CN104152518B - 一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，本发明包括以下步骤：（1）鳕鱼皮预处理；（2）酶解反应：加入胰蛋白酶酶解反应；（3）超滤得GM2组分；（4）DEAE‑Sepharose FF离子交换层析分离得到GM2‑2组分；（5）Sephadex G‑25层析分离得GM2‑2‑3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型胶原蛋白肽。本发明以水产加工副产物鳕鱼皮为原料，从中提取具有肝细胞修复作用的胶原蛋白肽，简单易行，生产成本低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保护了环境，还能为开发相关功能性食品提供前期基础。
Description
技术领域
本发明涉及海洋生物提取技术领域，特别涉及一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法。
背景技术
鳕鱼皮由于其蛋白含量高，故其主要的生物活性成分即为活性肽。现在研究发现，鳕鱼皮生物活性肽具有抗氧化、抗病毒、抗胃溃疡等作用。Dai-Hung Ngo等从太平洋鳕鱼皮中分离纯化两种胶原蛋白肽，Thr-Cys-Ser-Pro (388 Da)和 Thr-Gly-Gly-Gly-Asn-Val(485.5 Da)。通过电子自旋共振法证明了纯化的肽的抗氧化活性， 同时也具有血管紧张素转换酶抑制作用，说明鳕鱼皮胶原蛋白肽具有抗氧化和抗高血压的作用（Dai-Hung Ngoa,BoMi Ryua, Thanh-Sang Voa, et al. Free radical scavenging and angiotensin-Iconverting enzyme inhibitory peptidesfrom Pacific cod (Gadus macrocephalus)skin gelatin [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 4(9):1110–1116）。宛宁从鳕鱼皮中分离的到一种胶原蛋白肽PGEKGPSGEAGTAGPPGTPGPQGL，该肽能直接作用于病毒颗粒，病毒的凝集价显著降低且成剂量依赖性，具有极强的流感病毒神经氨酸酶抑制活性，活性肽的抗病毒作用具有多靶点（苑宁. 鳕鱼皮中流感病毒神经氨酸酶抑制活性肽的研究[D].青岛:中国海洋大学,2013）。王志聪等探究鳕鱼皮胶原蛋白肽的抗酒精性胃溃疡作用，采用酒精诱导大鼠急性胃溃疡模型，试验组灌胃给予不同剂量的胶原肽，检测胃溃疡指数、胃溃疡抑制率并对胃溃疡病灶部位进行组织学观察。结果与模型组相比，各受试物均能够降低大鼠胃腺的出血损伤，降低胃溃疡指数，具有良好的抗酒精性胃溃疡作用（王志聪,孙京沙,倪鑫,等. 鳕鱼皮胶原蛋白肽的抗酒精性胃溃疡作用[J].中国海洋药物杂志, 2012, 35(5):17-22 ）。
目前，胶原蛋白肽的保健功能主要在美容护肤、补钙健骨、止血免疫等方面，但是现在还未有研究关于胶原蛋白肽对肝脏的损伤保护作用，而现有的肝脏损伤的保护主要依靠各类药物，但是药物都存在一定的毒性和抗药性，生物活性肽是具有无毒、安全的特点，是理想的辅助治疗材料，亟需开发一种对肝脏的损伤保护效果好的生物活性肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，以水产加工副产物鳕鱼皮为原料，从中提取具有肝细胞修复作用的胶原蛋白肽，简单易行，生产成本低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保护了环境，还能为开发相关功能性食品提供前期基础。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）鳕鱼皮预处理：将鳕鱼皮洗净后用4℃纯水浸泡20-30min，后用浓度0.1-0.2mol/L NaOH 浸泡 6-8小时，用清水冲洗至 pH=7，沥干水分后，用浓度0.1-0.2mol/L的冰醋酸溶胀10-12小时，最后用剪刀剪碎；
（2）酶解反应：将步骤（1）预处理后的鳕鱼皮与水按照1:4（w/v）的料液比混合，然后加入胰蛋白酶酶解反应；
采用胰蛋白酶酶解的产物对肝细胞的损伤修复效果最好。
（3）超滤：步骤（2）酶解反应结束后，灭酶，离心，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，截留获得分子量为5-10KDa的组分，冷冻干燥后得GM2组分；GM2组分对肝细胞的损伤修复效果最好。
（4）DEAE-Sepharose FF离子交换层析分离：将GM2组分上DEAE-Sepharose FF离子交换柱，采用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后得到GM2-2组分；GM2-2组分对肝细胞的损伤修复效果最好。
