CN107674897A - 一种由β‑胡萝卜素发酵液中提取蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明以β‑胡萝卜素发酵废液为原料生产低分子量的蛋白质，既减少了对资源的浪费，同时又很好的解决了发酵液对环境造成污染的问题，具有良好的应用前景。同时，本发明原料成本低，设备简单，操作方便，易于实现规模化生产，提高了产业附加值。

Description

一种由β-胡萝卜素发酵液中提取蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及一种由β-胡萝卜素发酵液中提取蛋白质的方法，尤其涉及菌丝体的收集破碎和蛋白质分离提取的生产技术。
背景技术
β-胡萝卜素(C40H56)是类胡萝卜素之一，也是橘黄色脂溶性化合物，它是自然界中最普遍存在也是最稳定的天然色素。许多天然食物中例如：绿色蔬菜、甘薯、胡萝卜、菠菜、木瓜、芒果等，皆存有丰富的β-胡萝卜素。β-胡萝卜素是一种抗氧化剂，具有解毒作用，是维护人体健康不可缺少的营养素，在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上有显著的功能，并进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。
β-胡萝卜素的应用包括：1.主要应用于食品、保健品和药品；2.食用橙色色素；营养强化剂。主要用于人造奶油、面条、糕点、饮料和保健食品等。3.作营养强化剂和食品着色剂。我国规定可用于各类食品，按生产需要适量使用。4.作为饲料维生素营养强化剂和着色剂。5.营养增补剂和色素。按我国卫生部颁布的“食品营养强化剂使用卫生标准(1993)”规定，可用于奶油及膨化食品，最大使用量0.2g/kg。该品0.6μg的生理作用相当于1国际单位(I·U·)的维生素A。现广泛用作黄色色素代替油溶性焦油系色素，如用于原为就含有胡萝卜素的奶油、干酪、蛋黄酱等，并广泛应用于其他食用油脂、人造奶油、起酥油、糕点、面包等。用于油性食品时，常溶解于棉籽油之类的食用油或悬浊制剂(含量30％)。经稀释后即便于使用，也可防止β-胡萝卜素氧化。一般添加α-生育酚、硬脂酰抗坏血酸酯、BHA等的抗氧化剂。用作色素添加量较少，如用于人造奶油为1.37mg/kg。在果汁中与维生素C合用，可提高稳定性。6.药物。饲料和食品添加剂。营养增补剂和色素。
β-胡萝卜素的微生物发酵法目前主要由高产优良菌种丝状真菌三孢布拉霉来生产，但发酵后仍会保留一定量的菌丝体、蛋白质等物质，如果超滤截留成分则粘度比较大，如果直接舍弃则浪费资源和污染环境。为了有效的利用资源，保护环境，有必要对β-胡萝卜素的发酵废液进行处理，提取其中有用物质，并降低其对环境的破坏。从这个意义上说，从β-胡萝卜素发酵液中提取蛋白质用作饲料蛋白具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种从β-胡萝卜素发酵液中提取蛋白质的方法，该方法可方便、快捷地将蛋白质从废液中提取出来，可将提取的蛋白质进一步作为生产饲料的原料。本发明的技术既减少了对资源的浪费，同时又很好的解决了发酵液对环境造成污染的问题，具有良好的应用前景。
本发明提供了一种从β-胡萝卜素发酵液中提取蛋白质的方法，步骤如下：
(1)将β-胡萝卜素发酵液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从废液中截留出来，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为2000道尔顿，进水压力1.1-1.2Mpa，超滤温度24℃，发酵液pH值6.5-7.2；
(2)将步骤(1)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压均质机将所得悬浊液进行破碎处理；水的加入体积与截留成分的体积比为1:3.5-1:6；超低温速冻温度为-50--60℃，速冻时间为12min；悬浊液通过高压均质机的压力为170Mpa，流速为110m/s；
(3)将步骤(2)的悬浊液的pH调至pH为7，加入蛋白复合酶A，酶解提取其中的蛋白质成分；所述蛋白复合酶A由枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶Y、中性蛋白酶组成，其组成为枯草杆菌蛋白酶：羧肽酶Y：中性蛋白酶的质量比例为1：1.5-1.8：2.0-2.2，酶解温度为30℃，酶的用量为悬浊液质量的2.5％-3％，酶解时间为3h；
(4)将步骤(3)中水解后的液体再次用超滤膜进行超滤处理，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为1000道尔顿，进水压力1.5-1.6Mpa，超滤温度20℃；
