CN104072593A

CN104072593A - 一种具有抗肿瘤和凝集活性的猴头菌糖蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN104072593A
Application number: CN201410314788.3A
Authority: CN
Inventors: 崔凤杰; 李云虹; 昝新艺; 孙文敬; 钱静亚; 张志才; 许宁
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2014-10-01

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤和凝集活性的猴头菌糖蛋白及其制备方法，属于活性蛋白制备技术领域。以猴头深层发酵制备的菌丝体或固体栽培技术获得的子实体为原料，经匀浆破碎、冷水浸提、离心、取上清液、硫酸铵沉淀、透析、DEAE-SepharoseFastFlow柱层析等步骤分离纯化获得的。该糖蛋白中多糖的含量为2~20%；蛋白质含量为80~90%，其分子量范围为10~80KDa。该糖蛋白具有对血红细胞凝集活性，并对肿瘤细胞，如肝癌细胞、胃癌细胞、乳腺癌细胞等的生长有显著抑制作用，可用于制备可能的抗癌药物或开发成保健品。

Description

一种具有抗肿瘤和凝集活性的猴头菌糖蛋白及其制备方法

技术领域 本发明属于活性蛋白制备技术领域，涉及一种具有抗肿瘤活性和凝集活性的猴头菌糖蛋白及其制备方法。

背景技术

食药用真菌具有抗肿瘤、降血脂、调节机体免疫、保护心脑血管等多种药用价值，关于其有效成分的分离、纯化及结构测定是目前研究热点之一。已经从其中分离出的活性成分包括：多糖、糖蛋白、萜类化合物和酚类化合物等。近年来，随着对食用真菌多糖复合物分离研究的深入，人们发现其具有显著的抗肿瘤作用。例如：PCP-3A，是一种从金顶侧耳的干子实体中提取分离出的糖蛋白，在浓度为50 μg/mL，作用于U937白血病细胞72 h后，对其抑制率达到97.70 ± 2.31%；HM-3A，是一种从真姬菇鲜子实体中提取分离出的糖蛋白，其多糖和蛋白含量分别为21.7 ± 1.9%和70.2 ± 1.6%，在浓度为100 μg/mL，作用于U937白血病细胞72 h后，对其抑制率达到96.2%。

猴头菌是一种珍贵的食药用真菌，肉质鲜美，营养丰富，有“山珍”之称，与熊掌、燕窝和鱼翅并列为四大名菜。它隶属于担子菌纲多孔菌目齿菌科，具有抗肿瘤、抗肥胖、抗氧化和抗菌等活性，能够有效治疗胃炎、胃溃疡和十二指肠溃疡等疾病。目前关于猴头菌活性成分的研究主要集中在多糖上，例如专利（CN 101921343A）公开了一种利用鲜猴头菇子实体提取多糖的方法，专利（CN 101560262）公开了一种从猴头菌丝体中提取胞内多糖的工艺组合及方法。而关于猴头菌糖蛋白成分的研究很少，仅有专利（CN 1772287）公开了一种猴头菌丝体发酵浸膏糖蛋白在制药中的应用。为了进一步促进关于猴头菌糖蛋白成分的研究，本发明以猴头菌深层发酵菌丝体或固体栽培的子实体为原料，分离纯化得到一种高纯度的具有抗肿瘤活性和凝集活性的猴头菌糖蛋白，并结合红外、气相色谱、氨基酸分析仪等确定了其理化性质。成果为猴头菌糖蛋白的分离纯化提供了参考价值，所提取到的猴头糖蛋白可用于制备可能的抗癌药物或开发成保健品。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性和凝集活性的猴头菌糖蛋白及其制备方法。该方法是以猴头深层发酵制备的菌丝体或固体栽培技术获得的子实体为原料，从中分离纯化出具有凝集活性和抗肿瘤活性的猴头菌糖蛋白，获得其基本的理化性质，所用方法简便安全。这种糖蛋白可用于开发成保健品或制备可能的抗癌药物。

为实现本发明的上述目的：

1、一种具有抗肿瘤和凝集活性的猴头菌糖蛋白，该糖蛋白中多糖含量为2~9%，由D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-半乳糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖和D-果糖等多种单糖组成；蛋白质含量为80~90%，由天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸等17种氨基酸组；其分子量范围为10~80 KDa。

