CN112245342A - 一种人参系列护肤提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人参系列护肤提取物及其制备方法和应用，属于活性物质提取技术领域。本发明基于人参多种活性物质在理化性质上的差异，建立一种具有生物活性的人参多种功效成分的多级提取方法，能分步提取人参抗光老化提取物、人参抗炎提取物、人参美白提取物及人参抗氧化提取物。本发明提供的制备方法，以人参为原料最大程度上实现人参活性物质的提取，同时获得的各类提取物得率高，对于提高人参的利用率及人参提取物在应用上的指向性及针对性具有重要意义。

Description

一种人参系列护肤提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于活性物质提取技术领域，具体涉及一种人参系列护肤提取物及其制备方法和应用。

背景技术

人参被誉为“百草之王”，其有多种活性物质，如人参皂苷、挥发油、木质素、倍半萜、多糖等，且这些活性成分都有其独特的活性及理化性质。目前主要采用缓冲溶液浸提、加热回流提取、乙醇提取等方法获得上述人参活性物质。如公开号为CN108341852A的中国专利公开了一种利用缓冲溶液在低温下将人参蛋白提取的方法；公开号为CN201210340761.2的中国专利公开了一种利用超声波及加热回流提取相结合，并使用非极性大孔树脂分离人参寡糖的方法；公开号为CN201811002123.3中国专利公开了一种利用水提及醇提相结合来提取人参皂苷的方法。

然而目前尚未见能够同时获得多种人参活性物质的报道，现有技术中提取单人参活性物质虽然能集中获得单种活性物质，但是对人参的利用率不高，造成人参活性物质的浪费。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人参系列护肤提取物及其制备方法和应用，通过分阶段将人参中的有效成分制备出来，既保证了原料的利用率，还能保证不同阶段提取的人参提取物发挥不同作用的护肤功效。

本发明提供了一种人参系列护肤提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)将新鲜人参切片与冷水搅拌提取，固液分离，得到第一人参残渣和冷提液，所述冷提液经澄清除菌后采用孔径5～10kDa的超滤膜超滤，得到截留物质和超滤小分子滤出液，将所述截留物质冻干后得到人参抗光老化提取物；

2)将所述第一人参残渣和超滤小分子滤出液混合，加热回流提取，得到提取液和第二人参残渣，所述提取液依次经浓缩、醇沉，得到的醇沉上清液除去醇溶剂后，经大孔树脂吸附，依次用水和体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱，收集水流穿部分进行干燥获得人参抗炎提取物，收集体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱部分进行干燥获得人参美白提取物；

3)将所述第二人参残渣和体积浓度80～100％乙醇水溶液混合进行渗漉提取，得到的渗漉液经减压浓缩、干燥获得人参抗氧化提取物。

优选的，步骤1)中所述冷水的温度为4～10℃；所述搅拌提取的时间为1～4h。

优选的，步骤2)中所述加热回流提取的温度为80～100℃；所述加热回流提取的时间为2～3h。

优选的，步骤2)中所述浓缩包括将所述提取液和软水按照1：4～6的质量比混合提取，所述提取的次数优选为2～3次；提取后得到的提取溶液浓缩至总体积的5％～10％。

优选的，步骤2)中所述醇沉时醇的终浓度为60～75％；所述醇的种类包括乙醇或甲醇。

优选的，步骤2)中所述大孔树脂的径高比为1:2；

所述水的洗脱体积为5倍柱体积，所述水的流速为2～4倍柱体积/h；

所述30％～50％乙醇水溶液的洗脱体积为5倍柱体积，所述30％～50％乙醇水溶液的流速为2～4倍柱体积/h。

优选的，步骤3)中所述渗漉提取时，渗漉速度为1～5mL/min/kg。

本发明提供了所述制备方法制备得到的人参系列护肤提取物，包括人参抗光老化提取物、人参美白提取物、人参抗炎提取物和人参抗氧化提取物；所述人参抗光老化提取物、人参美白提取物、人参抗炎提取物和人参抗氧化提取物的质量比为3～5：13～17：1:1；