(5)将步骤(4)的截留成分加入水后搅拌均匀，水的加入体积与截留成分的体积比为1:5-6，调节pH为7.5，再加入蛋白复合酶B，进一步酶解其中的蛋白质成分，所述蛋白复合酶B由无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K组成，其组成为无花果蛋白酶：木瓜蛋白酶：蛋白酶K的质量比例为1：1.1-1.2：0.7-0.9，酶解温度为32℃，酶的用量为悬浊液质量的3.0％-4.2％，酶解时间为4h；
(6)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液，离心在32℃下进行，转速为3000rpm，时间为2h；
(7)调节步骤(6)所述上清液的pH至4.5-5.0，使蛋白质絮凝沉降，沉降时间为12h，过滤，收集沉淀，干燥沉淀，得到蛋白粉，干燥采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥进风温度为200℃，出风温度为100℃。
本发明具有的优点和积极效果：
本发明以β-胡萝卜素发酵废液为原料生产低分子量的蛋白质，既减少了对资源的浪费，同时又很好的解决了发酵液对环境造成污染的问题，具有良好的应用前景。同时，本发明利用均质机对β-胡萝卜素发酵菌丝体等成分进行了先速冻后破碎，且采用了两次超滤和酶解的方式，采用具有特定配比和组成的复合蛋白酶对废液中的蛋白质进行了提取，蛋白质的提取率高，分子量小，以此蛋白生产的饲料将更容易为动物吸收。另外，本发明原料成本低，设备简单，操作方便，易于实现规模化生产，减小了废液对环境的污染，提高了产业附加值。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。
下述实施例中，采用30wt％的盐酸溶液、30wt％的氢氧化钠溶液调节pH。
实施例1
(1)将β-胡萝卜素发酵液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从废液中截留出来，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为2000道尔顿，进水压力1.1Mpa，超滤温度24℃，发酵液pH值7.2；
(2)将步骤(1)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压均质机将所得悬浊液进行破碎处理；水的加入体积与截留成分的体积比为1:3.5；超低温速冻温度-60℃，速冻时间为12min；悬浊液通过高压均质机的压力为170Mpa，流速为110m/s；
(3)将步骤(2)的悬浊液的pH调至pH为7，加入蛋白复合酶A，酶解提取其中的蛋白质成分；所述蛋白复合酶A由枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶Y、中性蛋白酶组成，其组成为枯草杆菌蛋白酶：羧肽酶Y：中性蛋白酶的质量比例为1：1.8：2.0，酶解温度为30℃，酶的用量为悬浊液质量的3％，酶解时间为3h；
(4)将步骤(3)中水解后的液体再次用超滤膜进行超滤处理，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为1000道尔顿，进水压力1.5Mpa，超滤温度20℃；
(5)将步骤(4)的截留成分加入水后搅拌均匀，水的加入体积与截留成分的体积比为1:，调节pH为7.5，再加入蛋白复合酶B，进一步酶解其中的蛋白质成分，所述蛋白复合酶B由无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K组成，其组成为无花果蛋白酶：木瓜蛋白酶：蛋白酶K的质量比例为1：1.2：0.9，酶解温度为32℃，酶的用量为悬浊液质量的4.2％，酶解时间为4h；
(6)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液，离心在32℃下进行，转速为3000rpm，时间为2h；
(7)调节步骤(6)所述上清液的pH至5.0，使蛋白质絮凝沉降，沉降时间为12h，过滤，收集沉淀，干燥沉淀，得到蛋白粉，得到蛋白粉189.6g，干燥采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥进风温度为200℃，出风温度为100℃。
实施例2
(1)将β-胡萝卜素发酵液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从废液中截留出来，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为2000道尔顿，进水压力1.2Mpa，超滤温度24℃，发酵液pH值6.5；
(2)将步骤(1)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压均质机将所得悬浊液进行破碎处理；水的加入体积与截留成分的体积比为1:6；超低温速冻温度为-50℃，速冻时间为12min；悬浊液通过高压均质机的压力为170Mpa，流速为110m/s；
(3)将步骤(2)的悬浊液的pH调至pH为7，加入蛋白复合酶A，酶解提取其中的蛋白质成分；所述蛋白复合酶A由枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶Y、中性蛋白酶组成，其组成为枯草杆菌蛋白酶：羧肽酶Y：中性蛋白酶的质量比例为1：1.5：2.2，酶解温度为30℃，酶的用量为悬浊液质量的2.5％，酶解时间为3h；
