CN113373196B - 一种金线鱼抗疲劳肽的加工方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种金线鱼抗疲劳肽的加工方法。所述加工方法是以德氏乳酸杆菌保加利亚亚种发酵的金线鱼鱼糜为原料，采用高强度超声波技术配合复合酶的工艺，经超滤分离、冷冻干燥和直链淀粉包埋等技术得到高抗疲劳活性的金线鱼抗疲劳肽。它能有效帮助机体在运动后迅速补充支链氨基酸、电解质，减轻或延缓疲劳的发生和增强肌体耐力，同时为机体提供益生物质，改善机体肠道功能，为相关运动营养食品的开发提供了新思路。
Description
技术领域
本发明应用于食品加工技术领域，具体是一种金线鱼抗疲劳肽的加工方法。
背景技术
金线鱼(Nemipterus virgatus)是中国、越南、马来西亚和其他东南亚国家的主要低值鱼类，也是福建省最重要的水产品精深加工的鱼类之一。该鱼肉质细嫩且丰厚、价格低廉、分布广泛，且具有较高的营养价值，主要分为短尾金线鱼、丝尾金线鱼、黄边金线鱼、玫瑰金线鱼，鱼体呈扁平、纺锤形，长8～19cm，背部微隆起，颜色呈灰黑色，腹部灰白色，鳍条较黑，鳞片较细且分布于体侧，背腹的鳞片较少甚至没有，鳞片呈黄色，有光泽，侧线呈金黄色，故得名金线鱼。
德氏乳杆菌保加利亚亚种亦称为“保加利亚乳杆菌”，广泛应用于乳业，其发酵产生的乳酸对乳糖不耐症有缓解作用，可促进营养成分的吸收与利用及改善产品风味。除此之外，其发酵可产生短链脂肪酸等益生物质，起到抑制肠道有害菌生长，促进肠道有益菌增殖的作用，且对幽门螺杆菌也具有一定的抑菌活性。
“一种高效制备金线鱼抗疲劳肽的加工方法”即以金线鱼鱼糜为原材料，通过乳酸菌发酵、高强度超声波、复合酶、超滤、冷冻干燥、直链淀粉包埋等技术提取抗疲劳肽。目前，海洋鱼类生物活性肽的制备方法主要采用酶解法，但酶解提取的抗疲劳肽含量有限，尹小平等研究单一酶木瓜蛋白酶水解天山马鹿血提取抗疲劳肽，其水解率最高为19.8％，而本发明采用发酵法及高强度超声波辅助复合酶法所制备的金线鱼鱼肉多肽总抗氧化能力为36.742±0.59U/mL，水解度达到了21.0902±0.1562％。徐敏等研究超声波协同复合酶水解米渣蛋白制备ACE抑制肽研究中，加酶量为3000U/g，本发明的加酶量仅为1872U/g，极大减少了酶的用量。发明专利“一种具有抗疲劳活性的松花粉肽的制备方法”(公开号CN108486203A)公开了一种经蛋白酶解、减压浓缩和喷雾干燥获得松花粉肽的制备方法，该方法获得的松花粉肽平均分子量为小于2000Da，分子量较大，本发明获得的抗疲劳肽平均分子量为1.166kDa。发明专利“一种包埋活性肽的纳米颗粒及其制备方法”(公开号CN107183308A)公开了一种利用壳聚糖和三聚磷酸钠为纳米包材，获得了蛋清肽-壳聚糖纳米颗粒的蛋清源活性肽包埋物，但并未研究包埋时间、温度和pH对脱苦效果的影响。发明专利“一种凝胶包埋海马多肽微胶囊及其制备方法”(公开号CN106262940A)公开了一种利用植物蛋白凝胶包埋海马多肽的制备方法，该方法获得的包埋率为68.8％，而本发明获得的直链淀粉包埋抗疲劳肽的包埋率可达80％。
因此如何解决金线鱼抗疲劳肽加工过程中抗营养素减少，生物活性物质的水平不高，抗疲劳肽的提取率较低的问题成为现有技术存在的缺陷和难题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种金线鱼抗疲劳肽的加工方法。
为解决上述技术问题，本发明的一种金线鱼抗疲劳肽的加工方法，其包括如下步骤：
对金线鱼料进行原料处理操作；
对金线鱼料进行菌种发酵处理；
对金线鱼料进行高强度超声波预处理；
对金线鱼料进行复合酶酶解；
对金线鱼料进行超滤操作；
对金线鱼料进行直链淀粉包埋操作；