（5）Sephadex G-25层析分离：将GM2-2组分经Sephadex G-25凝胶柱洗脱后，从上样开始计时，收集90-100min时间段洗脱液获得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型胶原蛋白肽。GM2-2-3组分对肝细胞的损伤修复效果最好。
作为优选，步骤（2）酶解条件为：胰蛋白酶用量为每g鳕鱼皮加入2000U，酶解温度50℃，pH 6，时间8h。这样的条件下酶解效果最好，所得产物对肝细胞的损伤修复效果最好。
作为优选，步骤（4）中DEAE-Sepharose FF离子交换柱的洗脱条件具体为： GM2组分加超纯水配制成200mg/ml的溶液上样，每次上样量为2ml，洗脱速度为1ml/min。
作为优选，步骤（5）中Sephadex G-25凝胶柱的洗脱条件具体为：
柱尺寸：2.6×80cm；柱料：Sephadex G-25，以5mg/ml压柱12h，至填充量为70±1cm；将GM2-2组分加超纯水配制成1mg/ml的溶液上样，上样量：1.5ml，超纯水洗脱，洗脱速度：0.5ml/min。
本发明的有益效果是：
1、简单易行，生产成本低，可以显著提高水产加工副产品的价值，避免浪费的同时还保护了环境，还能为开发相关功能性食品提供前期基础。
2、产品安全无毒，对肝细胞损伤修复作用好。
附图说明
图1是不同蛋白酶酶解鳕鱼皮所得组分作用经LPS诱导的Chang Liver细胞的细胞OD值。
图2是超滤所得不同组分作用经LPS诱导的Chang Liver细胞的细胞OD值。
图3是 GM2组分的DEAE-Sepharose FF离子柱分离图谱。
图4是GM2组分的DEAE-Sepharose FF离子柱分离所得不同组分作用经LPS诱导的Chang Liver细胞的细胞OD值。
图5是GM2-2组分 Sephadex G-25层析分离图谱。
图6是GM2-2组分Sephadex G-25层析分离所得不同组分作用经LPS诱导的ChangLiver细胞的OD值。
图7为本发明的产品对DPPH自由基的清除能力图。
图8为本发明的产品对ABTS自由基的清除能力图。
图9 是经本发明的产品作用LPS诱导的Chang Liver肝细胞细胞形态变化，其中A为正常组，B为LPS诱导组，C为低剂量（5mg/ml）GM2-2-3作用组 ，D为高剂量（10mg/ml ）GM2-2-3作用组。
图10为流式细胞仪的结果图，其中：A、正常组细胞； B、LPS诱导组细胞； C、低浓度GM2-2-3（5mg/ml）作用后细胞； D、高浓度GM2-2-3（10mg/ml）作用后细胞。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
及试剂
鳕鱼皮购自浙江舟山佳和加食品加工有限公司；正常人肝细胞：张氏肝细胞（Chang Liver细胞）购自中南大学湘雅医学院细胞中心，本实验室传代培养。
NaOH、冰醋酸等分析纯购自国药集团化学试剂有限公司；RPMI1640培养基购自Gibco 公司；胎牛血清(FBS) 购自杭州四季青生物制品有限公司；NaHCO3购自上海虹光化工厂；胰蛋白酶、MTT购自Sigma公司；青霉素、链霉素购自山东鲁抗医药股份有限公司；Sephadex G-25，上海源叶生物科技有限公司；大肠杆菌脂多糖（0111:B4 LPS）、四氮唑蓝（MTT）均购自sigma公司。
实施例1：
一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）鳕鱼皮预处理：将鳕鱼皮洗净后用4℃纯水浸泡20min，后用浓度0.1mol/LNaOH 浸泡8小时，用清水冲洗至 pH=7，沥干水分后，用浓度0.1mol/L的冰醋酸溶胀12小时，最后用剪刀剪碎成约1cm×1cm左右小块。
（2）酶解反应：将步骤（1）预处理后的鳕鱼皮与水按照1:4（w/v）的料液比混合，然后加入胰蛋白酶酶解反应，酶解条件为：胰蛋白酶用量为每g鳕鱼皮加入2000U，酶解温度50℃，pH 6，时间8h。
（3）超滤：步骤（2）酶解反应结束后，100℃水浴灭酶15min，4℃、10000转/min离心10min，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，截留获得分子量为5-10KDa的组分，冷冻干燥后得GM2组分。
（4）DEAE-Sepharose FF离子交换层析分离：将GM2组分上DEAE-Sepharose FF离子交换柱（购自亚太恒信公司），采用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液（醋酸浓度50mmol/l）作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后得到GM2-2组分；洗脱条件具体为： GM2组分加超纯水配制成200mg/ml的溶液上样，每次上样量为2ml，洗脱速度为1ml/min。
