高效液相反相色谱分离图见图3，箭头所示部分为具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白组分，此峰所测定的α-淀粉酶抑制活性为80.85％；

Desi型鹰嘴豆种子蛋白经硫酸铵分级沉淀（80％-100％）以及离子交换色谱分离后的活性部分高效液相反相色谱分离图见图5，箭头所示部分为具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白组分，此峰所测定的α-淀粉酶抑制活性为85.02％；

(11)从硫酸铵饱和度80％-100％沉淀蛋白分离得到的具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白浓缩后经SDS-PAGE电泳，测得其蛋白分子量约为25.0kDa，此SDS-PAGE电泳蛋白条带经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（MALDI TOF-TOF）鉴定，得到以下蛋白肽段：

①GKEVYLFK（SEQ ID NO.1）

②TMEAYLFK（SEQ ID NO.2）

③VLYGPSFVR（SEQ ID NO.3）

④NNEAYLFINDK（SEQ ID NO.4）

⑤VLYG PSFVRDGYK（SEQ ID NO.5）

⑥TNEAYLFKGEYYAR（SEQ ID NO.6）

⑦INFTPGSTNDIMGGVKK（SEQ ID NO.7）

⑧GTIFEAGMDSAFASHKTNEAYLFK（SEQ ID NO.8）

根据这些肽段信息，经网上搜索比对NCBI数据库，确定该纯化所得蛋白为鹰嘴豆清蛋白的一种，具植物凝集素作用，其在NCBI中基因序列号为gi|339961380；

从硫酸铵饱和度60％-80％沉淀蛋白分离得到的具有α-淀粉酶抑制活性的蛋白浓缩后经SDS-PAGE电泳，测的其蛋白分子量约为60kDa，此SDS-PAGE电泳蛋白条带经LC-MS/MS鉴定，得到以下蛋白肽段：

①RDFLEDALNVNRR（SEQ ID NO.9）

②KSEGGLIETWNPSNKQ（SEQ ID NO.10）

③LHQNIGSSSSPDIYNPQAGR（SEQ ID NO.11）

④YQQEGSEEEENEGGNIFSGFK（SEQ ID NO.12）

⑤FYLAGNHEQEFLR（SEQ ID NO.13）

根据获得的肽段信息，经网上搜索比对NCBI数据库，确定此蛋白为一种鹰嘴豆球蛋白，其在NCBI中基因序列号为gi|75266099。

本发明蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的抑制活性测定采用Ishimoto的方法并作适当调整修改如下：

25μL的人唾液α-淀粉酶与等体积的蛋白类型α-淀粉酶抑制剂提取液于37℃水浴中共培养30min后，加入400μL的1％可溶性淀粉溶液，37℃水浴中继续处理10min后，加入250μL 的DNS溶液终止反应，迅速经沸水浴处理10min，用流水冷却，加水稀释到一定的体积，546nm下测定吸光值。

蛋白类型α-淀粉酶抑制剂的相对抑制率的计算公式表示如下：

相对抑制率（％）=（A_对照-A_样品）/A_对照×100

其中，A_对照|代表酶的吸光值；A_样品代表样品的吸光值。

整个提取过程中蛋白溶液需保持在低温条件（4℃），所用溶液用纯水或纯水配制，蛋白溶液应保持在pH=8.0条件下。

Claims

1.一种适宜于鹰嘴豆种子中蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂的提取分离方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)采用成熟收获的鹰嘴豆种子，晒干，磨碎成豆粉；

(2)制备的豆粉，按5mL蛋白提取液：1g豆粉比例加入预冷的蛋白提取液，4℃充分搅拌混合3h；蛋白提取液为pH＝8.0，且含有500mmol/L NaCl、2mmol/L PMSF、1％β‐巯基乙醇和10mmol/L EDTA‐Na₂的10mmol/L的Tris‐HCl缓冲液；