所述人参抗光老化提取物包括以下重量百分含量的组分：人参蛋白10％～20％、人参可溶性多糖40％～60％；

所述人参美白提取物包括以下重量百分含量的组分：人参寡糖30％～40％、人参多酚10％～20％；

所述人参抗炎提取物包括以下重量百分含量的组分：人参寡糖80％～100％；

所述人参抗氧化提取物包括以下重量百分含量的组分：人参寡糖40％～60％、人参皂苷10％～20％。

本发明提供了人参系列护肤提取物在具有抗衰老、消炎和/或美白功能的化妆品或保健品中的应用。

优选的，所述人参系列护肤提取物中人参抗光老化提取物有效抑制成纤维细胞活力的下降和胶原蛋白的水解；

所述人参抗炎提取物有效抑制角质细胞炎性因子的分泌；

所述人参美白提取物有效抑制黑色素由黑色素细胞向角质细胞的转运过程；

所述人参抗氧化提取物提高细胞内抗氧化酶的水平。

本发明提供了一种人参系列护肤提取物的制备方法，本发明基于人参多种活性物质在理化性质差异，建立一条具有生物活性的人参多种功效成分的多级提取工艺，首先采用冷水浸提和超滤相结合的方法分离得到人参抗光老化提取物，然后以人参残渣和超滤小分子滤出液为原料依次进行高温加热回流提取、减压浓缩、醇沉和大孔树脂吸附，依次用水和体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱，收集水流穿部分进行干燥获得人参抗炎提取物，收集体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱部分进行干燥获得人参美白提取物；再将人参残渣进行80％～95％的醇水溶液渗漉提取，得到人参抗氧化提取物。本发明提供的制备方法，以人参为原料最大程度上实现人参活性物质的提取，同时获得的各类提取物得率高，对于提高人参的利用率及人参提取物在应用上的指向性及针对性具有重要意义。

本发明提供了所述制备方法制备得到的人参系列护肤提取物，包括人参抗光老化提取物、人参美白提取物、人参抗炎提取物和人参抗氧化提取物。经过实验证明，所述人参系列护肤提取物中人参抗光老化提取物有效抑制成纤维细胞活力的下降和胶原蛋白的水解；所述人参抗炎提取物有效抑制角质细胞炎性因子的分泌；所述人参美白提取物有效抑制黑色素由黑色素细胞向角质细胞的转运过程；所述人参抗氧化提取物提高细胞内抗氧化酶的水平。人参系列护肤提取物为后续应用于具有抗衰老、消炎和/或美白功效的化妆品或保健品的中提供物质基础。

附图说明

图1为本发明实施例1～3制备的人参抗光老化提取物对UVA损伤的成纤维细胞活力的影响，与对照组对比，*表示为p<0.05，***表示为p<0.001；

图2为本发明实施例1～3制备的人参抗光老化提取物对UVA损伤的成纤维细胞胶原蛋白的影响，与UVA模型组对比，***表示为p<0.001；

图3为本发明实施例1～3制备的人参抗炎提取物对UVB诱导HaCaT角质细胞分泌TNF-α含量的影响，结果均表示为与空白组比较，###p<0.001与造模组比较，**p<0.01，***p<0.001；

图4为本发明实施例1～3制备的人参抗炎提取物对UVB诱导HaCaT角质细胞分泌IL-6含量的影响，结果均表示为与空白组比较，###p<0.001与造模组比较，**p<0.01，***p<0.001；

图5为本发明实施例1～3制备的人参美白提取物对黑色素转运的影响，红色指示荧光微球，蓝色指示细胞核；

图6为本发明实施例1～3制备的人参抗氧化提取物对UVB诱导的角质细胞ROS水平的影响，与对照组对比，*表示为p<0.05，***表示为p<0.001；

图7为本发明实施例1和对比例1～4制备的人参抗光老化提取物对UVA损伤的成纤维细胞活力的影响，与对照组对比，*表示为p<0.05，***表示为p<0.001；

图8为本发明实施例1和对比例4制备的人参抗氧化提取物对UVB诱导的角质细胞ROS水平的影响，与对照组对比，*表示为p<0.05，***表示为p<0.001。

具体实施方式

本发明提供了一种人参系列护肤提取物的制备方法，包括以下步骤：

1)将新鲜人参切片与冷水搅拌提取，固液分离，得到第一人参残渣和冷提液，所述冷提液经澄清除菌后采用孔径5～10kDa的超滤膜超滤，得到截留物质和超滤小分子滤出液，将所述截留物质冻干后得到人参抗光老化提取物；

2)将所述第一人参残渣和超滤小分子滤出液混合，加热回流提取，得到提取液和第二人参残渣，所述提取液依次经浓缩、醇沉，得到的醇沉上清液除去醇溶剂后，经大孔树脂吸附，依次用水和体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱，收集水流穿部分进行干燥获得人参抗炎提取物，收集体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱部分进行干燥获得人参美白提取物；

3)将所述第二人参残渣和体积浓度80～100％乙醇水溶液混合进行渗漉提取，得到的渗漉液经减压浓缩、干燥获得人参抗氧化提取物。

本发明将新鲜人参切片与冷水搅拌提取，固液分离，得到第一人参残渣和冷提液，所述冷提液经澄清除菌后采用孔径5～10kDa的超滤膜超滤，得到截留物质和超滤小分子滤出液，将所述截留物质冻干后得到人参抗光老化提取物。

在本发明中，所述新鲜人参切片的厚度优选为1～3mm，更优选为2mm。所述新鲜人参优选为5年生人参。本发明对所述人参的来源没有特殊限制，采用人工栽培或野生人参均可。所述新鲜人参经切片后再提取有利于人参中活性成分充分浸提，提高提取效果。

在本发明中，所述冷水的温度优选为4～10℃，更优选为5～8℃，最优选为7℃；所述搅拌提取的时间优选为1～4h，更优选为2～3h。冷水提取的次数优选为2～3次。每次提取优选所述4倍质量的软化水提取新鲜人参切片。采用冷水浸提有利于保留热敏性功效物质的活性。