2、上述糖蛋白具有显著的抗肿瘤作用，比如对人胃癌细胞SGC-7901的生长具有显著的抑制作用，因此，该糖蛋白具有成为抗肿瘤药物的可能性，具有极大的应用和推广前景。

3、上述糖蛋白对小鼠血红细胞具有显著的凝集作用。

4、一种制备上述具有抗肿瘤活性以及凝集活性的猴头糖蛋白的方法：按照下述步骤进行：（1）猴头菌子实体制备：将菌种保藏中心保藏的猴头菌种，如中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株猴头菌ACCC 50011栽培在豆秸粉、玉米秆粉、麦麸、阔叶树木糠、甜菜渣、甘蔗渣或棉籽壳等基质上，20~30^oC培养15~30 d，采集得到的子实体。

（2）猴头菌深层发酵菌丝体制备：将菌种保藏中心保藏的猴头菌种如中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株猴头菌ACCC 50011活化，将菌种斜面切割成小块接种到液体种子培养基中25^oC条件下培养7 d后收集种子液，接种于发酵罐中25^oC，100 r/min进行发酵7天，8000 r/min离心后获得猴头菌丝体。

（3）将上述所得子实体或者菌丝体加入0.8~3倍体积的水后匀浆破碎，4~20^oC浸提，离心，弃沉淀，取上清液，上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为60~90%，静置24~48 h，高速离心取沉淀，加少量水复溶沉淀，将沉淀复溶液置入8000~14000 Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液后浓缩，进行DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，依次用蒸馏水和0.1，0.3，0.5 mol/L NaCl溶液为洗脱液进行阶段式洗脱，收集各阶段洗脱得到的糖蛋白组分，浓缩后冷冻干燥即得到具有抗肿瘤和凝集活性的猴头菌糖蛋白。

用红外、气相色谱、氨基酸分析仪、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS等确定了其理化性质。该糖蛋白中杂多糖含量为2~9%，由D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-半乳糖和D-甘露糖等4种单糖组成；蛋白质含量为80~90%，由天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸等17种氨基酸组成；其分子量范围为10~80 KDa。

本发明所提供的猴头菌糖蛋白为一种全新的物质，且具有凝集活性和抗肿瘤活性，这种猴头菌糖蛋白可望成为有开发前景的抗癌药物。该复合物的制备方法可以固态栽培获得的猴头菌子实体或者深层发酵技术培养猴头菌丝体为原料，从中分离纯化出具有抗肿瘤活性与凝集活性的糖蛋白，制备工艺简单、易行，糖蛋白提取率较高，因此具有广阔的应用前景和潜在的经济效益。

附图说明

图1为本发明猴头菌糖蛋白的DEAE-Sepharose Fast Flow层析图

图2为本发明猴头菌糖蛋白的Superdex^TM75 prep grad柱层析和SDS-PAGE

图3 为本发明猴头菌糖蛋白经NCBI检索的肽指纹图谱(图中灰色注明分子量的部分为匹配得到的相同肽段的氨基酸序列)

图4为本发明猴头菌糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901生长的抑制作用(图中分别是猴头菌糖蛋白HE-1，HE-2，HE-3等样品在不同浓度下对SGC-7901细胞的抑制率)

图5为本发明猴头菌糖蛋白对小鼠红细胞的凝集作用及其热稳定性(图a为PBS及猴头菌糖蛋白HE-3对小鼠红细胞的凝集活性对比，图b为不同温度对猴头菌糖蛋白HE-3样品处理后其对小鼠红细胞的凝集活性变化)。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

本发明所述方法制备的具有凝集和抗肿瘤活性的猴头菌糖蛋白各项功能的测定试验

（1）抗肿瘤活性测定实验

用完全培养基将猴头糖蛋白样品稀释成不同浓度的样品溶液：200、100、50、25 μg/mL；取对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×10⁵/mL，将细胞加入96孔板中，每孔加入100 μL，置于37 ^oC、5% CO₂培养箱培养24 h，再加入不同浓度的蛋白样品溶液100 μL，空白对照组为加入等体积的RPMI1640完全培养基；每组设6个复孔，将细胞培养板移入CO₂培养箱中，在37 ^oC、5% CO₂及饱和湿度条件下培养48 h后，用MTT法于490 nm波长下测定并记录其吸光值，计算其对肿瘤细胞增殖抑制率。经测定猴头菌糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901的生长具有显著的抑制作用(见附图4)。

