CN104338112A - 一种谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备方法。采用生物酶法制备纳米淀粉颗粒，制备的纳米淀粉产率高，成本低，方法更加安全环保，用其作为谷胱甘肽的包埋材料，制备谷胱甘肽纳米缓释胶囊。测定纳米缓释胶囊的粒径大小、包埋率、吸热特性、结晶度以及消化性等特性，发现纳米淀粉包埋谷胱甘肽之后在胃内的消化率低，主要在肠道内释药。

Description

一种谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程和食品医药领域，具体地说是一种谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备方法。

背景技术

谷胱甘肽是一种由半胱氨酸、谷氨酸及甘氨酸组成的三肽。半胱氨酸上的巯基为其活性基团，由于容易与某些药物、毒素等结合，因此具有一定解除毒素的作用。谷胱甘肽有广谱解毒的能力，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、提高免疫力、抗肿瘤等方面取得了长足的进展。但由于还原型的谷胱甘肽极易被氧化，导致活性降低，保健功能下降。

谷胱甘肽在人体的生化防御体系中处于举足轻重的地位，具有多方面的生理功能。它的主要生理作用是能够除掉人体内的自由基，并防止许多蛋白质和酶等分子中的巯基被氧化，因此是人体内一种重要的抗氧化剂。GSH的结构中含有一个易被氧化脱氢的活泼巯基，这一特异性结构使其成为体内主要的自由基消除剂。谷胱甘肽不仅在消除人体自由基的方面发挥着重要作用，还能够提高人体免疫力。张书芳等人研究表明谷胱甘肽在老人迟缓化的细胞上所发挥维护健康和抗衰老的功效比在年轻人细胞上大。谷胱甘肽还具有保护血红蛋白的功能，使血红蛋白不被氧化从而使它持续正常发挥运输氧的能力。因为红细胞中部分血红蛋白在氧气等氧化剂的作用下，其中二价铁易氧化为三价铁，使血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而失去了带氧能力。还原型谷胱甘肽既能够将高铁血红蛋白还原为血红蛋白，也能直接与过氧化氢等氧化剂结合，产生水和氧化型谷胱甘肽。由于要使得红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原态，防止溶血因此人体红细胞中谷胱甘肽的含量很多。

谷胱甘肽能够保护酶分子中-SH基，有利于酶活性的发挥，并且能恢复已经被破坏的酶分子中-SH基的活性功能，使酶重新恢复活性。谷胱甘肽还能保护肝脏防止被乙醇侵害产生脂肪肝。谷胱甘肽防止由放射线、放射性药物所引起的白细胞减少等病症。谷胱甘肽能与进入人体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促进其代谢，起到中和解毒作用。

谷胱甘肽的应用

1.谷胱甘肽在药物方面的应用

人工研制出的谷胱甘肽药物，已广泛应用于临床，除利用其巯基以螯合重金属、氟化物、芥子气等毒素中毒外，还用来治疗或辅助治疗肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病等。近年来，西方科学家，尤其是日本学者发现谷胱甘肽对抑制艾滋病毒也有一定的效果。

最新研究还表明，GSH能够纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用，还可改善皮肤抗氧化能力并使皮肤产生光泽具有美容效果，另外，GSH在治疗眼角膜病及改善性功能方面也起到了很好的效果。

2谷胱甘肽在食品方面的应用

(1)添加到婴幼儿食品和酸奶中，作用相当于维生素C，起到稳定剂的作用。

(2)放入鱼糕中，可防止色泽加深。

(3)添加到肉制品和干酪等食品中，起到强化风味的效果。

纳米淀粉

近年来，由于高分子材料的纳米载药体系受到越来越多的关注，尤其是天然多糖类的纳米载体。纳米淀粉的制备主要有：物理法、化学法及反向微乳液法等方法，通过载体包埋或键合药物可以防止体内的酶分解药物，控制药物定点释放，增加药物在体内的循环时间，提高药物疗效。而且淀粉是一类重要的具有生物可降解性、可再生、良好生物相容性的天然多糖类高分子材料，来源丰富，价格低廉，作为载体材料在药物控制释放领域已经得到部分应用。

淀粉属于高分子物质，当其尺寸减小到纳米量级后，特性发生了很大的改变，主要体现在表面效应和体积效应两方面。这两种效应使得纳米淀粉颗粒表面积激增，官能团密度和选择型吸附能力变大，达到吸附平衡的时间缩短，胶体稳定性提高，这些特性为其在生物学领域中的应用创造了有利条件。