在本发明中，所述澄清除菌的方式优选为多级滤网过滤；所述多级滤网过滤；所述滤网的孔径优选为0.2μm；所述滤网优选为陶瓷膜。

在本发明中，孔径不低于5kDa的超滤膜超滤至总体积的5％～10％，来截留大分子物质。超滤膜超滤时的压力优选为0.08MPa。所述人参抗光老化提取物的收率达到4％～6％。

得到第一人参残渣和超滤小分子滤出液后，本发明将所述第一人参残渣和超滤小分子滤出液混合，加热回流提取，得到提取液和第二人参残渣，所述提取液依次经浓缩、醇沉，得到的醇沉上清液除去醇溶剂后，经大孔树脂吸附，依次用水和体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱，收集水流穿部分进行干燥获得人参抗炎提取物，收集体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱部分进行干燥获得人参美白提取物。

在本发明中，所述加热回流提取的温度优选为80～100℃，更优选为90℃；所述加热回流提取的时间优选为2～3h，更优选为2.5h。所述加热回流提取的料液比为1:4～1:6(质量比)，更优选为1:5。所述加热回流提取的目的是对原料中的水溶性物质充分提取。

在本发明中，所述浓缩优选包括将所述提取液和软水按照1：4～6的质量比混合提取，所述提取的次数优选为2～3次；提取后得到的提取溶液浓缩至总体积的5％～10％。经浓缩后能降低醇沉时使用的乙醇的量。

在本发明中，所述醇沉时醇的终浓度优选为60％～75％；醇沉的时间优选为10～14h，更优选为12h。所述醇的种类优选包括乙醇或甲醇，更优选为乙醇。醇沉可以分离提取物中的多糖和小分子物质。

在本发明中，所述大孔树脂的径高比优选为1:2。在本发明实施例中所述大孔树脂的型号为D101。

在本发明中，所述水的洗脱体积为5倍柱体积，所述水的流速为2～4倍柱体积/h，更优选为3倍柱体积/h；所述30％～50％乙醇水溶液的洗脱体积为5倍柱体积，所述30％～50％乙醇水溶液的流速为2～4倍柱体积/h，更优选为3倍柱体积/h。所述乙醇水溶液的体积浓度优选为40％。

得到第二人参残渣后，本发明将所述第二人参残渣和体积浓度80％～100％乙醇水溶液混合进行渗漉提取，得到的渗漉液经减压浓缩、干燥获得人参抗氧化提取物。所述渗漉提取时，渗漉速度优选为1～5mL/min/kg，更优选为2～4mL/min/kg，最优选为3mL/min/kg。所述渗漉提取较其他提取方式更有利于安全有效的获得极性小的物质。严格控制乙醇水溶液的浓度及渗漉速度有利于提高人参抗氧化提取物的得率。

本发明提供了所述制备方法制备得到的人参系列护肤提取物，包括人参抗光老化提取物、人参美白提取物、人参抗炎提取物和人参抗氧化提取物；

所述人参抗光老化提取物包括以下重量百分含量的组分：人参蛋白10％～20％、人参可溶性多糖40％～60％；所述人参美白提取物包括以下重量百分含量的组分：人参寡糖30％～40％、人参多酚10％～20％；所述人参抗炎提取物包括以下重量百分含量的组分：人参寡糖80％～100％；所述人参抗氧化提取物包括以下重量百分含量的组分：人参寡糖40％～60％、人参皂苷10％～20％。其中涉及的含量均按照《中华人民共和国国家标准》及《中华人民共和国药典》要求进行检测，蛋白质含量以凯氏定氮进行检测，多糖及寡糖含量以苯酚硫酸法进行检测，皂苷含量以香草醛高氯酸-硫酸分光光度法进行检测，多酚以福林-酚分光光度法进行检测。

本发明提供了人参系列护肤提取物在具有抗衰老、消炎和/或美白功能的化妆品或保健品中的应用。

在本发明中，利用MTT法检测人参抗光老化提取物对UVA损伤的NIH-3T3细胞活力的影响和用ELISA检测人参抗光老化提取物对UVA损伤的NIH-3T3细胞胶原蛋白表达的影响，结果表明，所述人参系列护肤提取物中人参抗光老化提取物能有效抑制成纤维细胞活力的下降和胶原蛋白的水解。

利用ELISA法检测人参抗炎提取物对HaCaT细胞炎性因子分泌的影响，结果表明，所述人参抗炎提取物有效抑制角质细胞炎性因子的分泌。

利用荧光微球法检测人参美白提取物对黑色素转运的影响，结果表明，所述人参美白提取物有效抑制黑色素由黑色素细胞向角质细胞的转运过程。

用DCF-DA活性氧探针检测细胞内抗氧化酶的含量，结果表明，所述人参抗氧化提取物提高细胞内抗氧化酶的水平。

下面结合实施例对本发明提供的一种人参系列护肤提取物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将新鲜人参切片至厚度为2mm，取20kg的人参切片置于提取罐中，加入4倍质量的软化水，于4℃低温提取2小时；冷提液通过滤网分离，经离心，收集于储罐中；再向提取罐内加入4倍软化水，4℃提取2小时，此过程重复2次，得到的上清液倒入储罐中；将储罐内的冷提液打入0.2μm陶瓷膜进行澄清除菌，澄清后的冷提液流入超滤储罐，用5kDa的超滤膜截留浓缩大分子部分，至总体积的10％，截留部分经管道过滤器除菌置于冻干机干燥获得人参抗光老化提取物。该步骤冷提后的残渣将作为下一步提取的原料，同时超滤滤过的小分子部分将作为下一步提取的原料。

