CN108179163A - 从鳀鱼皮中提取活性多肽方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，具体步骤如下：1）取新鲜鳀鱼，取鳀鱼皮洗净，匀浆，于‑20℃至‑30℃冷藏备用；2）解冻并将匀浆后的鳀鱼皮按固液比4‑6:1加入去离子水，于42‑50℃条件下恒温搅拌，调pH值，加入酶制剂，酶解4‑6h，酶解过程中在酶解液中通入氮气；3）将酶解液进行灭酶处理，调pH至中性，离心，取上清液，得鳀鱼活性多肽，本发明对鳀鱼多肽的提取率高且多肽中的芳香性氨基酸含量高，提取的多肽对自由基清除率很高。

Description

从鳀鱼皮中提取活性多肽方法

技术领域

本发明属于生物多肽提取技术领域，具体涉及一种从鳀鱼皮中提取活性多肽方法。

背景技术

鳀鱼是一种生活在温带海洋中上层的小型鱼类，是其它经济鱼类的饵料生物。温水性中上层鱼类，趋光性较强，幼鱼更为明显。小型鱼，产卵鱼群体长为75~140毫米，体重5~20克。"海鯅"即为幼鳀鱼加工的咸干品，但是鳀鱼营养价值极高，富含蛋白质，含有人体必需的8种氨基酸，特别是其中的脯氨酸、亮氨酸及芳香性氨基酸的肽具有自由基清除能力。

我国鳀鱼资源丰富，仅黄海、东海鳀鱼的现有资源量约300万吨左右，由于鳀鱼性成熟早，生殖周期短，生殖率高，繁殖周期短，年捕捞量超50-70万吨，目前，鳀鱼除了提炼鱼油，鳀鱼常作为鲜活饵料或加工成饲料鱼粉，加工利用率低，对水体污染严重，对于鳀鱼下脚料的利用还有待开发。

现有技术提供了多种鳀鱼活性多肽提取方法，例如中国发明授权专利文献，授权公告号：CN 103937864 B，本发明的目的是提供一种从鳀鱼发酵液中分离的活性多肽，本发明得到的抗神经细胞损伤多肽分子量为 2,181Da ；由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，是一种新型的具有活性的多肽。本发明获得的多肽在谷氨酸盐对神经细胞损伤模型中，本发明的活性多肽的加入可以显著提高 PC12 神经细胞的存活率，在终浓度为 50μg/mL 时，细胞存活率与损伤组比较提高了 26.4％，有效地减轻了谷氨酸盐诱导的神经细胞损伤。另外，对其神经细胞保护作用的细胞机理研究发现，活性多肽的加入显著增加了胞内的总抗氧化能力，且对 SOD 活力的增加有一定促进作用，但是该方法操作略显复杂，在活性多肽得率上还有待提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多肽提取率高且多肽中的芳香性氨基酸含量高，提取的多肽对自由基清除率高的一种从鳀鱼皮中提取活性多肽方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，具体步骤如下：

1）取新鲜鳀鱼，取鳀鱼皮洗净，匀浆，于-20℃至-30℃冷藏备用；

2）解冻并将匀浆后的鳀鱼皮按固液比4-6:1加入去离子水，于42-50℃条件下恒温搅拌，调pH值，加入酶制剂，酶解4-6h，酶解过程中在酶解液中通入氮气；

3）将酶解液进行灭酶处理，调pH至中性，离心，取上清液，得鳀鱼活性多肽，上述方法通过酶解法提取鳀鱼活性多肽，反应条件温和、反应效率高，不存在逆反应，提取的鳀鱼活性多肽分子量在2000-3000Da之间，由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，具有很好的体外抗氧化能力，经试验发现，提取的鳀鱼活性多肽能有效提高血清及组织的 SOD 活性、GSH-Px 活性和T-AOC 值。

优选的，步骤2中的去离子水中含有0.06-0.15wt%的L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸的混合体，L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸重量比为52~58:0.3~0.7，通过在去离子水中加入的混合体可使鳀鱼细胞膜下形成小孔，致使细胞内的物质泄漏，提高活性多肽的得率，并且避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性。