1纳米淀粉载药性能

纳米淀粉粒径达到纳米量级后，表面积和表面能剧增，吸附能力和吸附速度大大提高，促使淀粉颗粒的载药量提高，缩短了吸附平衡的时间。

2纳米淀粉药物释放性能

药物从纳米淀粉颗粒中释放出来经历两个过程：一是：吸附在淀粉微球表面的药物快速释放。二是与基质相结合的药物释放并持续一段时间，有利于药物的吸收。

3纳米淀粉稳定性能

纳米淀粉微粒在常温条件下，外观、分散性、形态无明显变化。所以纳米淀粉的稳定性能好。

纳米淀粉在医学方面的应用

目前纳米淀粉微球子生物医药领域应用途主要有以下几方面：(1)免疫分析：免疫分析现已作为一种常规分析方法，对蛋白质、抗原、细胞定量分析有巨大的作用。淀粉分子有很多羟基，具有强亲水性，并且对非特异性蛋白吸附量很少，因此可以被广泛地作为新型标记物载体来使用。(2)药物控释体系：纳米淀粉在药物控释体系方面也发挥着重要的作用。某些药物只有在特定部位才能发挥其药效，但容易被消化液中的各种酶分解，导致口服药的药效并不理想，故用纳米淀粉微球作药物载体，可避免药物受酶作用，控制药物的释放速度。

纳米淀粉有3种不同的载药方式：(1)将干燥的“空白”淀粉放入药液中溶胀。这种方式操作简单，能够大量载药并对大多数药物适宜，但药物与微球结合差，随着血液流动药物释放快，释放能量弱。(2)制备时以水溶性药物与淀粉共同构成水相，经乳化聚合球后，药物直接被包在球内。主要对酶、蛋白质大分子药物应用此法。但小分子的包埋效果不如大分子，渗漏较快，载药率低。(3)偶联、通过某些桥联化合物将微球与药物连接起来，通过化学方法将药物分子连接到微球上，对小分子药物有较好的效果。但其对药物分子结构有要求，且载药率低，药物与载体之间的偶联与去偶联并总是可逆的，这些因素都限制了其的进一步应用。目前我国对淀粉纳米颗粒载药的研究主要以吸附法和包埋法为主。

对于疑难病的诊断和治疗：由于纳米淀粉微球比红血球(直径6-9um)小得多，可以在血液中自由移动，因此可进入到人体的各个部位，检测病变和进行治疗。

生物物质的吸附分离：纳米淀粉颗粒粒径很小，具有巨大的表面积，使纳米粒子具有较高的胶体稳定性和较好的吸附性能，能较快地达到吸附分离。将纳米淀粉压成薄片制成过滤器，在医药工业中可用于血清的消毒。

谷胱甘肽的应用前景非常广阔，然而谷胱甘肽被摄入体内进入胃肠消化时，可能会因为胃内的酸度高以及各种酶的作用而发生降解甚至会失活，使其生物利用度降低。因而需要制备一种谷胱甘肽纳米缓释胶囊，降低谷胱甘肽在胃内的消化率。

发明内容

本发明目的在于提供一种胃内的消化率低，在肠道内释药谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备方法及其应用。

一种谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备方法，采用生物酶法制备纳米淀粉颗粒，并且用其作为谷胱甘肽的包埋材料制备谷胱甘肽纳米缓释胶囊，其制备步骤为：

(1)蜡质玉米淀粉短直链糊液的制备

称取7.1g磷酸氢二钠溶于250ml水中，称取4.803g柠檬酸溶于250ml水中，二者混合，调节pH至4.6；称取10-20g脱脂的蜡质玉米淀粉溶于100ml配置好的缓冲溶液，搅拌均匀，沸水浴处理40min，使其充分糊化；糊化后的糊液冷却至58℃，加入普鲁兰酶，加酶量约为20-40aspu/g干淀粉，其中aspu是活力单位，脱支处理4-6h，离心2min，去除部分未脱支完全的淀粉链沉淀，得到上清液；灭酶处理15min，再次粗离心2min，将变性的酶去除。

