CN103937864B

CN103937864B - 一种从鳀鱼中分离的活性多肽

Info

Publication number: CN103937864B
Application number: CN201410173125.4A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 于小航; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2014-04-26
Filing date: 2014-04-26
Publication date: 2016-01-13
Anticipated expiration: 2034-04-26
Also published as: CN103937864A

Abstract

本发明的目的是提供一种从鳀鱼发酵液中分离的活性多肽，本发明得到的抗神经细胞损伤多肽分子量为2,181Da；由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，是一种新型的具有活性的多肽。本发明获得的多肽在谷氨酸盐对神经细胞损伤模型中，本发明的活性多肽的加入可以显著提高PC12神经细胞的存活率，在终浓度为50μg/mL时，细胞存活率与损伤组比较提高了26.4％，有效地减轻了谷氨酸盐诱导的神经细胞损伤。另外，对其神经细胞保护作用的细胞机理研究发现，活性多肽的加入显著增加了胞内的总抗氧化能力，且对SOD活力的增加有一定促进作用。

Description

一种从鳀鱼中分离的活性多肽

技术领域

本发明属于多肽分离技术领域，具体涉及一种从鳀鱼中分离的活性多肽，具有抗神经细胞损伤的功能。

背景技术

鳀鱼广泛分布于太平洋西北部、新西兰、澳大利亚、印度洋、非洲东岸及南非沿岸等南北半球的温带水域，是世界上单一渔业品种产量最高的鱼种，系集群性小型中上层鱼类，资源丰富。由于鳀鱼富含脂肪、酶活高、易被氧化而腐烂变质，因此不能长期储存，我国俗称“离水烂”。我国东海、黄海和渤海均产之，资源丰富，年渔获量可达几十万吨。长期以来由于对其利用价值认识不足，未被大规模的开发利用。而随着人们生活水平的提高，鳀鱼很少直接食用，大多仅被简单加工成养殖用的饲料、鱼糜；而且在加工过程中会产生大量鳀鱼副产物，这些副产物如果随意丢弃而不加以利用会带来极大的环境污染及资源浪费。鳀鱼有很高的营养价值，含有8种人体必须氨基酸、不饱和脂肪酸和牛磺酸，另外还富含维生素A、E等。此外，鳀鱼及其加工副产物作为一种重要的海洋蛋白资源，在氨基酸组成和序列上与陆地生物蛋白资源有很大差异，且在种类和数量上都远远大于陆地及淡水蛋白资源，然而这些资源并未得到充分利用。如果能将其进一步开发和利用，将大幅提高鳀鱼及其副产物的附加值，为充分利用这一海洋资源开辟新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种从鳀鱼发酵液中分离的活性多肽，从而弥补现有技术的不足。

本发明的活性多肽，是从鳀鱼中分离的，其制备方法包括如下的步骤：

1)将鳀鱼浓缩液加入2～6倍体积的水后，再加入鳀鱼浓缩液重量1～8％的蛋白酶，在40～70℃下酶解2～24h制成酶解液；

其中鳀鱼浓缩液将鳀鱼或鳀鱼加工的副产物粉碎，过滤除去杂质后，滤液在80～100℃加热0.5～10h至粘稠半固态状得到的；

2)在步骤1)的酶解液中加入鳀鱼酶解液重量1％～10％的麸皮，灭菌后接入米曲霉发酵3～7d获得发酵液；

3)将步骤2)制备的发酵液过滤，滤液灭菌后得到鳀鱼发酵母液成品；

4)将步骤3)得到的鳀鱼发酵母液成品进行冷冻干燥成干粉后，再用超纯水溶解，溶解液通过滤膜过滤后，滤液用葡聚糖G-15进行分离，上样量为0.2～2mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.2～2mL/min，检测波长为220nm，分管收集洗脱27～30min的洗脱液；