优选的，步骤2中每隔30-40min在酶解液中通入氮气，通入量为20-30g/h，通入的氮气可使鳀鱼活性多肽结构中的芳香族氨基酸的酚腔基基团能够作为有效电子供体，提高制备的鳀鱼活性多肽中的芳香性氨基酸含量，增强鳀鱼活性多肽的抗氧化效果。

优选的，步骤2中调pH值至6.5-7.2，加入酶制剂，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶3-7份、木瓜蛋白酶6-10份和胰蛋白酶1-2份，利用生物酶催化的酶促反应所具有的专一性特点，选择中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，将鳀鱼蛋白分解为多肽，提高多肽得率和多肽中的氨基酸数量。

优选的，灭酶处理为：将酶解液置于95-100℃条件下加热5-10min，终止酶解反应，防止酶解反应过度。

优选的，步骤3中于2-6℃条件下8000-10000r/min离心10-15min，取上清液，得鳀鱼活性多肽，提高多肽得率和纯度。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：通过酶解法提取鳀鱼活性多肽，反应条件温和、反应效率高，不存在逆反应，提取的鳀鱼活性多肽分子量在2000-3000Da之间，在去离子水中加入的混合体可使鳀鱼细胞膜下形成小孔，致使细胞内的物质泄漏，提高活性多肽的得率提取率在7.8%以上，纯度可达82%，鳀鱼活性多肽由天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸等十一种氨基酸组成，具有很好的体外抗氧化能力，经试验发现，提取的鳀鱼活性多肽能有效提高血清及组织的SOD 活性、GSH-Px 活性和T-AOC值，对DPPH自由基的清除能力强。

附图说明

图1为实施例4中不同鳀鱼肽剂量对DPPH自由基的清除率折线图；

图2为实施例4中各组小鼠组织SOD活性统计图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，具体步骤如下：

1）取新鲜鳀鱼，取鳀鱼皮洗净，匀浆，于-25℃℃冷藏备用；

2）解冻并将匀浆后的鳀鱼皮按固液比4:1加入去离子水，去离子水中含有0.08wt%的L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸的混合体，L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸重量比为57:0.4，于46℃条件下恒温搅拌，调pH值至7.0，加入酶制剂，，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶4份、木瓜蛋白酶8份和胰蛋白酶1份，酶解4h，酶解过程中在酶解液中通入氮气，每隔35min在酶解液中通入氮气，通入量为27g/h；

3）将酶解液置于98℃条件下加热6min灭酶处理，调pH至中性，于4℃条件下10000r/min离心12min，取上清液，得鳀鱼活性多肽。

实施例2：

从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，具体优选步骤如下：

1）取新鲜鳀鱼，取鳀鱼皮洗净，匀浆，于-27℃冷藏备用；

2）解冻并将匀浆后的鳀鱼皮按固液比6:1加入去离子水，去离子水中含有0.15wt%的L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸的混合体，L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸重量比为52:0.5，于48℃条件下恒温搅拌，调pH值至7.2，加入酶制剂，，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶7份、木瓜蛋白酶10份和胰蛋白酶2份，酶解5h，酶解过程中在酶解液中通入氮气，每隔40min在酶解液中通入氮气，通入量为20g/h；

3）将酶解液置于100℃条件下加热8min灭酶处理，调pH至中性，于4℃条件下8000r/min离心12min，取上清液，得鳀鱼活性多肽。

实施例3：

从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，具体步骤如下：

1）取新鲜鳀鱼，取鳀鱼皮洗净，匀浆，于-26℃冷藏备用；

2）解冻并将匀浆后的鳀鱼皮按固液比4:1加入去离子水，去离子水中含有0.12wt%的L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸的混合体，L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸重量比为53:0.4，于46℃条件下恒温搅拌，调pH值至6.8，加入酶制剂，，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶5份、木瓜蛋白酶10份和胰蛋白酶1份，酶解4h，酶解过程中在酶解液中通入氮气，每隔35min在酶解液中通入氮气，通入量为26g/h；