（5）Sephadex G-25层析分离：将GM2-2组分经Sephadex G-25凝胶柱洗脱后，从上样开始计时，收集90-100min时间段洗脱液获得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型胶原蛋白肽；
Sephadex G-25凝胶柱洗脱条件具体为：
柱尺寸：2.6×80cm；柱料：Sephadex G-25，以5mg/ml压柱12h，至填充量为70±1cm；将GM2-2组分加超纯水配制成1mg/ml的溶液上样，上样量：1.5ml，超纯水洗脱，洗脱速度：0.5ml/min。
实施例2：
一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）鳕鱼皮预处理：将鳕鱼皮洗净后用4℃纯水浸泡30min，后用浓度0.2mol/LNaOH 浸泡 6小时，用清水冲洗至 pH=7，沥干水分后，用浓度0.2mol/L的冰醋酸溶胀10小时，最后用剪刀剪碎成约1cm×1cm左右小块。
（2）酶解反应：将步骤（1）预处理后的鳕鱼皮与水按照1:4（w/v）的料液比混合，然后加入胰蛋白酶酶解反应，酶解条件为：胰蛋白酶用量为每g鳕鱼皮加入2000U，酶解温度50℃，pH 6，时间8h。
（3）超滤：步骤（2）酶解反应结束后，100℃水浴灭酶15min，4℃、10000转/min离心10min，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，截留获得分子量为5-10KDa的组分，冷冻干燥后得GM2组分。
（4）DEAE-Sepharose FF离子交换层析分离：将GM2组分上DEAE-Sepharose FF离子交换柱（购自亚太恒信公司），采用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液（醋酸浓度50mmol/l）作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后得到GM2-2组分；洗脱条件具体为： GM2组分加超纯水配制成200mg/ml的溶液上样，每次上样量为2ml，洗脱速度为1ml/min。
（5）Sephadex G-25层析分离：将GM2-2组分经Sephadex G-25凝胶柱洗脱后，从上样开始计时，收集90-100min时间段洗脱液获得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型胶原蛋白肽；
Sephadex G-25凝胶柱洗脱条件具体为：
柱尺寸：2.6×80cm；柱料：Sephadex G-25，以5mg/ml压柱12h，至填充量为70±1cm；将GM2-2组分加超纯水配制成1mg/ml的溶液上样，上样量：1.5ml，超纯水洗脱，洗脱速度：0.5ml/min。
工艺分析研究
1、最佳酶种及酶解条件选择
1.1选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶作供选酶，按照蛋白酶各自的最适作用温度和pH值(见表1)酶解已经预处理的鱼皮，加酶量为4000U/g，料液比为1:4，反应5h，酶解预处理后的鱼皮原料。
酶解完毕后，100℃灭酶10min，过滤后冷冻干燥，备用。
正交试验
在初步确定酶解条件的基础上，选择酶解时间、pH值、加酶量、温度等因素，设计正交试验，因素与水平见表2。
利用MTT方法（现有常规方法），确定鱼皮的最佳酶解条件。
1.3鳕鱼皮最佳酶种筛选结果
将经五种蛋白酶在其最优酶解条件下酶解所得鱼皮胶原蛋白肽，冷冻干燥，配制5mg/ml的溶液，作用已经LPS诱导的Chang Liver细胞，经MTT方法检测细胞OD值（OD值越高存活越好），结果见图1，由图1可知，经胰蛋白酶酶解后作用Chang Liver细胞，其存活OD值最高，故选择胰蛋白酶作为最佳酶种进行下步的正交试验。
胰蛋白酶酶解正交试验
选择酶解时间、温度、加酶量、pH等因素设计正交试验，以此确定最佳酶解工艺。因素水平表见表2，正交试验结果见表3。
表3表明，胰蛋白酶酶解物对Chang Liver细胞损伤修复作用最强的酶解条件为A2B2C1D1，即温度50℃，pH 6，时间8h，加酶量2000 U/g。
本研究通过选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶为供选酶种，作用已用LPS诱导的Chang Liver细胞，经MTT方法检测细胞OD值，并以此为指标对酶种进行筛选，结果表明胰蛋白酶的修复效果最好，选择胰蛋白酶为水解酶。