5)将步骤4)得到的洗脱液浓缩后用DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析进行分离纯化：浓缩后的样品上pH7.5～8.5的5mMTris-HCl缓冲液平衡的DEAE-SepharoseFF离子交换柱，采用浓度为2mol/LNaCl梯度洗脱，流速为0.2～2mL/min，检测波长为220nm，分管收集洗脱3～6min的洗脱液；

6)将步骤5)得到的组份进一步过SB-C₁₈半制备柱，柱温25℃，上样量20～100μL，紫外波长220nm，流速0.5～2mL/min，流动相A为乙腈，流动相B中含0.1～1％的三氟乙酸；分管收集12～13.5min的洗脱液，干燥后即为分离的抗神经细胞损伤活性多肽。

本发明得到的抗神经细胞损伤多肽分子量为2,181Da。

上述方法制备的活性多肽，用4.6×250nm的XDB-C₁₈分析柱测定分离多肽的纯度；流速为0.5～2mL/min，其中流动相A为甲醇，流动相B为水。

上述的蛋白酶包括各种来源的蛋白酶：植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶等)；以及各种条件的蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等)以及各种蛋白酶按照一定比例复配得到的复合蛋白酶(风味蛋白酶等)。

本发明的活性多肽分子量为2,181Da，由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，是一种新型的具有活性活性的多肽。本发明获得的多肽在谷氨酸盐对神经细胞损伤模型中，本发明的活性多肽的加入可以显著提高PC12神经细胞的存活率，在终浓度为50μg/mL时，细胞存活率与损伤组比较提高了26.4％，有效地减轻了谷氨酸盐诱导的神经细胞损伤。另外，对其神经细胞保护作用的细胞机理研究发现，活性多肽的加入显著增加了胞内的总抗氧化能力，且对SOD活力的增加有一定促进作用。

附图说明

图1：G-15凝胶柱层析洗脱图谱；

图2：P₂洗脱峰获得的多肽的DEAE-SepharoseFF离子交换柱色谱图；

图3：峰A获得的多肽的反相高效液相色谱图；

图4：f₃洗脱峰获得的多肽的纯度鉴定图谱；

图5：f₃洗脱峰的一级和二级质谱图；

图6：f₃洗脱峰获得的多肽对谷氨酸盐诱导的PC12细胞损伤的影响图；

图7：培养细胞形态学图片。

具体实施方式

本发明的活性多肽是把鳀鱼浓缩液进行酶解，加入麸皮后灭菌，接入米曲霉后发酵后，再依次经过G-15凝胶色谱柱、DEAE-SepharoseFF阴离子交换色谱柱以及SB-C₁₈半制备柱分离纯化制得的，制备过程以抗神经细胞损伤活性的筛选为指标，制备步骤如下

1)将鳀鱼浓缩液加入鳀鱼浓缩液体积2～6倍的水后，同时加入鳀鱼浓缩液重量1～8％的蛋白酶，在40～70℃下酶解2～24h，温度升至85～100℃，加热5～20min使酶失活。

2)把步骤1制得的鳀鱼酶解液加入鳀鱼酶解液重量的1％～10％的麸皮，121℃灭菌20min，冷却至室温后接入米曲霉发酵3～7d。

3)把步骤2得到的发酵液用纱布过滤、100℃灭菌20min后得到鳀鱼发酵母液成品。

4)将步骤3得到的鳀鱼发酵母液成品用冷冻干燥机进行浓缩后，过膜后的样品首先用葡聚糖G-15进行分离，上样量为0.2～2mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为0.2～2mL/min，检测波长为220nm，分管收集吸光值大于0.1且具有抗神经细胞损伤活性的组分。