对金线鱼料进行冷冻干燥操作。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行原料处理操作的步骤具体为：将金线鱼去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，清洗干净，鱼肉经高速组织匀浆机斩拌均匀制为金线鱼鱼糜，-20℃冷藏备用。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行菌种发酵处理操作的步骤具体为：取适量灭菌的所述金线鱼鱼糜接种德氏乳酸杆菌保加利亚亚种，在35～37℃条件下，于发酵罐中发酵1～3h，制得发酵金线鱼鱼糜。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行高强度超声波预处理的步骤具体为：对所述发酵金线鱼鱼糜进行高强度超声波预处理，其中，高强度超声波强度为700～1000W，超声时间为1～8min。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行复合酶酶解的步骤具体为：取进行高强度超声波预处理后的发酵金线鱼鱼糜按照液固比为6:1-10:1的比例加入蒸馏水，其中，酶解温度为55-65℃，pH为6.0-7.0，每克鱼糜加入800U～2000U的木瓜蛋白酶，酶解2-10h，然后灭酶，再加入中性蛋白酶1000～2000U/g酶解，其中，酶解温度为40-50℃，pH为6.5，酶解时间2-10h。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行超滤操作的步骤具体为：在复合酶酶解结束后将酶解液置于沸水浴中灭酶20min，冷却至室温，于4℃、9000r/min，离心10～15min，取上清液进行超滤，得到抗疲劳肽，再冷冻干燥得到抗疲劳肽粉。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行直链淀粉包埋操作的步骤具体为：将所述抗疲劳肽粉以料液比1:9～1:10(m:v)的比例加入蒸馏水，调节pH为6.0～7.0，其中，添加的直链淀粉与抗疲劳肽质量比为3:4～3:5，放入恒温加热搅拌器中搅拌，于35～45℃包埋反应40～50min。
作为一种可能的实施方式，进一步的，将所述抗疲劳肽与直链淀粉包埋操作的直链淀粉包埋液冷却过滤，取得沉淀经冷冻干燥，粉碎得到抗疲劳肽的包埋物。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行菌种发酵处理操作中菌种接种量为1.5×108cfu/mL，发酵温度为37℃，发酵时间为1-3h。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行复合酶酶解操作中所述木瓜蛋白酶加酶量为1800U/g，酶解温度为45℃，中性蛋白酶加酶量为1000～2000U/g，酶解温度为45℃。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行高强度超声波预处理的步骤的高强度超声波强度为800W，超声时间为5min。
作为一种可能的实施方式，进一步的，所述对金线鱼料进行直链淀粉包埋操作的料液比为1:10(m:v)，pH为7.0，添加的直链淀粉与抗疲劳肽质量比为3:5，包埋温度为35℃，时间为44min。
本发明采用以上技术方案，具有以下有益效果：
(1)采用菌种发酵、复合酶解提高了抗疲劳肽的提取率，增加了益生物质。
(2)采用高强度超声波技术辅助复合酶暴露更多的水解位点供木瓜蛋白酶和中性蛋白酶降解鱼糜，从而增强酶水解的能力。
(3)采用超滤分离有效提高抗疲劳肽的浓度，缩短操作时间及节约成本。
(4)采用直链淀粉包埋技术，解决了加工过程中因自身原料而产生的鱼腥味及水解过程中产生的苦味的问题，同时对抗疲劳肽起保护作用，增强其稳定性。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明做进一步详细的说明：