对胰蛋白酶进行正交试验优化，结果表明其最佳的酶解条件为酶解温度50℃，pH6，时间8h，加酶量2000 U/g。在该条件下的Chang Liver细胞MTT实验OD值均在0.6-0.7之间。
2、超滤结果优化
经胰蛋白酶在最优酶解条件下酶解得到的酶解液用10KDa、5KDa、3KDa和1KDa的滤膜超滤截留，得到5个组分，分别是GM1(>10KDa)、GM2(5~10KDa)、GM3(3~5KDa)、GM4(1~3KDa)和GM5(<1KDa)。各组分经冷冻干燥后，配制成5mg/ml的溶液，作用经LPS诱导的Chang Liver细胞，经MTT实验得出GM2作用后Chang Liver细胞的细胞OD值最高，细胞OD值为0.4830±0.0123（图2）。
3、DEAE-Sepharose FF离子交换层析分离结果优化
GM2组分上DEAE-Sepharose FF离子交换柱（购自亚太恒信公司）。洗脱条件：醋酸-醋酸钠缓冲液（醋酸浓度50mmol/l）平衡后（pH为4.5），将GM2组分配制成200mg/ml的溶液，每次上样量为2ml，分别用醋酸-醋酸钠缓冲液（pH为4.5）与NaCl溶液（由0-1mol/L梯度递增）进行洗脱（使用AKTA purifier仪器进行离子交换层析分离，A泵为醋酸-醋酸钠缓冲液，B泵为NaCl溶液，在0-150min内B泵由0%变至100%），洗脱速度为1ml/min，蛋白检测仪280nm进行检测，分别收集各洗脱峰，并冷冻干燥。共得到5个组分，即GM2-1、GM2-2（醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱而得）、GM2-3、GM2-4和GM2-5（图3）。各组分冷冻干燥后，配制成5mg/ml的溶液，作用经LPS诱导的Chang Liver细胞，经MTT实验得出GM2-2作用后Chang Liver细胞的细胞OD值最高，为0.5579±0.024（图4）。
确定目标肽（GM2-2）所在的洗脱峰，并对该峰大量收集，冷冻干燥，作为进一步纯化所用样品。
4、Sephadex G-25层析分离结果优化
Sephadex G-25层析分离，洗脱条件如下：柱尺寸：2.6×80cm；柱料：Sephadex G-25，以5mg/ml压柱12h，至填充量约为70cm；上样量：1.5ml（样品GM2-2浓度1mg/ml）；流动相：超纯水洗脱；流速：0.5ml/min；检测波长：280nm；自动收集速度：3.5min/管。
经sephadex G25凝胶柱洗脱后得到4个组分（图5），即GM2-2-1 GM2-2-2、GM2-2-3、GM2-2-4，各组分冷冻干燥后，配制成5mg/ml的溶液，作用经LPS诱导的Chang Liver细胞，经MTT实验得出GM2-2-3作用后Chang Liver细胞的细胞OD值最高，为0.5732±0.054（图6）。
5、肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽抗氧化活性研究结果
5.1 自由基清除率
由图7和图8可知，随着浓度的增加，本发明的产品具有清除自由基（DPPH自由基、ABTS自由基）的能力，10mg/ml的本发明的产品即可分别达到DPPH自由基清除率85.59±2.57%，ABTS自由基清除率为88.15±2.97%。
5.2抗氧化酶活性检测
机体内的抗氧化酶具有重要作用，一旦在体内形成过氧化物，它们即刻发挥作用，利用氧化还原作用将过氧化物转换为毒害较低或无害的物质。配制5mg/ml（低剂量）和10mg/ml（高剂量）的本发明的产品溶液，作用经过LPS处理的Chang Liver细胞（结果见表4），由表4可以知道，在LPS诱导组Chang Liver内的抗氧化酶被破坏，酶活性低，而经本发明的产品保护组细胞内的抗氧化酶活性明显升高。本发明的产品具有肝细胞保护功能。
6、肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽抗凋亡血清学观察
转氨酶是催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶。当肝脏细胞膜破裂损伤时，谷丙转氨酶GPT释放到血液内，于是血液内酶活力明显地增加。在临床上测定血液中转氨酶活力可作为诊断的指标，配制5mg/ml（低剂量）和10mg/ml（高剂量）的本发明的产品溶液，作用经过LPS处理的Chang Liver细胞，通过试剂盒法检测细胞上清液中AST、ALT、ALP、γ-GT、LDH的活性（结果见表5）。由表5可知而经本发明的产品保护组细胞内的肝功能酶活性明显升高。本发明的产品具有肝细胞保护功能。
、肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽抗凋亡形态学观察