抗神经细胞损伤活性的测定方法为：将PC12细胞按每孔5×10³个左右接种于96孔板，当细胞生长汇合率达到70～80％时，用含8％胎牛血清DMEM培养液换液，加入收集的多肽样品，每个浓度设定3个平行，培养3h后，每孔加入最佳成模浓度的谷氨酸盐(10mmol/L)，继续培养24h。另设空白、模型(损伤)组。用结晶紫染色法测定其吸光值。设定空白组的平均吸光度值为100％，其余组与之比较即得细胞存活率(细胞的存活率与其吸光度值呈正比)，细胞存活率大于模型(损伤)组的即为有抗神经细胞损伤活性的组分。

5)将步骤4得到的具有最高抗神经细胞损伤活性组份浓缩后进一步用DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析进行分离纯化。浓缩后的样品上5mMTris-HClpH7.5～8.5缓冲液平衡的DEAE-SepharoseFF离子交换柱(18×80mm)，采用浓度为0～2mol/LNaCl梯度洗脱，流速为0.2～2mL/min，检测波长为220nm，分管收集吸光值大于0.1且具有抗神经细胞损伤活性的组分。

6)将步骤5得到的具有最高抗神经细胞损伤活性的组分进一步过SB-C₁₈(9.4×250mm)半制备柱，柱温25℃，上样量20～100μL，紫外波长220nm，流速0.5～2mL/min，流动相A为乙腈，流动相B中含0.1～1％的三氟乙酸，按照一定的洗脱程序进行洗脱。

对步骤6得到的具有最高抗神经细胞损伤活性的组分用XDB-C₁₈分析柱(4.6×250nm)进行纯化；流速为0.5～2mL/min，流动相A为甲醇，流动相B为水，洗脱至纯度达到95％以上。

步骤1中的蛋白酶包括各种来源的蛋白酶：植物蛋白酶(如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶等)、微生物蛋白酶(如枯草杆菌蛋白酶、链霉菌蛋白酶等)；以及各种条件的蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶等)以及各种蛋白酶按照一定比例复配得到的复合蛋白酶(风味蛋白酶等)。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1鳀鱼发酵母液的制备

将鳀鱼副产物用绞碎机绞碎后进行粗滤除杂，然后在80℃加热2h至粘稠半固态状得到鳀鱼浓缩液；将鳀鱼浓缩液按照(1:3，w/w)的比例加入水，混匀后加入鳀鱼浓缩液重量3％的风味蛋白酶，60℃酶解5h，得到鳀鱼酶解液。将得到的鳀鱼酶解液中加入酶解液重量5％的麸皮，121℃灭菌20min，接入米曲霉，30℃发酵，发酵周期为3d。发酵结束后将得到的发酵液用纱布过滤，100℃灭菌20min，得到鳀鱼发酵母液成品。

对鳀鱼发酵母液及发酵前的酶解液理化指标进行了测定，测定结果见表1：

表1：鳀鱼发酵前后各项指标的测定

注：**表示与鳀鱼酶解液比较，P<0.01

由表1可以看出，经过发酵后得到的发酵液水解度、DPPH清除率和模型组细胞存活率要显著高于鳀鱼酶解液(分别为1.5倍、2倍和1.67倍)。另外，经过发酵后氨基态氮和还原糖的含量也有所增加，而总酸和总氮含量略有降低。

实施例2活性肽G-15凝胶层析

将得到的鳀鱼发酵母液成品用冷冻干燥机冻成干粉后，用超纯水溶解，配成浓度为0.1g/mL的溶液，过0.45μm的无机水膜，上G-15凝胶色谱柱进行分离，上样量为1mL，以蒸馏水为洗脱液，流速为1mL/min，检测波长为220nm，收集抗神经细胞损伤活性最高的组分。

如图1所示，通过G-15凝胶层析柱后样品分成三个洗脱峰，洗脱时间分别为16.5～18.5min(P₁峰)、27～30min(P₂峰)、30～36min(P₃峰)，对三个峰的抗神经细胞损伤活性进行测定，发现P₂峰的抗神经细胞损伤活性最高，收集P₂峰，准备下一步上DEAE-SepharoseFF离子交换柱分离纯化。