经冷提取后的人参残渣和超滤产生的含小分子的滤出液混合，加热至100℃提取1小时；分离提取液，向提取罐内再次加入4倍软化水，提取1小时，将两次的提取液经过滤网分离后离心除去杂质导入浓缩罐中进行减压浓缩，在浓缩罐内浓缩至总体积的10％，转移进入醇沉罐，并加入95％乙醇溶液，使乙醇的终浓度为70％；醇沉12小时后，将上清液收集经滤网过滤后移入浓缩罐中进行减压浓缩，回收醇溶剂；待浓缩液体积至总体积的5％后冷却待用。

将浓缩液从柱顶上样于装有大孔树脂的层析柱(径高比1:2)，依次用水(5倍柱体积，流速2～4柱体积/h)和30％乙醇水溶液梯度洗脱(5倍柱体积，流速2～4柱体积/h)；收集水流穿部分喷雾干燥后获得人参抗炎提取物，收集30％乙醇水溶液洗脱部分浓缩后喷雾干燥获得人参美白提取物。

经过加热提取后的人参残渣，移入渗漉罐，用80％乙醇溶液进行渗漉提取，渗漉速度为5mL/min/kg，所得醇提液经减压浓缩，干燥获得人参抗氧化提取物。

实施例2

将新鲜人参切片至厚度为2mm，取20kg的人参切片置于提取罐中，加入6倍体积的软化水，于8℃低温提取2小时；冷提液通过滤网分离，经离心，收集于储罐；再向提取罐内加入6倍软化水，8℃提取2小时，此过程重复2次，将两次得到的上清液倒入储罐中；将储罐内的冷提液打入0.2μm陶瓷膜进行澄清除菌，澄清后的冷提液流入超滤储罐，用5kDa的超滤膜截留浓缩大分子部分，至总体积的10％，经管道过滤器除菌置于冻干机干燥获得人参抗光老化提取物。该步骤冷提后的残渣将作为下一步提取的原料，同时超滤滤过的小分子部分将作为下一步提取的溶剂。

经冷提取后的人参残渣和超滤产生的含小分子的滤出液合并，加热至90℃提取2小时；分离提取液，向提取罐内再次加入5倍软化水，提取2小时；将两次的提取液经过滤网分离后离心除去杂质，进入浓缩罐减压浓缩，在浓缩罐内浓缩至总体积的10％，进入醇沉罐，并加入95％乙醇，使乙醇在体系中的终浓度为70％；醇沉14小时后，将上清液收集经滤网过滤后移入浓缩罐减压浓缩，回收溶剂；待浓缩液体积至总体积的7.5％后冷却待用。

将浓缩液从柱顶上样于装有大孔树脂的层析柱，依次用水和体积浓度30％的乙醇水溶液梯度洗脱；收集流穿部分喷雾干燥后获得人参抗炎提取物，收集35％乙醇水溶液洗脱部分浓缩后喷雾干燥获得人参美白提取物。

经过冷提取与加热提取后的人参残渣，移入渗漉罐，用90％乙醇进行渗漉提取，渗漉速度为5mL/min/kg，所得醇提液经减压浓缩，干燥获得人参抗氧化提取物。

实施例3

将新鲜人参切片至厚度为2mm，取20kg的人参切片置于提取罐中，加入4倍体积的软化水，于10℃低温提取2小时；冷提液通过滤网分离，经离心，收集于储罐；再向提取罐内加入4倍软化水，10℃提取2小时，此过程重复2次，将两次得到的上清液倒入储罐中；将储罐内的冷提液打入0.2μm陶瓷膜进行澄清除菌，澄清后的冷提液流入超滤储罐，用10kDa的超滤膜截留浓缩大分子部分，至总体积的5％，经管道过滤器除菌置于冻干机干燥获得人参抗光老化提取物。该步骤冷提后的残渣将作为下一步提取的原料，同时超滤滤过的小分子部分将作为下一步提取的溶剂。

经冷提取后的人参残渣和超滤产生的含小分子的滤出液合并，加热至90℃提取2小时；分离提取液，向提取罐内再次加入5倍软化水，提取2小时；两次提取得到的提取液经过滤网分离后离心除去杂质，进入浓缩罐减压浓缩，在浓缩罐内浓缩至总体积的10％，进入醇沉罐，并加入95％乙醇，使乙醇在体系中的终浓度为75％；醇沉12小时后，将上清液收集经滤网过滤后移入浓缩罐减压浓缩，回收溶剂；待浓缩液体积至总体积的10％后冷却待用。