(2)谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备

将步骤(1)中灭酶粗离心处理后的蜡质玉米淀粉短直链糊液冷却至50℃，备用；称取1-4g谷胱甘肽溶于2ml水中，加入冷却的短直链淀粉糊液中搅拌均匀，静置冷却至室温，放置于2-25℃的冰箱中，重结晶8-24小时，形成淀粉纳米颗粒；用蒸馏水水洗3-4次，去除缓冲液；将水洗后的溶液放置于大烧杯中，备用于包埋率的测定；将水洗完的淀粉纳米颗粒放置于-70℃的冰箱中冻结，进行真空冷冻干燥，得到谷胱甘肽纳米缓释胶囊。

本发明的包埋谷胱甘肽的蜡质玉米纳米淀粉颗粒其粒径基本分布在230-540nm之间，在300nm左右分布最多。

本发明的步骤(1)中优选15g脱脂的蜡质玉米淀粉溶于100ml配置好的缓冲溶液。

本发明步骤(2)中优选谷胱甘肽加入量是2g。

本发明步骤(2)中的重结晶温度优选4℃，时间8-10小时。

本发明步骤(1)中加入普鲁兰酶，加酶量为30aspu/g干淀粉

本发明具有如下优点：

采用生物酶法制备纳米淀粉颗粒，制备纳米淀粉的产率高，成本低，方法更加安全环保。并且用其作为谷胱甘肽的包埋材料，测定其包埋之后粒径大小、包埋率^]、吸热特性、结晶度以及消化性的特性，结果表明纳米淀粉包埋谷胱甘肽之后在胃内的消化率低，在肠道内释药。

附图说明

图1谷胱甘肽纳米缓释胶囊研制的试验流程图

图2普通蜡质玉米纳米淀粉(a)与包埋谷胱甘肽的蜡质玉米纳米淀粉(b)的粒径

图3普通蜡质玉米纳米淀粉颗粒(a)和包埋谷胱甘肽的蜡质玉米纳米淀粉颗粒(b)光学显微镜下观察结果

图4普通蜡质玉米纳米淀粉颗粒(a)和包埋谷胱甘肽的蜡质玉米纳米淀粉颗粒(b)透射电镜观察结果

图5DSC图，(a)普通蜡质玉米纳米淀粉；(b)普通蜡质玉米纳米淀粉rescan；(c)包埋谷胱甘肽的蜡质玉米纳米淀粉；(d)包埋谷胱甘肽的蜡质玉米纳米淀粉rescan

图6纳米淀粉X衍射图，其中SNP：蜡质玉米淀粉纳米颗粒；SNP+GSH：包埋谷胱甘肽的淀粉纳米颗粒

图7谷胱甘肽标样测定的标准曲线

图8蜡质玉米纳米淀粉包埋谷胱甘肽的消化曲线

具体实施方式

下面结合实施例进一步描述本发明，但并不限制本发明的保护范围。

1.试验材料与试剂

2.仪器与设备

3.检测方法

3.1谷光甘肽纳米缓释胶囊粒径及形貌测定

3.1.1动态光散射测定缓释胶囊粒径的大小

首先配制0.1％的谷胱甘肽纳米缓释胶囊悬液，室温下超声处理5min，使其分散均匀。用移液枪取1mL悬液，沿比色皿边缘一角缓缓注入后，放入测试台中测试，每个样品分别测试三次，去平均值。

3.1.2光学显微镜观察

配制0.1％的谷胱甘肽纳米缓释胶囊悬液于试管中，超声处理10min，使其分散均匀，取适量样品悬液滴于载玻片上，盖上盖玻片，用滤纸吸取边缘多余悬液。在光学显微镜下进行观察。

3.1.3谷胱甘肽纳米缓释胶囊的透射电镜测定

将包埋谷胱甘肽的蜡质玉米淀粉纳米颗粒溶入超纯水中，再通过0.22μm的醋酸纤维膜，超声15min使其充分分散均匀后，静置5min，滴于带有碳支持膜的铜网上，并将多余的溶液用滤纸吸走，再对铜网冷冻干燥，将干燥后的样品放入透射电子显微镜系统中，抽真空5min，在2kv加速电压下观察，拍照。