（2）凝集活性

取小鼠新鲜血液，用加有柠檬酸钠的采血管采集，在2000 rpm，4 ^oC离心10 min，用PBS(pH 7.2，0.02 M磷酸盐缓冲液)洗涤4次，再次离心，去上清。按红细胞压积用PBS配成2%的红细胞悬液。

　在“V” 型血凝板中加入25 μL 的PBS，取猴头菌糖蛋白样品1 mg/mL，25 μL 作倍比稀释，每孔加入2%的红细胞悬液，充分震荡混匀，血凝板在室温放置1 h，肉眼或显微镜检测观察结果。无血凝时血球沉于“V”型孔底部，呈一小圆点，凝集时血球相互集聚形成一片网络，血球不下沉。血凝滴度以2ⁿ(n为使血球凝集的最末孔数)表示。经测定猴头菌糖蛋白具有凝集活性，血凝滴度为2⁴ （见附图5）。

（3）热稳定性

取猴头菌糖蛋白(1 mg/mL)溶液，在恒温水浴中保温处理30 min，30-100 ^oC(30、40、50、60、70、80、90、100^oC)，取出后立即冰浴，在“V”型血凝板上分别进行倍比稀释，检测其对小鼠红细胞的凝集活性。

（4）理化特性

①分子量

采用凝胶过滤层析法和SDS－PAGE垂直板凝胶电泳法，测得猴头糖蛋白的分子量为10~80 kDa，结果见图2；

②氨基酸序列分析

将SDS-PAGE中的猴头抗肿瘤糖蛋白的单条带胶体切出，经还原烷基化蛋白质消化处理，再经MALDI-TOF-MS测定，其主要氨基酸序列包括QLNDETTQLRQHR、TDQYAALGQQLSALYR、MQAYMNRLTEAR、GVVSNLDDRYGSEEER、VVFADWMR以及GGEPINPQRWIAR，并通过NCBI检索与其匹配度较高的同源蛋白质序列，结果见图3。

本发明中的猴头菌糖蛋白，与其他糖蛋白的提取方法相比较，制备纯度更高，技术优势明显，能获得组分单一的活性组分。

实施例1

将中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株猴头菌ACCC 50011栽培在豆秸粉、玉米秆粉、麦麸、阔叶树木糠、甜菜渣、甘蔗渣或棉籽壳等基质上，20~30^oC培养15~30d，采集得到猴头菌子实体。

实施例2

将中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株猴头菌ACCC 50011活化，在PDA斜面培养基（200 g马铃薯沸水煮20 min后，过滤取滤液，加入20 g葡萄糖和20 g琼脂，补加水至1 L，pH自然）中培养菌种。培养用的试管以及棉塞均需在121^oC灭菌30 min，再装入培养基121^oC灭菌30 min，斜放冷却使其凝固成斜面。然后超净台接种。斜面培养在恒温25^oC左右进行，为期7天。将斜面菌种切割成小块接种到种子培养液，培养基分装完毕后，在锥形瓶上塞上棉塞，以防止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。种子培养液组成为：玉米粉 30.85 g/L，酵母膏2.81 g/L，玉米浆16.9 mL/L，葡萄糖 10 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，其余为水，pH自然；在 25^oC，100 rpm 条件下培养7 d后收集种子液，接种于20 L发酵罐中得发酵培养液中，液体培养基的组成为: (/L)：玉米粉30~50 g，酵母膏1~10 g，葡萄糖1~10 g，KH₂PO₄ 0.2~1 g，MgSO₄·7H₂O，0.1~1 g，其余为水，pH自然；25^oC发酵7天。