将浓缩液从柱顶上样于装有大孔树脂的层析柱，依次用水和体积浓度30％的乙醇水溶液梯度洗脱；收集流穿部分喷雾干燥后获得人参抗炎提取物，收集40％乙醇水溶液洗脱部分浓缩后喷雾干燥获得人参美白提取物。

经过冷提取与加热提取后的人参残渣，移入渗漉罐，用95％乙醇进行渗漉提取，渗漉速度为5mL/min/kg，所得醇提液经减压浓缩，干燥获得人参抗氧化提取物。

对比例1

将新鲜人参切片至厚度为3mm，取20kg的人参切片置于提取罐中，加入4倍体积的软化水，于室温(25℃)提取2小时；提取液通过滤网分离，经离心，收集于储罐；再向提取罐内加入5倍软化水，室温提取2小时，此过程重复2次，将两次得到的上清液倒入储罐中；将储罐内的冷提液打入0.2μm陶瓷膜进行澄清除菌，澄清后的冷提液流入超滤储罐，用30kDa的超滤膜截留浓缩大分子部分，至总体积的10％，经管道过滤器除菌置于冻干机干燥获得人参抗光老化提取物。该步骤冷提后的残渣将作为下一步提取的原料，同时超滤滤过的小分子部分将作为下一步提取的溶剂。

经冷提取后的人参残渣和超滤产生的含小分子的滤出液合并，加热至90℃提取2小时；提取液经过滤网分离后离心除去杂质，进入浓缩罐减压浓缩，向提取罐内再次加入5倍软化水，提取2小时，此过程重复2次；三次提取的提取液在浓缩罐内浓缩至总体积的10％，进入醇沉罐，并加入95％乙醇，使乙醇在体系中的终浓度为75％；醇沉10小时后，将上清液收集经滤网过滤后移入浓缩罐减压浓缩，回收溶剂；待浓缩液体积至总体积的7.5％后冷却待用。

将浓缩液从柱顶上样于装有大孔树脂的层析柱，依次用水和体积浓度40％的乙醇水溶液梯度洗脱；收集流穿部分喷雾干燥后获得人参抗炎提取物，收集40％乙醇水溶液洗脱部分浓缩后喷雾干燥获得人参美白提取物。

经过冷提取与加热提取后的人参残渣，移入渗漉罐，用95％乙醇进行渗漉提取，渗漉速度为4mL/min/kg，所得醇提液经减压浓缩，干燥获得人参抗氧化提取物。

对比例2

将新鲜人参切片至厚度为2mm，取20kg的人参切片置于提取罐中，加入5倍体积的软化水，于4℃低温提取2小时；冷提液通过滤网分离，经离心，收集于储罐；再向提取罐内加入5倍软化水，4℃提取2小时，此过程重复2次，将两次得到的上清液倒入储罐中；将储罐内的冷提液打入0.2μm陶瓷膜进行澄清除菌，澄清80后的冷提液流入超滤储罐，用10kDa的超滤膜截留浓缩大分子部分，至总体积的10％，经管道过滤器除菌置于冻干机干燥获得人参抗光老化提取物。该步骤冷提后的残渣将作为下一步提取的原料，同时超滤滤过的小分子部分将作为下一步提取的溶剂。

经冷提取后的人参残渣和超滤产生的含小分子的滤出液合并，加热至100℃提取1小时；提取液经过滤网分离后离心除去杂质，进入浓缩罐减压浓缩，向提取罐内再次加入5倍软化水，提取2小时，此过程重复2次；三次提取的提取液在浓缩罐内浓缩至总体积的10％，进入醇沉罐，并加入95％乙醇，使乙醇在体系中的终浓度为70％；醇沉10小时后，将上清液收集经滤网过滤后移入浓缩罐减压浓缩，回收溶剂；待浓缩液体积至总体积的5％后冷却待用。

将浓缩液从柱顶上样于装有大孔树脂的层析柱，依次用水和体积浓度30％的乙醇水溶液梯度洗脱；收集流穿部分喷雾干燥后获得人参抗炎提取物，收集30％乙醇水溶液洗脱部分浓缩后喷雾干燥获得人参美白提取物。

经过冷提取与加热提取后的人参残渣，移入渗漉罐，用95％乙醇进行渗漉提取，渗漉速度为4mL/min/kg，所得醇提液经减压浓缩，干燥获得人参抗氧化提取物。

对比例3

将新鲜人参切片至厚度为2mm，取20kg的人参切片置于提取罐中，加入4倍体积的软化水，于4℃低温提取2小时；冷提液通过滤网分离，经离心，收集于储罐；再向提取罐内加入5倍软化水，4℃提取2小时，此过程重复2次，将两次得到的上清液倒入储罐中；将储罐内的冷提液打入0.2μm陶瓷膜进行澄清除菌，澄清后的冷提液流入超滤储罐，用5kDa的超滤膜截留浓缩大分子部分，至总体积的10％，经管道过滤器除菌置于冻干机干燥获得人参抗光老化提取物。该步骤冷提后的残渣将作为下一步提取的原料，同时超滤滤过的小分子部分将作为下一步提取的溶剂。