(3)混合物于12000×g，4℃下离心10min，取上清液；

(4)上清液70℃水浴5min，期间不断摇动使液体受热均匀，于12000×g，4℃下离心10min，取上清液，即为α‐淀粉酶抑制剂的粗提液；

(5)将α‐淀粉酶抑制剂粗提液进行硫酸铵分级沉淀，收集各级沉淀物；

(6)分别取具有较高α‐淀粉酶抑制活性的硫酸铵饱和度60％‐80％和80％‐100％的分级蛋白沉淀透析除盐，透析结束后冷冻干燥；

(7)对上述两种透析除盐后的硫酸铵分级蛋白沉淀，分别利用离子交换色谱进行蛋白纯化分离，收集具有α‐淀粉酶抑制活性的蛋白进行透析除盐，并在冷冻干燥机上冷冻干燥；

所述的离子交换色谱条件如下：

②缓冲液A为20mmol/L的Tris‐HCl，pH＝8.0，缓冲液B为1.0mol/L的NaCl；

③用20mmol/L，pH＝8.0Tris‐HCl溶解蛋白粉末，蛋白浓度为40mg/mL，上样体积为2mL，缓冲液流速为3mL/min，洗脱体积为200mL；

④洗脱方式采用梯度洗脱；

(8)硫酸铵饱和度60％‐80％分级蛋白沉淀上样活性峰出峰时间为37min，硫酸铵饱和度80％‐100％分级蛋白沉淀上样活性峰出峰时间也为37min，对上一步得到的两种具有α‐淀粉酶抑制活性的蛋白，分别进一步采用高效反相液相色谱法进行蛋白纯化分离，收集具有α‐淀粉酶抑制活性的蛋白成分真空冷冻干燥，即制备得到两种蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂冻干粉；

所述的高效反相液相色谱条件如下：

①液相色谱仪采用AKTA purifier液相系统，使用Resource RPC反相柱；

③用超纯水溶解蛋白粉末，蛋白浓度为5mg/mL，上样体积为100μL，缓冲液流速为1.0mL/min，洗脱梯度乙腈浓度为5％‐100％；

④洗脱方式采用梯度洗脱；

(9)从硫酸铵饱和度80％‐100％分级蛋白沉淀分离得到的具有α‐淀粉酶抑制活性的蛋白浓缩后经SDS‐PAGE电泳，测得其分子量约为25.0kDa，此SDS‐PAGE电泳蛋白条带经基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI TOF‐TOF)鉴定，并根据获得的肽段信息，经网上搜索比对NCBI数据库，确定该纯化所得蛋白为一种鹰嘴豆清蛋白，具植物凝集素作用，其在NCBI中基因序列号为gi|339961380；从硫酸铵饱和度60％‐80％分级蛋白沉淀分离得到的具有α‐淀粉酶抑制活性的蛋白浓缩后经SDS‐PAGE电泳，测得其分子量约为60kDa，此SDS‐PAGE电泳蛋白条带经LC‐MS/MS鉴定，并根据获得的肽段信息，经网上搜索比对NCBI数据库，确定此蛋白为一种鹰嘴豆球蛋白，其在NCBI中基因序列号为gi|75266099。

2.根据权利要求1所述的适宜于鹰嘴豆种子中蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂的提取分离方法，其特征在于步骤(1)所述的豆粉需磨碎至能过60目筛。

3.根据权利要求1所述的适宜于鹰嘴豆种子中蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂的提取分离方法，其特征在于所述的硫酸铵分级沉淀具体为：

①将α‐淀粉酶抑制剂粗提液在冰水浴中平衡到0℃，逐渐加入硫酸铵粉末，当溶液中硫酸铵饱和度达到40％时，继续冰浴中静置2h；

④重复步骤②一次；

⑥重复步骤②一次；

⑧重复步骤②一次。

4.根据权利要求1所述的适宜于鹰嘴豆种子中蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂的提取分离方法，其特征在于蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂抑制活性的测定采用如下方法：

25μL的人唾液α‐淀粉酶与等体积的蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂提取液于37℃水浴中共培养30min后，加入400μL的1％可溶性淀粉溶液，37℃水浴中继续处理10min后，加入250μL的DNS溶液终止反应，迅速经沸水浴处理10min，用流水冷却，加水稀释到一定的体积，546nm下测定吸光值，蛋白类型α‐淀粉酶抑制剂的相对抑制率的计算公式表示如下：

相对抑制率(％)＝(A_对照–A_样品)/A_对照×100

其中，A_对照l代表酶的吸光值；A_样品代表样品的吸光值。