CN108251484B - 甲鱼活性肽蛋白粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农产品生物发酵技术领域，公开了甲鱼活性肽蛋白粉及其制备方法，本发明通过复合酶解⇒生物发酵⇒再酶解的三步复合工艺处理，所得产品不仅含有高浓度的小分子甲鱼肽和丰富的游离氨基酸，最大限度地保留了甲鱼的全部营养成分，还能有效去除了甲鱼所特有的浓重腥臭味，使之可以广泛地用作各种食品和保健品的中间原料，大大提高了甲鱼的利用价值和利用途径。

Description

甲鱼活性肽蛋白粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及农产品生物发酵技术领域，尤其涉及一种甲鱼活性肽蛋白粉及其制备方法。

背景技术

龟鳖是地球上最古老的生物之一，亿万年前就与恐龙共生，经历了漫长的生物进化和世纪更迭，恐龙灭絶了，龟鳖却顽强地生存至今，而且其物种形态和生命功能基本上还保留着原始状态。这说明龟鳖具有极其顽强的生命力和卓越的环境适应能力，因此千百年来，龟鳖就被作为养身健身的天然滋补品，在日常的饮食生活和医药品中广泛利用，在中华民族的文明史上积淀了深厚的文化底蕴。

甲鱼富含蛋白质、碳水化合物、脂肪、钙、铁、碘、维生素A、维生素B1、B17、烟酸、动物胶、角蛋白等成分。现代药理学研究证明，甲鱼具有抗癌、降低血胆固醇、滋阴凉血、补益调中、补肾健骨、散结消痞等作用，可辅助治疗身虚体弱、肝脾肿大、肺结核、贫血、体质虚弱等多种慢性疾病。在中国很早以前就有“鳖可补痨伤，壮阳气，大补阴之不足”的记载；《本草纲目》还记载，鳖肉有滋阴补肾，清热消淤，健脾健胃等多种功效，可治虚劳盗汗，阴虚阳亢，腰酸腿疼，久病泄泻，小儿惊痫，妇女闭经、难产等症状。

但是由于宰杀新鲜活甲鱼既费时又费力，同时烹调美味的甲鱼汤煲也需要有专门的烹调技能，所以新鲜甲鱼虽然美味可口，营养价值高，但是老百姓不可能每天花时间去烹调。造成对甲鱼的消费和食用难于形成高潮。还有更重要的致命点是新鲜甲鱼有着浓重的腥臭味，许多消费者难于接受，対甲鱼汤煲大都敬而远之，因此造成甲鱼消费的过度低迷。

近几年来，全国养殖的新鲜活甲鱼年产量约在30～40万吨左右，但这些甲鱼的99％以上是作为活甲鱼在市场上流通销售。由于以上的各种原因，从2012年下半年以来，活甲鱼的销售一直处于低迷状态，全国各地的甲鱼价格不断回落，目前的甲鱼价格己跌入近年来的最低位。因此，要发展和振兴甲鱼产业，首先必須重点突破甲鱼高精深加工的关键技术瓶颈，生产出高品质的、具有高附加价值的甲鱼二次加工产品，使甲鱼的销售从以活甲鱼销售为主的局面转型升级到以高精深加工的产品销售为主的局面，这是实现甲鱼产业可持续发展的唯一出路。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种甲鱼活性肽蛋白粉及其制备方法，本发明方法通过特殊的生物工程处理，所得产品不仅含有高浓度的小分子甲鱼肽和丰富的游离氨基酸，最大限度地保留了甲鱼的全部营养成分，还能有效地去除了甲鱼所特有的浓重腥臭味，使之可以广泛地用作各种食品和保健品的中间原料，大大提高了甲鱼的利用价值和利用途径。