3.2谷胱甘肽纳米缓释胶囊吸热图谱的测定

用差示热量扫描仪(DSC)测定缓释胶囊的吸热谱图，称取10-11mg左右的样品放于铝制坩埚内，加入20μl左右的水，平衡水分过夜，测定样品的吸热曲线。并以普通淀粉纳米颗粒为空白组对照。DSC参数设定为：起始温度：25℃，终止温度：135℃，升温速率：10℃/min，进行rescan扫描，实验平行测定3次。

3.3谷胱甘肽纳米缓释胶囊的X衍射测定

采用X射线衍射分析仪测定谷胱甘肽纳米缓释胶囊的结晶度变化。平衡样品中水分含量至恒定于20％，X-射线衍射测定条为：Cu Kα辐射，管压40kV，管流30mA，扫描速度4°/min，扫描范围2Y：4～40°，步长0.028，接受狭缝0.2mm，通过软件MDIJade 5.0计算结晶度。

3.4谷胱甘肽纳米缓释胶囊包埋率的测定

3.4.1谷胱甘肽标准曲线的绘制

准确称取谷胱甘肽标样0.02g溶于100ml蒸馏水中，分别取1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml加蒸馏水配成10ml溶液，得到浓度为0.02g/L，0.04g/L，0.08g/L，0.10g/L，0.12g/L的溶液，分别取上述溶液1ml加入到装有1g硫酸铵的试管中，再加入3ml饱和硫酸铵溶液，0.5ml1％的亚硝基铁氰化钠，迅速加入0.7ml，8mol/L的氨水，在525nm波长下，测定其吸光度值(测定过程在30s内完成)。记录数据，制成标准曲线。

3.4.2谷胱甘肽包埋率的测定

将水洗后的备用溶液定容至500ml，取其中1ml于试管中，加入9ml水稀释至原来的10倍，加入1g硫酸铵。继续加入3ml硫酸铵饱和溶液，0.5ml1％的亚硝基铁氰化钠溶液，立即加入0.7ml8mol/l的氨水在525nm的波长下30s内测定其吸光度。根据标准曲线得到水洗液中谷胱甘肽的浓度，测定其水洗液中所含谷胱甘肽的含量。依据公式(1-1)可以求得包埋率

Y＝(M₁-M₂)/M₁×100％    (1-1)

式中，M₁为进行包埋的的谷胱甘肽总量(g)；M₂为试验方法中，水洗液中谷胱甘肽的含量(g)；Y为谷胱甘肽的包埋率。

3.5体外模拟胃肠环境测定缓释效果

配制0.01mol/L的盐酸溶液，100ml备用。

取250mg谷胱甘肽纳米缓释胶囊溶于9ml，0.01mol/L(pH＝2.0)的盐酸溶液作为酶作用底物待用。

称取胃蛋白酶0.35g溶于50ml，0.01mol/L的盐酸溶液中，置于37℃的水浴中预热10min，取胃蛋白酶溶液1ml加入底物中(酶与底物的比为1∶35(w/w))，于37℃模拟胃环境消化2h(每隔一小时，取样检测一次。)，然后用0.9mol/L的碳酸氢钠将消化液调至pH为5.3，再用2mol/L的氢氧化钠将pH调至7.5。取1ml胰蛋白酶溶液(酶与底物的比为1∶50(w/w))加入到消化液中，在37℃下模拟肠消化4h，每隔一小时取样检测，每次取出的消化液样品置于沸水中灭酶10min，冷却至室温后检测^[20]。

胰蛋白酶溶液的配制方法如下：称取2.5g胰蛋白酶溶于50mlPBS溶液中，(PBS：称取0.027g磷酸二氢钾，0.142g磷酸氢二钠，0.8g氯化钠，0.02g氯化钾溶于100ml蒸馏水中)。

检测方法：将灭酶后的样品离心，取上清液。取干净试管，加入1g硫酸铵，1ml待测样，3ml硫酸铵饱和溶液，0.5ml，1％的亚硝基铁氰化钠溶液，立即加入0.7ml，8mol/L的氨水在525nm的波长下30s内完成测试。

实施例1

(1)蜡质玉米淀粉短直链糊液的制备

称取7.1g磷酸氢二钠溶于250ml水中，称取4.803g柠檬酸溶于250ml水中，二者混合，调节pH至4.6；称取15g脱脂的蜡质玉米淀粉溶于100ml配置好的缓冲溶液，搅拌均匀，沸水浴处理40min，使其充分糊化；糊化后的糊液冷却至58℃，加入普鲁兰酶，加酶量约为30aspu/g干淀粉，脱支处理4-6h，离心2min，去除部分未脱支完全的淀粉链沉淀，得到上清液；灭酶处理15min，再次粗离心2min，将变性的酶去除