图1为本发明不同制备方式对鱼糜DPPH自由基清除率IC50及酶解时间的影响表图；
图2为本发明不同制备方式对鱼肉抗疲劳肽力竭游泳时间的影响表图。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种金线鱼抗疲劳肽的加工方法，其包括如下步骤：
对金线鱼料进行原料处理操作；将金线鱼去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，清洗干净，鱼肉经高速组织匀浆机斩拌均匀制为金线鱼鱼糜，-20℃冷藏备用。
对金线鱼料进行菌种发酵处理；取适量灭菌的所述金线鱼鱼糜接种德氏乳酸杆菌保加利亚亚种，在35～37℃条件下，于发酵罐中发酵1～3h，制得发酵金线鱼鱼糜。优选的，菌种接种量为1.5×108cfu/mL，发酵温度为37℃，发酵时间为3h。
对金线鱼料进行高强度超声波预处理；对所述发酵金线鱼鱼糜进行高强度超声波预处理，其中，高强度超声波强度为700～1000W，超声时间为1～8min。优选的，高强度超声波强度为800W，超声时间为5min。
对金线鱼料进行复合酶酶解；取进行高强度超声波预处理后的发酵金线鱼鱼糜按照液固比为6:1-10:1的比例加入蒸馏水，其中，酶解温度为55-65℃，pH为6.0-7.0，每克鱼糜加入800U～2000U的木瓜蛋白酶，酶解2-10h，然后灭酶，再加入中性蛋白酶1000～2000U/g酶解，其中，酶解温度为40-50℃，pH为6.5，酶解时间2-10h。优选的，所述木瓜蛋白酶加酶量为1800U/g，酶解温度为45℃，中性蛋白酶加酶量为1000～2000U/g，酶解温度为45℃。其相对其余不同制备方式的比对图标如图1-2所示。
对金线鱼料进行超滤操作；在复合酶酶解结束后将酶解液置于沸水浴中灭酶20min，冷却至室温，于4℃、9000r/min，离心10～15min，取上清液进行超滤，得到抗疲劳肽，再冷冻干燥得到抗疲劳肽粉。
对金线鱼料进行直链淀粉包埋操作；将所述抗疲劳肽粉以料液比1:9～1:10(m:v)的比例加入蒸馏水，调节pH为6.0～7.0，其中，添加的直链淀粉与抗疲劳肽质量比为3:4～3:5，放入恒温加热搅拌器中搅拌，于35～45℃包埋反应40～50min。优选的，料液比为1:10(m:v)，pH为7.0，添加的直链淀粉与抗疲劳肽质量比为3:5，包埋温度为35℃，时间为44min。
对金线鱼料进行冷冻干燥操作。将所述抗疲劳肽与直链淀粉包埋操作的直链淀粉包埋液冷却过滤，取得沉淀经冷冻干燥，粉碎得到抗疲劳肽的包埋物。
实施例1
一种高效制备金线鱼抗疲劳肽的加工方法，具体包括以下步骤：
(1)将金线鱼去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，清洗干净，鱼肉经高速组织匀浆机斩拌均匀，-20℃冷藏备用；
(2)取适量灭菌金线鱼鱼糜接种1.5×108cfu/mL德氏乳酸杆菌保加利亚亚种，在37℃条件下，于发酵罐中发酵1h；
(3)将步骤(2)的发酵金线鱼鱼糜进行高强度超声波预处理(800W，5min)；
(4)将步骤(3)的经预处理的发酵鱼糜按照液固比为6:1-10:1的比例加入蒸馏水，在55-65℃的恒温水浴中不断搅拌，用1mol/L的NaOH或HCl调节pH至6.0-7.0，每克鱼糜加入1800U的木瓜蛋白酶，酶解温度为45℃，酶解5h，然后灭酶，再加入中性蛋白酶1000～2000U/g酶解，酶解温度为45℃，pH为6.5，酶解时间3h；
(5)酶解结束后将酶解液置于沸水浴中灭酶20min，冷却至室温，于4℃、10000r/min条件下离心15min；
(6)取步骤(5)所得吸附后的酶解液于9000r/min，离心10～15min，取上清液进行超滤，得到平均分子量为1.166kDa的抗疲劳肽，再超滤分离，最后冷冻干燥保存，获得抗疲劳肽粉；