本发明的具体技术方案为：一种甲鱼活性肽蛋白粉的制备方法，包括以下步骤：

1)将活甲鱼断食清养后，进行清洗、屠杀、去除不可食用部位。

2)在90℃～95℃下热烫10～15s后去皮膜；之后，在90℃～121℃下高温蒸煮0.5～3小时；

3)对蒸煮后的甲鱼用粉碎机粗粉碎后，使用胶体磨磨成微粒子，得到浆液。

4)调节浆液的pH为4.5～5.5，向浆液中添加酸性蛋白酶和脂肪酶，在45℃～55℃条件下，酶解4～8小时后，加热失活。

5)向浆液中添加糖质发酵辅料和活性酵母菌，在20℃～35℃条件下，发酵2～3天；

6)在以上浆液中添加醋酸菌，在25℃～35℃条件下，发酵2～3天；

7)调节浆液的pH 6.5～7.5，向浆液中添加碱性蛋白酶，在50℃～60℃条件下，酶解1～5小时；

8)在15℃～20℃的温度下，低温熟成1～2天，加热失活；

9)浓缩后，采用低温真空干燥法去除水分。

10)进一步粉碎，对粉末进行灭菌处理、包装、即获得成品。

在现有技术中，甲鱼蛋白粉的制备方法一般都是先将整只甲鱼液氮冷冻，然后进行粉碎。该方法制得的甲鱼蛋白粉中小分子甲鱼肽和游离氨基酸含量少，同时甲鱼腥臭味浓重。

经研究发现，甲鱼的腥臭味有相当大一部分来源于甲鱼的脂肪和内脏。为此，本发明针对甲鱼的特性，开发了上述酸性蛋白酶与脂肪酶的复合酶解

生物发酵

碱性蛋白酶解相结合的三步复合处理工艺，不仅能够大幅提高蛋白粉中小分子甲鱼肽和游离氨基酸含量，而且还能够分解和去除主要的腥臭味物质：如三甲胺(TMA-N)、氨(NH₃)、挥发性盐基氮(TVB-N)，从而有效去除腥臭味。

虽然现有技术中在制备其他动物蛋白时也有应用酶解+发酵技术的，但是并未检索到处理对象为甲鱼的文献，而且现有技术的处理方法过于简单，不可能在大幅增加游离氨基酸含量的同时，又能有效地去除甲鱼的腥臭味。同时，由于甲鱼的特性与其他动物具有较大不同，因此本发明人在开发工艺时，并不能只是简单地复制现有的酶解+发酵工艺，而是需要针对甲鱼的特性，经多次的反复探索试验，付出大量的创造性劳动，才最终确定了本发明的三步复合处理的技术方案，该项发明内容并非本领域的普通技术人员就能轻易完成的，因此具有创新性。其具体内容体现在：

1、现有技术中的酶解+发酵工艺只是单一地为了获取较高含量的游离态氨基酸和小分子多肽，并不能有效去除甲鱼所持有的那种特殊腥臭味。

2、对于部分具有腥臭味的动物，本发明通过研究发现，甲鱼的腥臭味物质组成、含量与鱼类、鱿鱼等其他具有腥臭味的动物具有很大差异，如果一味照搬现有技术，并不能有效地对症下药(不同的处理对象需要采用不同的脱腥方法)，因此在除腥臭的工艺方法和效率上会有很大不同。而没有经过针对性研究的本领域普通技术人员并不知晓甲鱼与其他动物在腥臭味物质的组成、比例上有何不同，不可能开发出酸性蛋白酶与脂肪酶的复合酶解

生物发酵

碱性蛋白酶解相结合的三步复合处理工艺，该工艺不仅能够大幅提高蛋白粉中小分子甲鱼肽和游离氨基酸含量，而且还能够分解和去除甲鱼中的主要腥臭味物质，具有创新性。因此该技术不属于本领域常规的技术手段。