(2)谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备

将步骤(1)中灭酶粗离心处理后的蜡质玉米淀粉短直链糊液冷却至50℃，备用；称取2g谷胱甘肽溶于2ml水中，加入冷却的短直链淀粉糊液中搅拌均匀，静置冷却至室温，放置于4℃的冰箱中，重结晶8-10小时，形成淀粉纳米颗粒；用蒸馏水水洗3-4次，去除缓冲液；将水洗后的溶液放置于大烧杯中，备用于包埋率的测定；将水洗完的淀粉纳米颗粒放置于-70℃的冰箱中冻结，在进行真空冷冻干燥，得到谷胱甘肽纳米缓释胶囊。

实施例2

(1)蜡质玉米淀粉短直链糊液的制备

称取7.1g磷酸氢二钠溶于250ml水中，称取4.803g柠檬酸溶于250ml水中，二者混合，调节pH至4.6；称取10g脱脂的蜡质玉米淀粉溶于100ml配置好的缓冲溶液，搅拌均匀，沸水浴处理40min，使其充分糊化；糊化后的糊液冷却至58℃，加入普鲁兰酶，加酶量约为20aspu/g干淀粉，脱支处理4-6h，离心2min，去除部分未脱支完全的淀粉链沉淀，得到上清液；灭酶处理15min，再次粗离心2min，将变性的酶去除。

(2)谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备

将步骤(1)中灭酶粗离心处理后的蜡质玉米淀粉短直链糊液冷却至50℃，备用；称取2g谷胱甘肽溶于2ml水中，加入冷却的短直链淀粉糊液中搅拌均匀，静置冷却至室温，放置于15℃的冰箱中，重结晶15-18小时，形成淀粉纳米颗粒；用蒸馏水水洗3-4次，去除缓冲液；将水洗后的溶液放置于大烧杯中，备用于包埋率的测定；将水洗完的淀粉纳米颗粒放置于-70℃的冰箱中冻结，在进行真空冷冻干燥，得到谷胱甘肽纳米缓释胶囊。

实施例3

(1)蜡质玉米淀粉短直链糊液的制备

称取7.1g磷酸氢二钠溶于250ml水中，称取4.803g柠檬酸溶于250ml水中，二者混合，调节pH至4.6；称取20g脱脂的蜡质玉米淀粉溶于100ml配置好的缓冲溶液，搅拌均匀，沸水浴处理40min，使其充分糊化；糊化后的糊液冷却至58℃，加入普鲁兰酶，加酶量约为40aspu/g干淀粉，脱支处理4-6h，离心2min，去除部分未脱支完全的淀粉链沉淀，得到上清液；灭酶处理15min，再次粗离心2min，将变性的酶去除。

(2)谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备

将步骤(1)中灭酶粗离心处理后的蜡质玉米淀粉短直链糊液冷却至50℃，备用；称取4g谷胱甘肽溶于2ml水中，加入冷却的短直链淀粉糊液中搅拌均匀，静置冷却至室温，放置于25℃的冰箱中，重结晶20-24小时，形成淀粉纳米颗粒；用蒸馏水水洗3-4次，去除缓冲液；将水洗后的溶液放置于大烧杯中，备用于包埋率的测定；将水洗完的淀粉纳米颗粒放置于-70℃的冰箱中冻结，在进行真空冷冻干燥，得到谷胱甘肽纳米缓释胶囊。

制备的谷胱甘肽纳米缓释胶囊性能检测

1.谷胱甘肽纳米缓释胶囊的粒径大小

1.1动态光散射扫描图谱

如图2所示，未包埋谷胱甘肽的蜡质玉米淀粉纳米颗粒，其粒径基本分布在50-130nm左右，而包埋谷胱甘肽的蜡质玉米纳米淀粉颗粒其粒径基本分布在230-540nm之间，在300nm左右分布最多。由此可以看出，包埋谷胱甘肽之后的蜡质玉米纳米淀粉颗粒粒径明显增大，但粒径仍为纳米级，不影响其缓释效果，及药物利用率。奉建芳等人的研究了粒径＜100nm的纳米淀粉可提高药物在骨髓中的分布。粒径＜500nm的纳米粒由于炎症部位血管通透性增大而易于富集于炎症部位，有利于抗炎药物在炎症部位的作用时间，从而提高药物的抗炎症效果。