(7)将步骤(6)所得的抗疲劳肽粉，以料液比1:10(m:v)的比例加入蒸馏水，调节pH为7.0，添加的直链淀粉与抗疲劳肽质量比为3:5，放入恒温加热搅拌器中搅拌，于35℃包埋反应44min达到良好的脱苦和去腥效果；
(8)将步骤(7)包埋后的抗疲劳肽液，冷却过滤，所得沉淀经冷冻干燥，粉碎后得到抗疲劳肽的包埋物。
实施例2
一种高效制备金线鱼抗疲劳肽的加工方法，具体包括以下步骤：
(1)将金线鱼去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，清洗干净，鱼肉经高速组织匀浆机斩拌均匀，-20℃冷藏备用；
(2)取适量灭菌金线鱼鱼糜接种1.5×108cfu/mL德氏乳酸杆菌保加利亚亚种，在37℃条件下，于发酵罐中发酵3h；
(3)将步骤(2)的发酵金线鱼鱼糜进行高强度超声波预处理(800W，5min)；
(4)将步骤(3)的经预处理的发酵鱼糜按照液固比为6:1-10:1的比例加入蒸馏水，在55-65℃的恒温水浴中不断搅拌，用1mol/L的NaOH或HCL调节pH至6.0-7.0，每克鱼糜加入1800U的木瓜蛋白酶，酶解温度为45℃，酶解5h，然后灭酶，再加入中性蛋白酶1000～2000U/g酶解，酶解温度为45℃，pH为6.5，酶解时间3h；
(5)酶解结束后将酶解液置于沸水浴中灭酶20min，冷却至室温，于4℃、10000r/min条件下离心15min；
(6)取步骤(5)所得酶解液上清液进行超滤，得到平均分子量为1.166kDa的抗疲劳肽，最后冷冻干燥保存，获得抗疲劳肽粉；
(7)将步骤(6)所得的抗疲劳肽粉，以料液比1:10(m:v)的比例加入蒸馏水，调节pH为7.0，添加直链淀粉0.78g/g，放入恒温加热搅拌器中搅拌，于35℃包埋反应50min达到较好的脱苦和去腥效果；
(8)将步骤(7)包埋后的抗疲劳肽液，冷却过滤，所得沉淀经冷冻干燥，粉碎后得到抗疲劳肽的包埋物。
测试例
取健康雄性KM小鼠48只(四周龄，体重18～22g)，随机分为空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组12只。小鼠分笼饲养，6只每笼。自由进食和饮水，调节室温(25±2℃)及相对湿度(55-70％)。小鼠适应性喂养1周后开始灌胃，空白组小鼠灌胃生理盐水，低、中、高剂量组小鼠灌胃实施例1制备的金线鱼抗疲劳肽，灌胃剂量分别设置为200mg/kg*d、400mg/kg*d和600mg/kg*d。灌胃6周后每组取6只小鼠进行力竭游泳实验。用长60cm、宽40cm、高50cm的泳槽作为小鼠游泳装置，水温25±0.5℃，水深40cm。在鼠尾根部负荷5％体重的铅块，置于泳槽中游泳，至小鼠沉入水底后10s不再浮起作为力竭标准，记录自游泳开始至力竭时间，作为小鼠力竭游泳时间。将每组剩余的6只小鼠于末次给药后30min放人泳槽中游泳，30min取出，15min后目内眦静脉采血，离心(4℃，3000r/10min)。取血清采用试剂盒检测其血乳酸、血尿素氮、肌酸激酶、丙二醛含量及谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性。解剖小鼠，取肝脏测定肝糖原含量，取腓肠肌测定肌糖原含量。结果表明金线鱼抗疲劳肽能够延长运动小鼠的力竭游泳时间，提高肝糖原、肌糖原含量及谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，降低血乳酸、血尿素氮、丙二醛含量及肌酸激酶活性，具有良好的抗疲劳功效。
