CN105175487A

CN105175487A - 一种具有抗氧化活性的人参蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN105175487A
Application number: CN201510576340.3A
Authority: CN
Inventors: 孙立伟; 姜锐; 麻锐; 冯凯; 刘建增; 徐晓浩
Original assignee: Beihua University
Current assignee: Beihua University
Priority date: 2015-09-11
Filing date: 2015-09-11
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明属于植物蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的人参蛋白制备方法。本发明利用超滤技术及凝胶层析建立人参蛋白的制备方法，制备的人参蛋白具有较好的抗氧化活性，并且制备方法简便，适用于工业生产，可用于保健食品及食品开发。

Description

一种具有抗氧化活性的人参蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于植物蛋白质分离纯化技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的人参蛋白制备方法。

背景技术

人参，属五加科人参属，为多年生宿根草本植物，是国内外公认的药用保健珍品，被誉为“百草之王”。作为一味名贵药材，人参在历史悠久的中医学中，有着自己举足轻重的地位。人参中含有多种功效成分，包括人参皂苷、酚酸、多糖、蛋白质、挥发油等。研究表明，人参蛋白具有良好的抗氧化、调节血糖、血脂、抗衰老、提高免疫力的作用。我们在前期研究工作中发现，人参蛋白不但能够提高正常小鼠体内SOD和MDA含量，而且可以提高辐射小鼠体内SOD和MDA含量，具有一定的清除自由基和抗氧化作用，且以对受损机体产生的过量自由基清除效果较明显，可见人参蛋白具有较好的抗氧化作用。近些年，随着人们健康、保健意识的提高，中药保健品及食品市场正在迅速发展。到目前为止，全球中药保健品及食品的销售已超过1000亿美元，并还在以平均每年增长率为百分之二。因此中药保健品及食品存在着巨大的市场开发潜力。而由于社会和科技的发展使得人们的生活节奏越来越快，工作、学习和生活的压力也越来越快，同时吸烟、不良化妆品、环境污染等外源性因素，进而引起人体内过量自由基蓄积，超出人体自身的自由基清除能力，引发衰老、肿瘤、心脑血管、老年性痴呆等疾病。因此，针对于中老年人群，生活节奏快、工作压力大的上班族，学业繁重的学生族及更年期的妇女，开发具有抗氧化功效的保健食品及食品，保持他们的良好精神状态，提高其身体各器官机能，缓解亚健康状态，具有十分广阔的市场前景。

在传统人参加工方式中，人参蛋白一直是被忽略乃至摒弃的成分。因此，一直以来均缺乏适合于工业化生产的人参蛋白大规模制备技术，具有抗氧化活性的人参蛋白制备技术未见报道。现有对植物蛋白提取的方法，主要包括硫酸铵沉淀法、有机试剂提取法、膜过滤法等。硫酸铵沉淀法是最常见的蛋白质提取方法，但它周期长，操作繁琐，需要透析除盐，并且长时间透析对蛋白质构象和活性会产生很多不利影响，不适合大规模生产；有机试剂提取法所用试剂包括丙酮、三氯乙酸等，易引起蛋白质变性，有机试剂成本高、不易去除、安全性差，同样不适合食品和保健品的生产。超滤技术，不需要透析，无毒，生产周期短，提取蛋白质纯度高、活性好，十分适合大规模生产富集高活性中药蛋白质。凝胶层析所选用的载体为惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作简单，条件温和，无需有机溶剂且不影响样品的理化性质。本发明利用超滤技术及凝胶层析建立人参蛋白的制备方法，制备的人参蛋白具有较好的抗氧化活性，并且制备方法简便，适用于工业生产，可用于保健食品及食品开发。

发明内容

本发明的目的是提供了一种具有抗氧化活性的人参蛋白制备方法，其制备步骤如下：

（1）、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:3-1:8的比例加入pH值为7-8的0.01mol/LTris-HCl缓冲液或蒸馏水搅拌均匀后，置于0-10℃环境下每次浸提3-10小时，浸提2-4次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋白粗提液。

（2）、上述制备的人参蛋白粗提液经过0.22-0.45μm滤膜过滤澄清后，将其置于截留分子量为5-30KDa的超滤膜装置进行超滤，分离去除小分子化合物。

（3）将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex-G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm，上样量为柱体积的5%-20%，流速0.5-1.0cm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，即得人参蛋白。