1.2光学显微镜观察

图3所示的是在物镜40倍，目镜10倍下的淀粉纳米颗粒光学显微镜观察结果。由图中可以看出，蜡质玉米淀粉纳米颗粒在包埋谷胱甘肽前后，其颗粒形态基本保持不变，均为圆形，或椭圆形球体；普通蜡质玉米淀粉纳米颗粒的粒径在120nm左右，包埋谷胱甘肽后的蜡质玉米淀粉纳米颗粒粒径增大为340nm左右，颗粒增大，但仍为纳米粒子。

1.3透射电镜下观察

由图4(a)可以看出，未包埋谷胱甘肽的蜡质玉米淀粉纳米颗粒大多呈球形，结构紧凑，致密。由图4(b)可以看出包埋谷胱甘肽之后的蜡质玉米纳米淀粉颗粒呈球形，形状规则，大小均匀。图4a与图4b相比可以看出，经过包埋谷胱甘肽的蜡质玉米纳米淀粉，颗粒粒径明显增大，但淀粉纳米颗粒的形态并未发生较大变化。

2.谷光甘肽纳米缓释胶囊的吸热谱图

表1纳米淀粉的DSC谱图参数

由表1可知，普通蜡质玉米纳米淀粉的起始糊化温度是48.31℃，峰值温度为84.36℃，终止温度为101.55℃，图5中所示的吸热峰为淀粉的糊化峰。普通蜡质玉米纳米淀粉在第二次扫描(rescan)时，糊化的起始温度由原来的48.31℃升高到74.90℃，淀粉糊化的起始温度升高，说明蜡质玉米淀粉纳米颗粒在第一次扫描时糊化，在第二次扫描时糊化的淀蜡质玉米淀粉部分回生，回生后的淀粉结构变得更加致密不易糊化从而使其温度升高，其焓值由原来的-10.39Jg^-1下降到-8.03Jg^-1，其原因是糊化的淀粉只有一部分回生，另一部分还处于糊化状态使得吸热焓值下降。

通过对比普通蜡质玉米纳米淀粉与包埋谷胱甘肽之后的蜡质玉米纳米淀粉可知包埋后其最大的特点是焓值升高，由原来的-10.39Jg^-1上升到-14.26Jg^-1，这说明包埋谷胱甘肽之后其结晶结构变得更加致密。

对比包埋谷胱甘肽蜡质玉米纳米淀粉的第一次与rescan的结果，焓值由原来的-14.26Jg^-1下降至-2.56Jg^-1，主要可能是由于包埋谷胱甘肽之后淀粉不易回生导致的。

4.X衍射结果

如图6所示，普通蜡质玉米淀粉纳米颗粒的结晶峰在5.6°、15°、17°、22°、24°，属于B+V型淀粉结晶，与徐忠等(2005)研究湿热处理对不同淀粉颗粒结构及性质的影响时结论相似，而包埋谷胱甘肽的淀粉纳米颗粒的晶型基本不变，但在15°处的特征峰消失，其他结晶峰强度显著增强；在19.5°处的V型淀粉特征峰更加明显；结晶度显著提高，由未包埋前的55.41％增大至70.15％。

淀粉颗粒中的微晶区域与淀粉来源、直链淀粉含量、颗粒含水量、基因种类、淀粉颗粒的大小、高低温作用经历以及淀粉的成熟程度等因素有关^[23]。英国科学家Bogracheva等人^[24]通过研究发现，淀粉颗粒的水分含量会影响淀粉颗粒的结晶度。他们研究发现，当水分含量处于10％-50％之间时不会影响到淀粉颗粒中的双螺旋结构比例，结晶度的提高只是由于原有的双螺旋结构结合到了微晶结构中的原因。但是当水分含量降低到1％-3％时，会导致双螺旋结构比例的明显降低。Tang^[25]等人研究发现随着淀粉颗粒从大到小变化，淀粉的结晶度也会发生从大到小变化。较大的颗粒含有较少的直链淀粉，而较小的颗粒则含有较多的直链淀粉，直链淀粉含量越低结晶度越高。