经冷提取后的人参残渣和超滤产生的含小分子的滤出液合并，加热至90℃提取4小时；提取液经过滤网分离后离心除去杂质，进入浓缩罐减压浓缩，向提取罐内再次加入6倍软化水，提取2小时，此过程重复2次；三次提取的提取液在浓缩罐内浓缩至总体积的10％，进入醇沉罐，并加入95％乙醇，使乙醇在体系中的终浓度为50％；醇沉12小时后，将上清液收集经滤网过滤后移入浓缩罐减压浓缩，回收溶剂；待浓缩液体积至总体积的10％后冷却待用。

将浓缩液从柱顶上样于装有大孔树脂的层析柱，依次用水和体积浓度30％的乙醇水溶液梯度洗脱；收集流穿部分喷雾干燥后获得人参抗炎提取物，收集30％乙醇水溶液洗脱部分浓缩后喷雾干燥获得人参美白提取物。

经过冷提取与加热提取后的人参残渣，移入渗漉罐，用80％乙醇进行渗漉提取，渗漉速度为4mL/min/kg，所得醇提液经减压浓缩，干燥获得人参抗氧化提取物。

对比例4

将新鲜人参切片至厚度为2mm，取20kg的人参切片置于提取罐中，加入4倍体积的软化水，于8℃低温提取2小时；冷提液通过滤网分离，经离心，收集于储罐；再向提取罐内加入4倍软化水，8℃提取2小时，此过程重复2次，将两次得到的上清液倒入储罐中；将储罐内的冷提液打入0.2μm陶瓷膜进行澄清除菌，澄清后的冷提液流入超滤储罐，用5kDa的超滤膜截留浓缩大分子部分，至总体积的10％，经管道过滤器除菌置于冻干机干燥获得人参抗光老化提取物。该步骤冷提后的残渣将作为下一步提取的原料，同时超滤滤过的小分子部分将作为下一步提取的溶剂。

经冷提取后的人参残渣和超滤产生的含小分子的滤出液合并，加热至80℃提取2.5小时；提取液经过滤网分离后离心除去杂质，进入浓缩罐减压浓缩，向提取罐内再次加入5倍软化水，提取2小时，此过程重复4次；三次提取的提取液在浓缩罐内浓缩至总体积的10％，进入醇沉罐，并加入95％乙醇，使乙醇在体系中的终浓度为50％；醇沉10小时后，将上清液收集经滤网过滤后移入浓缩罐减压浓缩，回收溶剂；待浓缩液体积至总体积的8％后冷却待用。

将浓缩液从柱顶上样于装有大孔树脂的层析柱，依次用水和体积浓度30％的乙醇水溶液梯度洗脱；收集流穿部分喷雾干燥后获得人参抗炎提取物，收集30％乙醇水溶液洗脱部分浓缩后喷雾干燥获得人参美白提取物。

经过冷提取与加热提取后的人参残渣，移入渗漉罐，用80％乙醇水溶液进行渗漉提取，渗漉速度为4mL/min/kg，所得醇提液经减压浓缩，干燥获得人参抗氧化提取物。

实施例4

将实施例1～3以及对比例1～4制备的人参抗光老化提取物、人参抗炎提取物、人参美白提取物和人参抗氧化提取物进行定性定量检测，具体如下：

人参抗光老化提取物采用《GB5009.5-2010凯氏定氮法测定食品中蛋白质》中描述的蛋白质检测方法及《SN/T 4260-2015出口植物源食品中粗多糖的测定》中所描述得多糖检测方法检测；人参美白提取物采用《SN/T 4260-2015出口植物源食品中粗多糖的测定》中所描述得多糖检测方法及《GB/T 8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》中所描述的多酚检测方法检测；人参抗炎提取物采用《SN/T 4260-2015出口植物源食品中粗多糖的测定》中所描述得多糖检测方法检测；人参抗氧化提取物采用《SN/T 4260-2015出口植物源食品中粗多糖的测定》中所描述得多糖检测方法及《中华人民共和国药典——人参茎叶总皂苷》中所描述的人参皂苷的检测方法检测。4种提取物的各活性成分的含量结果见表1。

表1实施例1～3以及对比例1～4制备人参系列护肤提取物信息

经统计，实施例1～3制备的提取物中，人参抗光老化提取物的收率为3.41％～4.14％，人参抗炎提取物的收率为11.56～14.04％，人参美白提取物的收率为1.04％～1.26％，人参抗氧化提取物的收率为0.89％～1.08％。而对比例1制备的提取物中人参抗光老化提取物的收率为2.89％，对比例2中人参美白提取物的收率为0.88％，对比例3中人参抗炎提取物的收率为10.21％，对比例4中人参抗氧化提取物的收率为0.59％。