3）将酶解液置于97℃条件下加热8min灭酶处理，调pH至中性，于4℃条件下10000r/min离心10min，取上清液，得鳀鱼活性多肽。

实施例4：

对本发明实施例2提取的鳀鱼活性多肽进行试验：试验所用试剂均购买于北京协和生物工程研究所。

试验共选取普通级昆明种小鼠60只，体质量 18~22g，小鼠在试验开始之前适应性喂养一周，自由饮水和进食，一周后，60只小鼠被随机分成3组：1组空白组、1组鳀鱼肽高剂量组（实验组1）、1组鳀鱼肽低剂量组（实验组2），每组20只小鼠，在4周的试验过程中，每天下午4点至5点， 实验组1 组的小鼠被灌胃5 mg/ g·d）的鳀鱼多肽，实验组2 组的小鼠被灌胃 0.5 mg/（g·d）的鳀鱼多肽，而空白组的小鼠则被灌胃蒸馏水，在灌胃后，小鼠被允许休息30 min，然后进行游泳训练，第 1 周游泳训练时间为20 min，以后每周增加5 min；游泳池的尺寸为50 cm×50 cm×50 cm，水深为40 cm，水温保持在（25±1）℃，用玻璃棒不停地搅动池中的水以使小鼠不停地游动. 当小鼠头部沉入水中后7s仍不能正常地把头伸出水面，则认为此时小鼠已进入力竭状态，记录从小鼠开始游泳到力竭状态的时间，该时间为力竭游泳时间。

当训练的小鼠在小游泳池中游泳 30 min，然后捞出，眼眶取血，测量血液中血糖（GLU）含量、血乳酸（LA）含量和血清尿素氮（BUN）的含量，以及肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）的活性，并且在试验第28天禁食空腹过夜，称质量后眼眶采血，低温离心分离血清（4℃，6 000r/min，10 min），-80 ℃保存待测，取血后的小鼠颈椎脱臼处死，用冰生理盐水洗去心、肝、肾上面的浮血，用滤纸吸干，称质量后用液氮迅速冷冻，以0.2 mol/L、pH 7.4 的PBS 缓冲液做匀浆介质在低温下将各器官组织按照 1∶9（m/V）匀浆，于4 ℃，6 000 r/min离心 10 min，取上清， -80 ℃保存，测定不同鳀鱼肽剂量对DPPH自由基的清除率，如图1所示，测定各组小鼠组织SOD活性，如图2所示。

上述实施例中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，其特征在于：具体步骤如下：

1）取新鲜鳀鱼，取鳀鱼皮洗净，匀浆，于-20℃至-30℃冷藏备用；

2）解冻并将匀浆后的鳀鱼皮按固液比4-6:1加入去离子水，于42-50℃条件下恒温搅拌，调pH值，加入酶制剂，酶解4-6h，酶解过程中在酶解液中通入氮气；

3）将酶解液进行灭酶处理，调pH至中性，离心，取上清液，得鳀鱼活性多肽。

2.根据权利要求1所述的从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，其特征在于：所述步骤2中的去离子水中含有0.06-0.15wt%的L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸的混合体，L-苯基丁氨酸和D-苯基丁氨酸重量比为52~58:0.3~0.7。

3.根据权利要求1所述的从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，其特征在于：所述步骤2中每隔30-40min在酶解液中通入氮气，通入量为20-30g/h。

4.根据权利要求1所述的从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，其特征在于：所述步骤2中调pH值至6.5-7.2，加入酶制剂，酶制剂由以下成分及重量份组成：中性蛋白酶3-7份、木瓜蛋白酶6-10份和胰蛋白酶1-2份。

5.根据权利要求1所述的从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，其特征在于：所述灭酶处理为：将酶解液置于95-100℃条件下加热5-10min。

6.根据权利要求1所述的从鳀鱼皮中提取活性多肽方法，其特征在于：所述步骤3中于2-6℃条件下8000-10000r/min离心10-15min，取上清液，得鳀鱼活性多肽。