图6出现这一结果可能是由于包埋谷胱甘肽之后，谷胱甘肽与水结合使得纳米淀粉颗粒非结晶区中游离的直链淀粉发生相对移动，向双螺旋结构发生转变，同时结晶区的双螺旋结构更加紧密，使晶体排列更加有序，而双螺旋结构的转变增加了淀粉的结晶度。或者是包埋谷胱甘肽之后纳米淀粉颗粒增大，使得直链淀粉含量下降，结晶度增加。

5.包埋率测定结果

表2为水洗液稀释10倍四次平行试验的结果

名称	1	2	3	4
					吸光度(A)	0.408	0.409	0.408	0.407

由表2可知水洗液稀释10倍平行测定，四次吸光度的平均值为0.408A，通过图7中公式y＝2.0621x(y：谷胱甘肽标样的吸光度，x：溶液中谷胱甘肽标样的浓度)可得谷胱甘肽的含量为0.198g/L，又因为定容至500ml由此可以得出水洗液中谷胱甘肽的含量0.99g。由公式1-1可得谷胱甘肽的包埋率为50.5％。蜡质玉米纳米淀粉包埋谷胱甘肽的包埋率达到50％以上，说明蜡质玉米纳米淀粉具有良好的吸附药物的特性，能够作为载药基质。

5.胶囊消化性的测定

如图8所示，未加入胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化曲线中谷胱甘肽含量虽有一部分下降，但下降并不明显。这充分说明蜡质玉米淀粉纳米作为谷光甘肽载体，耐强酸环境，稳定性好。加入胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟胃肠道环境后，谷胱甘肽纳米缓释胶囊在前2h的胃部消化过程中，吸光度变化值接近于0，这表明用蜡质玉米纳米淀粉包埋谷胱甘肽之后对胃蛋白酶的抗消化性较强，在胃内基本不消化吸收。然而在肠消化阶段，谷胱甘肽的含量呈现出急剧降低的趋势，尤其是在在肠内消化一个小时下降最多，这表明用蜡质玉米纳米淀粉包埋谷胱甘肽之后对胰蛋白酶的抗消化性差。由此可见蜡质玉米淀粉纳米颗粒，能够很好的保护谷胱甘肽在胃内不被分解而在肠道内被很好的消化吸收，提高生物利用率。

Claims (6)

1.一种谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备方法，采用生物酶法制备纳米淀粉颗粒，并且用其作为谷胱甘肽的包埋材料制备谷胱甘肽纳米缓释胶囊，其制备步骤为：

(1)蜡质玉米淀粉短直链糊液的制备

称取7.1g磷酸氢二钠溶于250ml水中，称取4.803g柠檬酸溶于250ml水中，二者混合，调节pH至4.6；称取10-20g脱脂的蜡质玉米淀粉溶于100ml配置好的缓冲溶液，搅拌均匀，沸水浴处理40min，使其充分糊化；糊化后的糊液冷却至58℃，加入普鲁兰酶，加酶量为20-40aspu/g干淀粉，脱支处理4-6h，离心2min，去除部分未脱支完全的淀粉链沉淀，得到上清液；灭酶处理15min，再次粗离心2min，将变性的酶去除；

(2)谷胱甘肽纳米缓释胶囊的制备

将步骤(1)中灭酶粗离心处理后的蜡质玉米淀粉短直链糊液冷却至50℃，备用；称取1-4g谷胱甘肽溶于2ml水中，加入到冷却的短直链淀粉糊液中搅拌均匀，静置冷却至室温，放置于2-25℃的冰箱中，重结晶8-24小时，形成淀粉纳米颗粒；用蒸馏水水洗3-4次，去除缓冲液；将水洗后的溶液放置于大烧杯中，备用于包埋率的测定；将水洗完的淀粉纳米颗粒放置于-70℃的冰箱中冻结，进行真空冷冻干燥，得到谷胱甘肽纳米缓释胶囊。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的包埋谷胱甘肽的蜡质玉米纳米淀粉颗粒其粒径基本分布在230-540nm之间。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中将15g脱脂的蜡质玉米淀粉溶于100ml配置好的缓冲溶液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中谷胱甘肽加入量是2g。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中的重结晶温度为4℃，时间8-10小时。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中加入普鲁兰酶，加酶量为30aspu/g干淀粉。