实施例5

(1)利用MTT法检测人参抗光老化提取物对UVA损伤的NIH-3T3细胞活力的影响

NIH-3T3细胞以含5％NBS的DMEM高糖培养基培养(37℃，5％CO₂)培养24小时后，胰酶消化、重悬并计数。取密度为5×10⁴～6×10⁴的细胞移入96孔板，培养24小时，待细胞长满，用不同剂量的UVA对其诱导，同时被不同浓度的人参抗光老化提取物处理(0、50、100、200μg/mL)，每个处理设置3个重复，分别使用实施例1～3制备的人参抗光老化提取物处理，同时设置空白对照(不经过UVA诱导)，经过24小时共孵育，清洗细胞并加入MTT，37℃孵育4小时后移除MTT并加入150μL DMSO，560nm检测。

结果见图1。图1为人参抗光老化提取物对UVA损伤的成纤维细胞活力的影响，与对照组对比，*表示为p<0.05，***表示为p<0.001。由图1可知，10μg/mL、20μg/mL的人参抗光老化提取物处理组与经UVA诱导，但不经过人参抗光老化提取物处理组相比有显著性差异，但是50μg/mL的人参抗光老化提取物处理组不呈现显著性差异，这表明人参抗光老化提取物在不低于100μg/mL的剂量下，能有效提高UVA损伤的成纤维细胞活力。

(2)利用ELISA检测人参抗光老化提取物对UVA损伤的NIH-3T3细胞胶原蛋白表达的影响

NIH-3T3细胞以含5％NBS的DMEM高糖培养基培养(37℃，5％CO₂)培养24小时后，胰酶消化、重悬并计数。取密度为5×10⁴～6×10⁴的细胞移入6孔板，培养24小时，待细胞长满，用不同剂量的UVA对其诱导，同时被不同浓度的人参抗光老化提取物处理(0、50、100、200μg/mL)，每个处理设置3个重复，分别使用实施例1～3制备的人参抗光老化提取物处理，同时设置空白对照(不经过UVA诱导)。24小时后，取细胞上层培养液，4℃离心10分钟除杂，用ELISA检测试剂盒检测。

结果见图2。图2为人参抗光老化提取物对UVA损伤的成纤维细胞胶原蛋白的影响，与UVA模型组对比，***表示为p<0.001。由图2可知，人参抗光老化提取物处理组(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)与经UVA诱导，但不经过人参抗光老化提取物处理组相比有显著性差异。这表明人参抗光老化提取物能有效提高成纤维细胞胶原蛋白的水平。

由图1和图2可知，本发明制备的人参抗光老化提取物能有效抑制UVA引起的成纤维细胞活力的下降及胶原蛋白的水解，从而实现抗光老化作用。

实施例6

利用ELISA法检测人参抗炎提取物对HaCaT细胞炎性因子分泌的影响

将HaCaT细胞培养于DMEM培养液(含有10％FBS)中，当达到对数期时将其接种至96孔板，培养24小时后弃上层培养液，更换PBS缓冲液，用不同剂量的UVB照射，并加入含有不同浓度的人参抗炎提取物(0、5、10、20μg/mL)，每个处理设置3个重复，分别使用实施例1～3制备的人参抗炎提取物处理，同时设置空白对照(不经过UVB诱导)，培养24小时后，收集上清，利用ELISA试剂盒检测IL-6、TNF-α含量。

结果见图3。图3为人参抗炎提取物对UVB诱导HaCaT角质细胞分泌TNF-α含量的影响，结果均表示为与空白组比较，###p<0.001与造模组比较，**p<0.01，***p<0.001。

图4为人参抗炎提取物对UVB诱导HaCaT角质细胞分泌IL-6含量的影响，结果均表示为与空白组比较，###p<0.001与造模组比较，**p<0.01，***p<0.001。

由图3和图4可知，本发明制备的人参抗炎提取物能有效抑制UVB引起的角质细胞炎性因子的分泌，从而起到消炎的作用。

实施例7

利用荧光微球法检测人参美白提取物对黑色素转运的影响

利用荧光微球法检测人参美白提取物对黑色素转运的影响。取对数期生长的HaCaT细胞(浓度为7.50×10⁴个/mL)于6孔板中培养24小时。加入不同浓度的人参美白提取物的培养液(0、125、250、500μg/mL，每个处理设置3个重复，分别使用实施例1～3制备的人参美白提取物处理)及荧光微球(

Fluorescent Microspheres)，并用UVB进行照射已促进HaCaT细胞对微球(微球与黑色素大小相似，并能发出荧光)的转运。24小时后，移除培养液，清洗掉多余的荧光微球，细胞固定后于荧光成像系统中检测。设置空白对照(不经过UVB诱导)。

结果见图5。图5为人参美白提取物对黑色素转运的影响，红色指示荧光微球，蓝色指示细胞核。由图5可知，本发明制备的人参美白提取物能有效抑制黑色素由黑色素细胞向角质细胞的转运过程，从而实现美白功效。

实施例8

取对数期生长的HaCaT细胞(浓度为7.50×10⁴个/mL)于6孔板中培养24小时后弃上层培养液，更换PBS缓冲液，用不同剂量的UVB照射，并加入含有不同浓度的人参抗氧化提取物(0、12.5、25、50μg/mL，每个处理设置3个重复，分别使用实施例1～3制备的人参抗氧化提取物处理)，将经处理的各组细胞用PBS洗去培养液，用DCF-DA活性氧探针进行孵育30min，随后洗去多余的探针，用CYTATION3进行检测并记录。同时设置不经UVB照射的细胞作为空白对照。