3、甲鱼与其他种类的动物，特别是其他的水产品不同，甲鱼的一个最大特点是其胶原蛋白含量比其他任何鱼类都要高很多。本发明人制备甲鱼蛋白粉时，发现在酶解、发酵处理时，如果分解不够彻底，后续低温真空干燥就不能顺利进行(胶原蛋白会凝结成胶)。但是如果分解过度的话，又会造成口感苦涩、难以入口，大大降低产品的利用价值。因此不能仅简单地借鉴其他鱼类蛋白粉的制备工艺就能成功地实现本发明的目的。为此，本发明人特意对所使用的水解酶类、发酵用菌株、水解及发酵的生产工艺参数等进行了反复的深入研究，通过对酶解、发酵以及低温真空干燥过程中各种工艺参数的联动调整，最终确定了酸性蛋白酶与脂肪酶的复合酶解

生物发酵

碱性蛋白酶解相结合的三步复合处理工艺，从根本上解决了上述技术难题。而这在现有技术中均未有类似的记载，并且成功解决了本领域技术人员所没有发现的技术问题(因为该技术问题对于其他动物来说并不存在，只有制备甲鱼蛋白粉时才会遇到)，因此不属于本领域的常规技术手段。

作为优选，步骤1)中，断食清养时间为1-3天。

作为优选，步骤2)中，高温蒸煮前撒入少量食盐和香辛料，添加甲鱼2～5倍质量的水。

作为优选，步骤3)中，所述微粒子的粒度为100目以下。

作为优选，步骤4)中，所述酸性蛋白酶的添加量为浆液质量的0.1-0.3％，所述脂肪酶的添加量为浆液质量的0.05-0.2％。

作为优选，步骤5)中，所述糖质发酵辅料的添加量为浆液质量的3-15％，糖质发酵辅料为异麦芽酮糖和白砂糖、或海藻糖和白砂糖的任意一组组合；所述活性酵母菌的添加量为浆液质量的0.01-0.05％。

作为优选，步骤6)中，所述醋酸菌的添加量为浆液质量的0.01-0.03％

作为优选，步骤7)中，所述碱性蛋白酶的添加量为浆液质量的0.05-0.2％。

在本发明中，选用了异麦芽酮糖或海藻糖，其作用与普通糖类的不同之处在于，其除了作为发酵所需碳源外，本发明人通过研究还发现，该两种糖质对甲鱼中的腥臭味物质具有非常好的吸附和遮蔽作用，能有效降低腥臭味，一举两得。

作为优选，步骤4)和步骤8)中，加热失活温度为90-100℃，时间为15-30min。

作为优选，步骤9)中，浓缩至Bx.20％～35％后，采用低温真空干燥法去除水分至10％以下，干燥温度控制在50℃～65℃，真空度控制在-0.09～0.096MPa。

作为优选，步骤10)中，进一步粉碎至100目以下。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

本发明通过特殊的复合酶解

生物发酵

再酶解的三步复合处理工艺，所得产品不仅含有高浓度的小分子甲鱼肽和丰富的游离氨基酸，最大限度地保留了甲鱼的全部营养成分，还能有效去除了甲鱼所特有的浓重腥臭味，使之可以广泛地用作各种食品和保健品的中间原料，大大提高了甲鱼的利用价值和利用途径。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

实施例1

取活甲鱼2只(重约800g)，断食清养2天后，进行清洗、屠杀，去除膀胱等不可食用部位。再经热烫去皮膜后，将整只甲鱼(包括内脏和甲壳)放入蒸煮锅，均匀洒入少量食盐和香辛料，注入2倍量的纯水后，在115℃的温度条件下，高温蒸煮1小时。之后利用粉碎机进行粗粉碎后，进一步使用胶体磨，磨成100目左右的微粒子。之后，调节浆液的pH为5.0，添加酸性蛋白酶M(天野酶制剂商贸(上海)有限公司出品，以下同)7.2g，脂肪酶MER(天野酶制剂商贸(上海)有限公司出品，以下同)2.4g，在50℃的温度条件下酶解6h后，95℃加热失活20min。之后添加高活性面包干酵母粉(安琪酵母股份有限公司出品)0.72g，异麦芽酮糖60g，白砂糖72g在25℃的恒温条件下发酵3天。之后，添加食用醋酸菌0.48g，30℃发酵2天。再添加碱性蛋白酶P3(天野酶制剂商贸(上海)有限公司出品、以下同)2.4g，在55℃酶解2h后，移至15℃的恒温箱，低温熟成2天，95℃加热失活20min。减压浓缩至发酵液的Bx.在30％左右，放入低温真空干燥箱，去除水分至5％以下。之后进一步粉碎至100目以下。对以上粉末进行灭菌处理，包装，获得甲鱼活性肽蛋白干粉246g。该产品具有甲鱼的特有美味，但基本上没有甲鱼的那种强烈腥臭味。相对于产品的总氮含量，其氨基态氮的含量为62.40％。