Hoechst 33258（市售）是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。染色后用荧光显微镜观察染色结果，由图9可明显看出，经本发明的产品作用LPS诱导的Chang Liver肝细胞后，Chang Liver凋亡细胞数目有所变少。
、肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽抗凋亡流式细胞仪观察
本实验采用Annexin V-FITC/PI双染法（现有常规方法）检测细胞凋亡情况，该方法能够很明显的区分将实验中的正常细胞、坏死细胞、凋亡细胞及机械死亡细胞。
正常细胞，在细胞膜脂质双层的内侧分布磷脂酰丝氨酸（且只分布在该处），而早期凋亡细胞，细胞膜脂膜内侧中的磷脂酰丝氨酸翻向细胞膜外侧。Annexin V FITC是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合。用标记了FITC的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合Annexin V-FITC。Propidium iodide（PI）是一种特定的核酸染料，它不能透过完整的细胞膜（可以外翻），由于正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜完整，PI不能透过，但在中晚期凋亡细胞和坏死细胞中，细胞膜受到破坏，PI能够透过细胞膜，进入细胞内与细胞核特异性结合呈现出红色。Annexin V-FITC/PI双染法可以将实验中的正常细胞、坏死细胞、凋亡细胞及机械死亡细胞分开来。
每个流式细胞仪的结果图上，左下象限显示正常细胞，显示为（FITC-/PI-）；右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+ /PI-）；右上象限为凋亡晚期或是死细胞，为（FITC+ /PI+ ）。
用不同浓度的GM2-2-3作用于经LPS处理后的Chang Liver细胞24h后，与损伤组细胞相比，能明显看到早期凋亡率降低，早期凋亡细胞变少，损伤修复效果较为明显，由图10可知经本发明的产品作用后Chang Liver细胞早期凋亡变少，本发明的产品具有较好地肝细胞保护效果。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (3)
1.一种肝病辅食型鳕鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）鳕鱼皮预处理：将鳕鱼皮洗净后用4℃纯水浸泡20-30min，后用浓度0.1-0.2mol/LNaOH 浸泡 6-8小时，用清水冲洗至 pH=7，沥干水分后，用浓度0.1-0.2mol/L的冰醋酸溶胀10-12小时，最后用剪刀剪碎；
（2）酶解反应：将步骤（1）预处理后的鳕鱼皮与水按照1:4（w/v）的料液比混合，然后加入胰蛋白酶酶解反应，酶解条件为：胰蛋白酶用量为每g鳕鱼皮加入2000U，酶解温度50℃，pH 6，时间8h；
（3）超滤：步骤（2）酶解反应结束后，灭酶，离心，收集上清液，上清液用超滤膜超滤，截留获得分子量为5-10KDa的组分，冷冻干燥后得GM2组分；
（4）DEAE-Sepharose FF离子交换层析分离：将GM2组分上DEAE-Sepharose FF离子交换柱，采用pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液作为洗脱剂洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后得到GM2-2组分；
（5）Sephadex G-25层析分离：将GM2-2组分经Sephadex G-25凝胶柱洗脱后，从上样开始计时，收集90-100min时间段洗脱液获得GM2-2-3组分，冷冻干燥后得到肝病辅食型胶原蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中DEAE-Sepharose FF离子交换柱的洗脱条件具体为： GM2组分加超纯水配制成200mg/ml的溶液上样，每次上样量为2ml，洗脱速度为1ml/min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中Sephadex G-25凝胶柱的洗脱条件具体为：
柱尺寸：2.6×80cm；柱料：Sephadex G-25，以5mg/ml压柱12h，至填充量为70±1cm；将GM2-2组分加超纯水配制成1mg/ml的溶液上样，上样量：1.5ml，超纯水洗脱，洗脱速度：0.5ml/min。
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