实施例3活性多肽的DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析

将上一步得到的具有最高抗神经细胞损伤活性的P₂峰进一步用DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析进行分离纯化，浓缩后的样品上5mMTris-HCl(pH8.5)缓冲液平衡的DEAE-SepharoseFF离子交换柱(18×80mm)，采用浓度为0～2mol/LNaCl梯度洗脱，流速为1mL/min，检测波长为220nm，收集抗神经细胞损伤活性最高的组份，用Tris-HCl溶液进行透析后，冷冻干燥。活性多肽DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析结果见图2。

如图2，P₂过DEAE-SepharoseFF后成三个洗脱峰，洗脱时间分别为3～6min(峰A)，13～20min(峰B)，32～37min(峰C)，对三个峰的抗神经细胞损伤活性进行测定，发现峰A峰的抗神经细胞损伤活性最高，大量收集峰A，冻干后准备上SB-C₁₈半制备柱行进一步分离纯化。

实施例4活性多肽SB-C₁₈半制备柱精制

将上一步得到的具有最高抗神经细胞损伤的组份峰A进一步过SB-C₁₈(9.4×250mm)半制备柱，柱温25℃，上样量20μL，紫外波长220nm，流速1mL/min，流动相A为乙腈，流动相B中含0.1％的三氟乙酸，按照流动相A：流动相B为1：9的比例进行洗脱，收集抗神经细胞损伤活性最高组份的峰尖，冻干即得到本发明的多肽。活性多肽峰A过SB-C₁₈半制备柱分离结果见图3。

由图3可以看出，峰A过SB-C₁₈半制备柱后成三个洗脱峰，洗脱时间分别为10～10.5min(峰f₁)，10.5～11.5min(峰f₂)，12～13.5min(峰f₃)，对三个峰的抗神经细胞损伤活性进行测定，发现峰f₃的抗神经细胞损伤活性最高，收集峰f₃的峰尖，测定其纯度。

实施例5活性多肽的鉴定

将上一步得到的活性多肽用XDB-C₁₈分析柱(4.6×250nm)于220nm下测定组份的纯度。流速为0.5～2mL/min，流动相A为甲醇，流动相B为水，按照流动相A：流动相B为1：8的比例进行洗脱。

活性多肽分子量、氨基酸序列以及氨基酸组成的测定方法如下，

活性多肽分子量与氨基酸序列的测定：活性多肽的分子量及序列分析采用ESI-QqTOF电喷雾-串联四极杆-飞行时间质谱法测定。质谱分析条件：离子源电压5.0kV，碰撞气体N₂，检测方式为正离子模式。质谱分析方法：首先用TOF-MS模式进行全扫描分析，得到待测物的[M+2H]²⁺准分子离子峰后，再利用子离子扫描模式对[M+2H]²⁺进行MS/MS分析。逐渐调节碰撞电压，使[M+2H]²⁺丰度占基峰的50％～80％，然后进行数据采集。

活性多肽的氨基酸组成分析：取经纯化的活性多肽，用6mol/L的HCl在110℃水解22h，将水解后的样品全部转移至旋转蒸发仪内蒸干，用0.1mol/L的HCl溶解定容后进行柱前衍生，以SykamS433D氨基酸分析柱(SYKAMGmbH,Eresing,nearMunich,Germany)进行氨基酸组成的测定。

对活性多肽纯度的进行测定，结果见图4，可以看出，峰f₃的纯度达到95％左右，达到质谱检测的要求。下一步把收集到的f₃峰上质谱测定其分子量及氨基酸序列。

f₃分子量及氨基酸序列的测定如图5所示，从一级质谱可以看出f₃的分子量为2,181Da，对二级质谱进行解析，发现二级质谱没有完全包含了其所有碎片，分析原因可能是由于电子撞击能量太高，一个分子量为1,000左右的肽段直接断裂，导致无法对单个多肽进行测序。

f₃的氨基酸组成见表2，由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，是一种新型的具有活性活性的多肽。谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和赖氨酸是f₃主要组成氨基酸，占总氨基酸的70％左右；其中2种芳香族氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)以及组氨酸分别占氨基酸总量的30.65％和10.73％。