为了检测经过发酵处理后，甲鱼腥臭味成分的除去实况，本实验将未经任何生物工程处理的甲鱼粉，即采用液氮冻结后粉碎的粉末(以下略称：甲鱼干燥原粉)作为对照品，与本发明的产品(以下略称：甲鱼发酵粉末)同时进行了代表腥臭味的主要三成分的含量分析：三甲胺(TMA-N)、氨(NH₃)及挥发性盐基氮(TVB-N)。之后，分别将分析数值除以样品中的总氮(TN)含量后，得到以mg/Ng单位表示的数值，结果列于表1。

其中，三甲胺的含量测定按(GB 5009.179-2016食品安全国家标准食品中三甲胺的测定(2017-3-1实施))的方法实施；

氨的含量测定按市售的“氨检测试剂盒(AmmoniaAssay Kit)”的方法实施。该试剂盒可用于酶促定量分析食品及其他生物材料中的氨含量(在L-谷氨酸脱氢酶(GIDH)存在的情况下，氨能够与α-酮戊二酸(KGA)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADPH)反应，生成L-谷氨酸和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(NADP+)。在340nm波长处的吸光值下降是NADPH的氧化所致，具体的吸光度与样品中的氨浓度成正比，L-谷氨酸脱氢酶能够与氨特异性地反应)；

挥发性盐基氮(TVB-N)的含量测定采用微量扩散法(挥发性含氮物质在碱性溶液中释出，在扩散皿中于37℃时挥发后被吸收于吸收液中，用标准酸滴定来计算其含量)。

由表1结果可知，经过本发明的生物工程处理后，甲鱼发酵粉末中的三甲胺、氨、及挥发性盐基氮等三个指标的含量都大幅减少，除去率均在80％左右。

除去率(％)＝(甲鱼干燥原粉中的含量-甲鱼发酵粉末中的含量)/甲鱼干燥原粉中的含量×100。

表1.甲鱼经生物工程处理前后的腥臭味含量变化

备注：腥臭味含量测定取测定样品的15％水溶液作为分析样品。以上数值分别为15％水溶液中的腥臭味含量除以该15％水溶液的总氮含量后得到的数值。

实施例2

取预先清养、屠杀好的冷冻甲鱼6只(重3,500g)进行解冻处理后，均匀洒入少量食盐和香辛料，将整只甲鱼放入蒸煮锅，添加2倍量的纯水后，在105℃的温度条件下，高温蒸煮1.5小时。之后利用粉碎机进行粗粉碎后，进一步使用胶体磨，磨成100目左右的微粒子。调节浆液的pH为5.0，添加酸性蛋白酶M 21g，脂肪酶MER 10.5g，在45℃的温度条件下酶解8h后，95℃加热失活20min。待温度降至30℃前后，添加啤酒酵母粉(安琪酵母股份有限公司出品)2.1g、白砂糖210g、海藻糖315g后，在25℃的温度条件下，连续发酵2天。添加醋酸菌1.4g，继续在30℃的温度条件下发酵2天。添加碱性蛋白酶P310.5g，在50℃酶解3h。之后，15℃下低温熟成2天，高温加热失活，将发酵液浓缩至Bx.在30％左右。放入低温真空干燥箱去除水分至5％以下，之后进一步粉碎至100目以下。对以上粉末进行灭菌处理，包装，获得甲鱼活性肽蛋白粉1，150g。该产品具有甲鱼的特有美味，但完全没有甲鱼的那种腥臭味。