结果见图6。图6为人参抗氧化提取物对UVB诱导的角质细胞ROS水平的影响，与对照组对比，*表示为p<0.05，***表示为p<0.001。由图6可知，本发明制备的人参抗氧化提取物，能增加小鼠及细胞内抗氧化酶的水平，从而实现抗衰老的作用。

对比例5

采用实施例5的方法，分别利用MTT法检测人参抗光老化提取物对UVA损伤的NIH-3T3细胞活力的影响，不同之处在于采用对比例1～4制备的人参抗光老化提取物进行处理。

将实施例1制备的人参抗光老化提取物的细胞活力与对比例1～4的相应检测结果绘制柱状图。结果见图7。由图7可知，人参抗光老化提取物，其实施例1组与对比例1～4相比，尤其是与对比例1相比，实施例1制备的人参抗光老化提取物能够显著抑制UVA引起的成纤维细胞活力及胶原蛋白水平下降。

对比例6

采用实施例8的方法，检测细胞内抗氧化水平，不同之处在于采用对比例4制备的人参抗氧化提取物进行处理。

结果见图8。由图8可知，与对比例4相比，实施例1提取的人参氧化提取物显著抑制UVB引起的HaCaT细胞内ROS的水平。

由上述实施例结果可知，本发明制备的人参抗光老化提取物能有效抑制UVA引起的成纤维细胞活力下降及胶原水平降低；人参抗炎提取物能有效抑制UVB引起的角质细胞炎性因子的表达；人参美白提取物能抑制UVB引起的角质细胞黑色素转运；人参抗氧化提取物能有效抑制UVB引起的角质细胞ROS的上升。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种人参系列护肤提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将新鲜人参切片与冷水搅拌提取，固液分离，得到第一人参残渣和冷提液，所述冷提液经澄清除菌后采用孔径5～10kDa的超滤膜超滤，得到截留物质和超滤小分子滤出液，将所述截留物质冻干后得到人参抗光老化提取物；

2)将所述第一人参残渣和超滤小分子滤出液混合，加热回流提取，得到提取液和第二人参残渣，所述提取液依次经浓缩、醇沉，得到的醇沉上清液除去醇溶剂后，经大孔树脂吸附，依次用水和体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱，收集水流穿部分进行干燥获得人参抗炎提取物，收集体积浓度30％～50％乙醇水溶液洗脱部分进行干燥获得人参美白提取物；

3)将所述第二人参残渣和体积浓度80～100％乙醇水溶液混合进行渗漉提取，得到的渗漉液经减压浓缩、干燥获得人参抗氧化提取物。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)中所述冷水的温度为4～10℃；所述搅拌提取的时间为1～4h。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中所述加热回流提取的温度为80～100℃；所述加热回流提取的时间为2～3h。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中所述浓缩包括将所述提取液和软水按照1：4～6的质量比混合提取，所述提取的次数为2～3次；提取后得到的提取溶液浓缩至总体积的5％～10％。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中所述醇沉时醇的终浓度为60％～75％；所述醇的种类包括乙醇或甲醇。

6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中所述大孔树脂的径高比为1:2；

所述水的洗脱体积为5倍柱体积，所述水的流速为2～4倍柱体积/h；

所述30％～50％乙醇水溶液的洗脱体积为5倍柱体积，所述30％～50％乙醇水溶液的流速为2～4倍柱体积/h。

7.根据权利要求1～6任意一项所述制备方法，其特征在于，步骤3)中所述渗漉提取时，渗漉速度为1～5mL/min/kg。

8.权利要求1～7任意一项所述制备方法制备得到的人参系列护肤提取物，其特征在于，包括人参抗光老化提取物、人参美白提取物、人参抗炎提取物和人参抗氧化提取物；所述人参抗光老化提取物、人参美白提取物、人参抗炎提取物和人参抗氧化提取物的质量比为3～5：13～17：1：1；

所述人参抗光老化提取物包括以下重量百分含量的组分：人参蛋白10％～20％、人参可溶性多糖40％～60％；

所述人参美白提取物包括以下重量百分含量的组分：人参寡糖30％～40％、人参多酚10％～20％；

所述人参抗炎提取物包括以下重量百分含量的组分：人参寡糖80％～100％；

所述人参抗氧化提取物包括以下重量百分含量的组分：人参寡糖40％～60％、人参皂苷10％～20％。

9.权利要求8所述人参系列护肤提取物在具有抗衰老、消炎和/或美白功能的化妆品或保健品中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述人参系列护肤提取物中人参抗光老化提取物有效抑制成纤维细胞活力的下降和胶原蛋白的水解；

所述人参抗炎提取物有效抑制角质细胞炎性因子的分泌；

所述人参美白提取物有效抑制黑色素由黑色素细胞向角质细胞的转运过程；

所述人参抗氧化提取物提高细胞内抗氧化酶的水平。

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