实施例3

500 g猴头菌子实体加入0.8倍体积的水后匀浆破碎，4 ^oC浸提，离心，弃不溶物，收集上清液，上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为80%，静置24 h，高速离心取沉淀，加少量水复溶上述沉淀，将复溶液置入8000-14000 Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液，浓缩，进行DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，用蒸馏水洗脱掉不结合组分，并依次用0.1 mol/L、0.3 mol/L和0.5 mol/L的NaCl为洗脱液进行梯度洗脱，收集NaCl溶液各阶段洗脱的糖蛋白组分，冷冻干燥各收集液；其中，将HE-1组分进行Superdex^TM 75 prep grad柱层析用蒸馏水洗脱收集得到单一组分。糖蛋白样品呈浅黄色絮状，采用红外、气相色谱、氨基酸分析仪、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS等确定了其理化性质。该糖蛋白中杂多糖含量为5.2%，由D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-阿拉伯糖和D-甘露糖等单糖组成；蛋白质含量为89.5%，由天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸等17种氨基酸组成；该糖蛋白复合物分子量为14.4 kDa。

实施例4

500 g猴头发酵菌丝体加入2倍体积的水后匀浆破碎，10 ^oC浸提，离心，弃不溶物，收集上清液，上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为70%，静置24 h，高速离心取沉淀，加少量水复溶上述沉淀，将复溶液置入8000-14000 Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液，浓缩，进行DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，用蒸馏水洗脱掉不结合组分并依次用不同浓度的NaCl为洗脱液进行梯度洗脱，收集不同浓度的NaCl溶液洗脱的糖蛋白复合物组分，冷冻干燥各收集液。其中，将HE-2组分进行Superdex^TM 75 prep grad柱层析，用蒸馏水洗脱得1个组分，说明其为单一组分，冷冻干燥后即得到猴头菌糖蛋白复合物，样品呈浅黄色絮状，采用红外、气相色谱、氨基酸分析仪、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS等确定了其理化性质。该糖蛋白中杂多糖含量为7.2%，由D-葡萄糖，L-鼠李糖，D-阿拉伯糖和D-木糖等单糖组成；蛋白质含量为85.2%，由甲硫氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸等17种氨基酸组成；该糖蛋白复合物分子量为18.20 kDa。

实施例5

500 g猴头菌丝体加入3倍体积的水后匀浆破碎，20 ^oC浸提，离心，弃不溶物，收集上清液，上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为60%，静置24 h，高速离心取沉淀，加少量水复溶上述沉淀，将复溶液置入8000-14000 Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液，浓缩，进行DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，用蒸馏水洗脱掉不结合组分并依次用不同浓度的NaCl为洗脱液进行梯度洗脱，收集不同浓度的NaCl溶液洗脱的糖蛋白复合物组分，冷冻干燥各收集液；其中，将HE-3组分进行Superdex^TM 75 prep grad柱层析，用蒸馏水洗得到单一组分的猴头菌糖蛋白复合物；样品呈浅黄色絮状，采用红外、气相色谱、氨基酸分析仪、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS等确定其理化性质。糖蛋白样品中杂多糖含量为8.86%，由D-葡萄糖，D-阿拉伯糖、D-果糖和D-甘露糖等4种单糖组成；蛋白质含量为81.8%，由天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸、丙氨酸等17种氨基酸组成；该糖蛋白复合物分子量为55.10 kDa。

实施例6

用完全培养基将猴头菌糖蛋白样品稀释成不同浓度的样品溶液：200、100、50、25 μg/mL；取对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为5×10⁵/mL，将细胞加入96孔板中，每孔加入100 μL，置于37 ^oC、5% CO₂培养箱培养24 h，再加入不同浓度的猴头菌糖蛋白样品溶液100 μL，空白对照组为加入等体积的RPMI 1640完全培养；每组设6个复孔，将细胞培养板移入CO₂培养箱中，在37 ^oC、5% CO₂及饱和湿度条件下培养48 h后，用MTT法于490 nm波长下测定并记录其吸光值，计算其对该癌细胞增殖抑制率。经测定猴头菌糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901的生长具有显著的抑制作用，结果见图4。

实施例7

　在“V” 型血凝板中加入25 μL 的PBS，取猴头菌糖蛋白样品1 mg/mL，25 μL作倍比稀释，每孔加入2%的红细胞悬液，充分震荡混匀，血凝板在室温放置1 h，肉眼或显微镜检测观察结果。无血凝时血球沉于“V”型孔底部，呈一小圆点，凝集时血球相互集聚形成一片网络，血球不下沉。血凝滴度以2ⁿ(n为使血球凝集的最末孔数)表示。经测定猴头菌糖蛋白具有凝集活性，血凝滴度为2⁴，结果见图5及表1。