为了验证经过发酵处理后，游离氨基酸含量大幅增长的实况，本实验将未经任何生物工程处理的甲鱼，即采用液氮冻结后粉碎的粉末(甲鱼干燥原粉)作为对照品，与本发明的产品(甲鱼发酵粉末)同时进行了游离氨基酸含量的分析(使用日立全自动氨基酸分析仪)，结果如表2所示。由表2结果可知，经过本发明的生物工程处理后，多种氨基酸的含量都有了大幅增加，游离氨基酸的总量增加了2.2倍，而其中8种必須氨基酸的总量(由于分析仪器的问题，色氨酸含量未能測出)更是增加了2.5倍。

相对于产品的总氮含量，该产品的氨基态氮含量为64.6％，三甲胺含量为2.97mg/Ng。

表2.甲鱼干燥原粉与发酵粉末中的氨基酸组成的差異

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种甲鱼活性肽蛋白粉的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将活甲鱼断食清养后，进行清洗、屠杀、去除不可食用部位；

2）在90℃～95℃下热烫10～15 s后去皮膜；之后，在90℃～121℃下高温蒸煮0.5～3小时；

3）对蒸煮后的甲鱼用粉碎机粗粉碎后，使用胶体磨磨成微粒子，得到浆液；

4）调节浆液的pH为4.5～5.5，向浆液中添加酸性蛋白酶和脂肪酶，在45℃～55℃条件下，酶解4～8小时后，加热失活；

5）向浆液中添加糖质发酵辅料和活性酵母菌，在20℃～35℃条件下，发酵2～3天；所述糖质发酵辅料为异麦芽酮糖和白砂糖、或海藻糖和白砂糖的任意一组组合；

6）在以上浆液中添加醋酸菌，在25℃～35℃条件下，发酵2～3天；

7）调节浆液的pH为6.5～7.5，向浆液中添加碱性蛋白酶，在50℃～60℃条件下，酶解1～5小时；

8）在15℃～20℃的温度下，低温熟成1～2天，加热失活；

9）浓缩后，采用低温真空干燥法去除水分；

10）进一步粉碎，对粉末进行灭菌处理、包装，即获得甲鱼活性肽蛋白粉。

2.如权利要求1所述的甲鱼活性肽蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤2）中，高温蒸煮前撒入食盐和香辛料，添加甲鱼2～3倍质量的水。

3.如权利要求1所述的甲鱼活性肽蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤4）中，所述酸性蛋白酶的添加量为甲鱼经胶体磨磨碎后所得浆液质量的0.1～0.3%，脂肪酶的添加量为浆液质量的0.05～0.2%。

4.如权利要求1所述的甲鱼活性肽蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤5）中，所述糖质发酵辅料的添加量为浆液质量的3-15%；所述活性酵母菌的添加量为浆液质量的0.01-0.05%。

5.如权利要求1所述的甲鱼活性肽蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤6）中，所述醋酸菌的添加量为浆液质量的0.01-0.03%。

6.如权利要求1所述的甲鱼活性肽蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤7）中，所述碱性蛋白酶的添加量为浆液质量的0.05-0.2%。

7.如权利要求1或5或6所述的甲鱼活性肽蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤4）和步骤8）中，加热失活温度为85-100℃，时间为15-30 min。

8.如权利要求1所述的甲鱼活性肽蛋白粉的制备方法，其特征在于，步骤9）中，浓缩至Bx. 20%～35%后，采用低温真空干燥法去除水分至10％以下，干燥温度控制在50℃～65℃，真空度控制在-0.09～0.096 MPa；步骤10）中，进一步粉碎至100目以下。