(4)将步骤(3)中水解后的液体再次用超滤膜进行超滤处理，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为1000道尔顿，进水压力1.6Mpa，超滤温度20℃；
(5)将步骤(4)的截留成分加入水后搅拌均匀，水的加入体积与截留成分的体积比为1:6，调节pH为7.5，再加入蛋白复合酶B，进一步酶解其中的蛋白质成分，所述蛋白复合酶B由无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K组成，其组成为无花果蛋白酶：木瓜蛋白酶：蛋白酶K的质量比例为1：1.1：0.7，酶解温度为32℃，酶的用量为悬浊液质量的3.0％，酶解时间为4h；
(6)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液，离心在32℃下进行，转速为3000rpm，时间为2h；
(7)调节步骤(6)所述上清液的pH至4.5，使蛋白质絮凝沉降，沉降时间为12h，过滤，收集沉淀，干燥沉淀，得到蛋白粉，得到蛋白粉195.2g，干燥采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥进风温度为200℃，出风温度为100℃。
实施例3
实施例1或2中所回收的蛋白质的质量检测，检测回收物中蛋白质的质量分布，结果见表1：
表1回收蛋白质的分子量分布
分子量(道尔顿) 实施例1(％) 实施例2(％)
大于5000 1.8 3.2
4000-5000 5.2 3.5
3000-4000 4.9 2.2
2000-3000 6.7 7.4
1000-2000 81.4 83.7
由上述质量检测的结果可以看出，使用本发明所述的提取方法所得到的蛋白质中，分子量处于1000-2000道尔顿的蛋白质的含量大于80％，将所述的蛋白质用作饲料之后，易被动物吸收，具有良好的效果。

Claims (3)

1.一种从β-胡萝卜素发酵液中提取蛋白质的方法，其特征在于：该方法以β-胡萝卜素发酵废液为原料，对β-胡萝卜素发酵菌丝体等成分进行了先速冻后破碎，且采用了两次超滤和酶解的方式，采用具有特定配比和组成的复合蛋白酶对废液中的蛋白质进行了提取。
2.根据权利要求1所述的从β-胡萝卜素发酵液中提取蛋白质的方法，其具体的步骤如下：
(1)将β-胡萝卜素发酵液用超滤膜进行超滤处理，将其中的菌丝体和蛋白质等大分子物质从废液中截留出来，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为2000道尔顿，进水压力1.1-1.2Mpa，超滤温度24℃，发酵液pH值6.5-7.2；
(2)将步骤(1)超滤所得的截留成分加入水搅拌均匀，然后采用超低温速冻技术将截留成分溶液速冻，得悬浊液，然后再用高压均质机将所得悬浊液进行破碎处理；水的加入体积与截留成分的体积比为1:3.5-1:6；超低温速冻温度为-50--60℃，速冻时间为12min；悬浊液通过高压均质机的压力为170Mpa，流速为110m/s；
(3)将步骤(2)的悬浊液的pH调至pH为7，加入蛋白复合酶A，酶解提取其中的蛋白质成分；所述蛋白复合酶A由枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶Y、中性蛋白酶组成，其组成为枯草杆菌蛋白酶：羧肽酶Y：中性蛋白酶的质量比例为1：1.5-1.8：2.0-2.2，酶解温度为30℃，酶的用量为悬浊液质量的2.5％-3％，酶解时间为3h；
(4)将步骤(3)中水解后的液体再次用超滤膜进行超滤处理，收集截留成分；所述超滤膜的截留分子量为1000道尔顿，进水压力1.5-1.6Mpa，超滤温度20℃；
(5)将步骤(4)的截留成分加入水后搅拌均匀，水的加入体积与截留成分的体积比为1:5-6，调节pH为7.5，再加入蛋白复合酶B，进一步酶解其中的蛋白质成分，所述蛋白复合酶B由无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K组成，其组成为无花果蛋白酶：木瓜蛋白酶：蛋白酶K的质量比例为1：1.1-1.2：0.7-0.9，酶解温度为32℃，酶的用量为悬浊液质量的3.0％-4.2％，酶解时间为4h；
(6)将酶解所得的酶解液进行离心分离，收集上清液，离心在32℃下进行，转速为3000rpm，时间为2h；
(7)调节步骤(6)所述上清液的pH至4.5-5.0，使蛋白质絮凝沉降，沉降时间为12h，过滤，收集沉淀，干燥沉淀，得到蛋白粉，干燥采用喷雾干燥的方法，喷雾干燥进风温度为200℃，出风温度为100℃。
3.根据权利要求1或2所述的从β-胡萝卜素发酵液中提取蛋白质的方法，其中采用30wt％的盐酸溶液、30wt％的氢氧化钠溶液来调节pH。
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