取猴头菌糖蛋白(1 mg/mL)溶液，在恒温水浴中不同温度30-100 ^oC，保温处理30 min，取出后立即冰浴，在“V”型血凝板上分别进行倍比稀释，检测其对小鼠红细胞的凝集活性。从图5及表1可知，HE-3的凝集活性在30^oC以下时稳定，当热处理温度为40-60^oC时，其凝集活力减半， 90^oC以上温度热处理时，其凝集活性完全丧失。

本发明以猴头深层发酵制备的菌丝体或固体栽培技术获得的子实体为原料，分离纯化出了猴头菌糖蛋白，保持了糖蛋白的活性，经验证，该糖蛋白具有抗肿瘤活性以及凝血活性。本发明能普遍用于各种食药用真菌子实体以及菌丝体糖蛋白的分离纯化。

表1 温度对猴头菌糖蛋白凝集活性的影响作用

温度(^oC)	30	40	50	60	70	80	90	100
									凝集活力[U]	16	8	8	8	4	2	0	0

初始凝集活力是 16 U。

Claims

1.一种猴头菌糖蛋白，其特征在于：该糖蛋白中多糖含量为2~20%，由D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-木糖和D-果糖等多种单糖组成；蛋白质含量为80~90%，由天冬氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸等17种氨基酸组成；其分子量范围为10~80KDa。

2.根据权利要求1所述的猴头菌糖蛋白，其特征在于该糖蛋白可以制备得到具有对抑制肿瘤细胞的药物。

3.根据权利要求1所述的猴头菌糖蛋白，其特征在于该糖蛋白可以制备得到对血红细胞具有凝集活性的药物。

4.权利要求1所述的猴头菌糖蛋白的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）取猴头菌子实体或液体深层发酵得到的菌丝体，加0.5~3倍体积（w/v）的水，匀浆破碎，4~20 ^oC浸提24 h，离心，收集上清液，低温浓缩后，加入硫酸铵至饱和度为60~90%，静置12~48 h，高速离心取沉淀；

（2）取上述（1）中的沉淀，加少量水复溶，将复溶液置入8000~14000 Da的透析袋中，去离子水透析；

（3）收集上述（2）中的透析液，低温浓缩后，进行DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析，依次用蒸馏水和0.1 mol/L，0.3 mol/L，0.5 mol/L NaCl 为洗脱液进行梯度洗脱；OD₂₈₀ nm在线检测，收集的各洗脱部分等组分；

（4）收集上述（3）中的所有糖蛋白组分，低温浓缩后，经真空冷冻干燥，即得猴头菌糖蛋白。

5.根据权利要求4所述的猴头菌糖蛋白的制备方法，其特征在于：猴头菌子实体制备方法如下：将菌种保藏中心保藏的猴头菌种，如中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株猴头菌ACCC 50011栽培在豆秸粉、玉米秆粉、麦麸、阔叶树木糠、甜菜渣、甘蔗渣或棉籽壳等基质上，20~30^oC培养15~30 d，采集得到的子实体。

6.根据权利要求4所述的猴头菌糖蛋白的制备方法，其特征在于：猴头菌深层发酵菌丝体制备方法如下：将菌种保藏中心保藏的猴头菌种如中国农业微生物菌种保藏管理中心保藏菌株猴头菌ACCC 50011活化，将菌种斜面切割成小块接种到液体种子培养基中25^oC条件下培养7 d后收集种子液，接种于发酵罐中25^oC，100 r/min进行发酵7天，8000 r/min离心后获得猴头菌丝体。

7.根据权利要求4所述的猴头菌丝体制备方法，其特征在于：所述的种子培养液组成为：玉米粉 30.85 g/L，酵母膏2.81 g/L，玉米浆 16.9 mL/L，葡萄糖 10 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，其余为水，pH自然；发酵液体培养基的组成为(/L)：玉米粉30~50 g，酵母膏1~10 g，葡萄糖1~10 g，KH₂PO₄ 0.2~1 g，MgSO₄·7H₂O，0.1~1 g，其余为水，pH自然。