因此本发明先对金线鱼鱼糜进行乳酸菌发酵，不仅可以通过水解促进抗营养素的减少，还可以增加生物活性物质的水平，提高抗疲劳肽的提取率，从而将剩余的风味改善且富含益生物质的鱼糜用作加工，提高了金线鱼的高附加值，再通过高强度超声波的应用配合木瓜蛋白酶结合中性蛋白酶提高抗疲劳肽含量，再经超滤分离提高抗疲劳肽的浓度，获得高活性的抗疲劳肽，再利用直链淀粉包埋金线鱼抗疲劳肽获得直链淀粉-抗疲劳肽包埋物，从而脱苦及去腥，同时起到提高抗疲劳肽稳定性，保护抗疲劳肽免受酸、热等条件的破坏。本发明中采用德氏乳杆菌保加利亚亚种接种发酵金线鱼鱼糜，提高了金线鱼抗疲劳肽的抗氧化和抗疲劳能力，且发酵改善了鱼糜风味以及产生益生物质，可在提取抗疲劳肽的同时用于鱼糜加工生产，实现金线鱼的高附加值；采用高强度超声波技术辅助复合酶可增强酶水解的能力，因为水解过程中高强度超声波可以通过影响氢键和疏水性相互作用来改变蛋白质构象，从而暴露更多的水解位点供木瓜蛋白酶和中性蛋白酶降解鱼糜，进而增加水解程度和抗疲劳肽提取率；超滤分离可有效提高抗疲劳肽的浓度，缩短操作时间及节约成本；对冷冻干燥后的抗疲劳肽粉采用直链淀粉包埋技术获得抗疲劳肽包埋物，以此达到良好的抗疲劳肽脱苦效果及有效掩盖鱼腥味，同时提高抗疲劳肽稳定性，保护抗疲劳肽免受酸、热等条件的影响。本发明的方法简单，提高金线鱼附加值，所制得的抗疲劳肽抗疲劳活性好、含量高，富含益生物质，苦味值低，绿色、环保、健康，可用于保健食品领域。
以上所述为本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，根据本发明的教导，在不脱离本发明的原理和精神的情况下凡依本发明申请专利范围所做的均等变化、修改、替换和变型，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种金线鱼抗疲劳肽的加工方法，其特征在于：其包括如下步骤：
对金线鱼料进行原料处理操作；
对金线鱼料进行菌种发酵处理；
对金线鱼料进行高强度超声波预处理；
对金线鱼料进行复合酶酶解；
对金线鱼料进行超滤操作；
对金线鱼料进行直链淀粉包埋操作；
对金线鱼料进行冷冻干燥操作；
所述对金线鱼料进行原料处理操作的步骤具体为：将金线鱼去除鱼鳞、鱼头、鱼尾、内脏、鱼鳍，清洗干净，鱼肉经高速组织匀浆机斩拌均匀制为金线鱼鱼糜，-20℃冷藏备用；
所述对金线鱼料进行菌种发酵处理操作的步骤具体为：取适量灭菌的所述金线鱼鱼糜接种德氏乳酸杆菌保加利亚亚种，在35～37℃条件下，于发酵罐中发酵1～3h，制得发酵金线鱼鱼糜；
所述对金线鱼料进行高强度超声波预处理的步骤具体为：对所述发酵金线鱼鱼糜进行高强度超声波预处理，其中，高强度超声波强度为700～1000W，超声时间为1～8min；
所述对金线鱼料进行超滤操作的步骤具体为：在复合酶酶解结束后将酶解液置于沸水浴中灭酶20min，冷却至室温，于4℃、9000r/min，离心10～15min，取上清液进行超滤，得到抗疲劳肽，再冷冻干燥得到抗疲劳肽粉；
所述对金线鱼料进行直链淀粉包埋操作的步骤具体为：将所述抗疲劳肽粉以料液比1:9～1:10(m:v)的比例加入蒸馏水，调节pH为6.0～7.0，其中，添加的直链淀粉与抗疲劳肽质量比为3:4～3:5，放入恒温加热搅拌器中搅拌，于35～45℃包埋反应40～50min；
将所述抗疲劳肽与直链淀粉包埋操作的直链淀粉包埋液冷却过滤，取得沉淀经冷冻干燥，粉碎得到抗疲劳肽的包埋物；
所述对金线鱼料进行复合酶酶解的步骤具体为：取进行高强度超声波预处理后的发酵金线鱼鱼糜按照液固比为6:1-10:1的比例加入蒸馏水，其中，酶解温度为55-65℃，pH为6.0-7.0，每克鱼糜加入800U～2000U的木瓜蛋白酶，酶解2-10h，然后灭酶，再加入中性蛋白酶1000～2000U/g酶解，其中，酶解温度为40-50℃，pH为6.5，酶解时间2-10h。
2.根据权利要求1所述的一种金线鱼抗疲劳肽的加工方法，其特征在于：所述对金线鱼料进行菌种发酵处理操作中菌种接种量为1.5×108cfu/mL，发酵温度为37℃，发酵时间为3h。
3.根据权利要求1所述的一种金线鱼抗疲劳肽的加工方法，其特征在于：所述对金线鱼料进行复合酶酶解操作中所述木瓜蛋白酶加酶量为1800U/g，酶解温度为45℃，中性蛋白酶加酶量为1000～2000U/g，酶解温度为45℃。
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