表2：f₃的氨基酸组成

实施例6活性多肽的活性测定

将PC12细胞按每孔5,000个左右接种于96孔板，细胞生长汇合率达70～80％时，用含8％胎牛血清DMEM培养液换液，加入不同稀释浓度的多肽样品(实施例4中洗脱的f₃峰)(终浓度分别为0，10，50，100μg/mL)，每个浓度设定平行的3个孔，培养3h后，每孔加入10mM的谷氨酸盐，继续培养24h。

另设空白、模型组。用结晶紫法测定细胞的存活率(细胞的存活率与其吸光度值呈正比)，测定结果见图6。

PC12细胞预先用不同浓度的f₃孵育3h，与模型组细胞比较，其测得的吸光度值有所变化。结果表明，经过f₃处理后，细胞存活率显著增大，说明f₃对细胞有明显的保护作用，且随着浓度的增大，对细胞的保护作用越强，并且浓度从10μg/mL增加到50μg/mL时细胞存活率显著增加，而从50μg/mL增加到100μg/mL时细胞存活率的增加逐渐减缓。

在该损伤模型中，观察正常组细胞突起明显，呈梭形，贴壁性良好；而损伤组在10mM谷氨酸盐造模培养24h后，细胞肿胀，突起消失或断裂，贴壁性差，突触断裂，大量细胞圆缩，脱落。而加入f₃能够有效保护的细胞，形态无明显改变，或损伤程度减轻，贴壁良好，偶见部分突触断裂，细胞状态接近于正常形态，因此可以说明活性多肽f₃能明显改善神经细胞谷氨酸盐损伤，见图7。结果表明本实施例分离的活性多肽f₃能通过增强本身抗氧化系统的功能，从多个环节阻断谷氨酸盐的损伤或者是通过保护细胞膜、线粒体膜而促进SOD合成。

Claims

1.一种活性多肽，其特征在于，所述的活性多肽的制备方法包括如下的步骤：

6)将步骤5)得到的洗脱液组份过SB-C₁₈半制备柱，柱温25℃，上样量20～100μL，紫外波长220nm，流速0.5～2mL/min，流动相A为乙腈，流动相B中含0.1～1％的三氟乙酸；分管收集12～13.5min的洗脱液，干燥后即为活性多肽；其多肽分子量为2,181Da。

2.如权利要求1所述的活性多肽，其特征在于，所述的步骤1)中鳀鱼浓缩液是将鳀鱼或鳀鱼加工的副产物粉碎，过滤除去杂质后，滤液在80～100℃加热0.5～10h至粘稠半固态状得到的。

3.如权利要求1所述的活性多肽，其特征在于，所述的步骤1)中的蛋白酶为植物蛋白酶、动物蛋白酶、微生物蛋白酶中的任一种或几种。

4.如权利要求3所述的活性多肽，其特征在于，所述的植物蛋白酶为木瓜蛋白酶和/或菠萝蛋白酶。

5.如权利要求3所述的活性多肽，其特征在于，所述的动物蛋白酶为胃蛋白酶和/或胰蛋白酶。

6.如权利要求3所述的活性多肽，其特征在于，所述的微生物蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶和/或链霉菌蛋白酶。

7.权利要求1所述的活性多肽的纯度测定方法，其特征在于，所述的测定方法是将活性多肽用4.6×250nm的XDB-C₁₈分析柱测定纯度；其流速为0.5～2mL/min，其中流动相A为甲醇，流动相B为水。

8.权利要求1所述的活性多肽在制备抗神经细胞损伤制品中的应用。

9.一种抗神经细胞损伤制品，其特征在于，所述的制品包含有药理有效浓度的权利要求1所述的活性多肽。