附图说明

附图为本发明实施例1-4中制备的人参蛋白SDS-PAGE图谱。

其中：1.蛋白marker、2.实施例1图谱、3.实施例2图谱、4.实施例3图谱、5.实施例4图谱。

具体实施方式

实施例1

（1）、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:8的比例加入pH值为7的0.01mol/LTris-HCl缓冲液搅拌均匀后，置于4℃环境下浸提4小时，浸提2次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋白粗提液。

（2）、上述制备的人参蛋白粗提液经过0.22-0.45μm滤膜过滤澄清后，将其置于截留分子量为5-30KDa的超滤膜装置进行超滤，分离杂质及皂苷的小分子化合物。

（3）将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex-G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm，上样量为柱体积的5%，流速1.0cm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，即得人参蛋白。

（4）、称取所得样品的质量，计算提取率；采用考马斯亮蓝方法检测蛋白纯度，SDS-PAGE蛋白电泳获得蛋白图谱。

实施例2

（1）、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:8的比例加入蒸馏水搅拌均匀后，置于4℃环境下每次浸提8小时，浸提2次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋白粗提液。

（3）将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex-G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm，上样量为柱体积的10%，流速1.0cm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，即得人参蛋白。

实施例3

（1）、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:8的比例加入蒸馏水搅拌均匀后，置于4℃环境下浸提8小时，再按着1:4的比例加入蒸馏浸提1次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋白粗提液。

（3）将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex-G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm，上样量为柱体积的15%，流速0.5cm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，即得人参蛋白。

实施例4

（1）、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:8的比例加入蒸馏水搅拌均匀后，置于4℃环境下浸提8小时，再按着1:4的比例加入蒸馏浸提2次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋白粗提液。

（3）将超滤浓缩后的浸提液用Sephadex-G75凝胶层析，层析柱规格为16*200mm，上样量为柱体积的20%，流速0.5cm/min，在280nm紫外吸收下检测出峰并收集、冻干，即得人参蛋白。

实例1-4制备的人参蛋白样品，蛋白纯度及蛋白回收率比较，如下表1所示。

表1人参蛋白的蛋白纯度和回收率

本发明制备的人参蛋白具有较好的抗氧化酶活性，如下表2所示。

表2人参蛋白的抗氧化酶活性

	SOD酶活力（U/mgprot）	POD酶活力（U/mgprot）
			人参蛋白	426±15	92.1±2.1

本发明制备的人参蛋白抗氧化动物实验

1、动物分组

取昆明小鼠40只，雌雄各半，随机分为对照组（2mL/kg蒸馏水）和人参蛋白组（高剂量1.0g/kg、中剂量0.5g/kg、低剂量0.25g/kg），每组10只，灌胃给药，每天一次，连续30d。

2、SOD、MDA含量测定

小鼠颈椎脱臼处死后，立即眼球取血并剥取肝脏。全血经生理盐水冲洗，冷双蒸水混合、95％乙醇振荡、三氯甲烷抽提制备SOD抽提液，按照试剂盒说明书测定SOD活力。肝组织经生理盐水冲洗，磷酸盐缓冲液匀浆制成5％组织匀浆液，取上清按照试剂盒说明测定MDA含量。

3、实验结果：

按照试剂盒方法分别测定红细胞SOD活性及肝脏MDA含量，并按照试剂盒所示公式进行计算，结果见表3。

人参蛋白组与对照组比较，SOD活性明显升高，且成一定量效关系，说明人参蛋白可对抗辐射所致SOD活性降低；MDA含量增高，成一定量效关系，说明人参蛋白可能具有抑制小鼠MDA含量升高的的作用。

这说明人参蛋白具有一定的清除自由基和抗氧化作用。

表3人参蛋白对小鼠SOD、MDA含量影响（n=10,±s）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Claims

1.一种具有抗氧化活性的人参蛋白制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：

（1）、将新鲜人参清洗后切成小块，按着1:3-1:8的比例加入pH值为7-8的Tris-HCl缓冲液或蒸馏水搅拌均匀后，置于0-10℃环境下每次浸提3-10小时，浸提2-4次，合并浸提后的上清液，即得人参蛋白粗提液；

（2）、上述制备的人参总蛋白粗提液经过0.22-0.45μm滤膜过滤澄清后，将其置于截留分子量为5-30KDa的超滤膜装置进行超滤浓缩，并分离去除小分子化合物；

2.按权利要求1中所述的方法制备的人参蛋白。

3.按权利要求1中所述的方法制备的人参蛋白用于提高体内超氧化物歧化酶SOD和过氧化物酶MDA含量，清除自由基和抗氧化。

4.按权利要求1中所述的方法制备的人参蛋白用于制作保健食品。