CN103509091B - 一种灰树花菌丝体抗肿瘤糖蛋白及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灰树花菌丝体抗肿瘤糖蛋白及制备方法，属于生物工程技术领域。该糖蛋白是以深层发酵的灰树花菌丝体为原料，并经匀浆破碎、冷水浸提、离心、取上清液、硫酸铵沉淀、透析、DEAE-Sepharose？Fast？Flow和SuperdexTM 75？prep？grad柱层析等步骤系统分离纯化获得的。该糖蛋白是多糖和蛋白质的复合物，其中多糖含量为2～10%，由阿拉伯糖、果糖、甘露糖和葡萄糖等4种单糖组成；蛋白质含量为30～90%，由天冬氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等17种氨基酸组成；其分子量范围为30～90KDa。该糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和人乳腺癌细胞MCF-7的生长有抑制作用，可用于制备可能的抗癌药物。同时本发明能普遍适用于各种药食用真菌深层发酵所得菌丝体中糖蛋白的分离纯化。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤等活性的灰树花深层发酵菌丝体糖蛋白及其制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
食药用真菌有效成分的分离及其结构的测定是目前研究热点之一。食药用真菌所含有有效成分的种类及其含量直接决定不同的生理活性和功能，因此不同的真菌代谢产物具有其独特的化学组成和生理活性。真菌多糖及其复合物与蛋白质、核酸并称为最重要的三种生物大分子。随着对多糖类化合物的分离、纯化、组成测定和结构分析等手段的进一步提高，人们对多糖类化合物的生物学功能（例如在细胞识别、细胞间物质运输、免疫调节、抗辐射及抗肿瘤等方面的作用）的认识也不断深入。
近年来诸多研究表明，多糖复合物类大分子物质也具有体外直接的抑制肿瘤细胞增殖的作用，例如，PLG-3，是一种从桑黄深层发酵菌丝体中提取分离出的糖蛋白，含有85.5%的蛋白和13.7%的多糖，能抑制肠癌A549细胞和肝癌HepG2细胞的增殖。Wang等人，以云芝发酵菌丝体为原料，通过Sepharose6B和SephadexG-50分离获得了一些小分子的糖肽，经体内试验研究表明它能刺激小鼠淋巴细胞和巨噬细胞的增殖，但是对纤维母细胞、肝癌细胞和绒膜癌细胞并没有直接的细胞毒活性。AAL，是从杨树菇中提取出的一种对人体Hela、SW480和SGC-7901细胞系及小鼠腹水瘤细胞S-180均具抑制作用的凝集素，经鉴定它的N-端序列为QGVNIYNI。
灰树花是一种珍贵的食药兼用型真菌，隶属于担子菌纲多孔菌科。多年以来灰树花生产主要以人工固体栽培为主，但固体栽培存在占地面积大、生产周期长、产量不稳定、劳动强度大，易受气候、环境因素影响等诸多缺点，产量难以大幅度提高。如果采用子实体提取多糖其其复合物，成本昂贵，且不满足工业化生产的需求；而利用液体深层发酵法可使灰树花生产工业化，可以大幅度降低提取多糖及其复合物的成本，缩短周期，增加产量，稳定质量。研究发现深层发酵得到的灰树花菌丝体，不但具有固体栽培子实体相当的营养及药用效果，还可得到胞外多糖等子实体所不具备的营养保健成分，因此灰树花深层发酵菌丝体可以替代子实体作为产品深度开发的原料。
目前，灰树花活性成分的研究，主要集中在灰树花子实体多糖、蛋白质和糖肽等，例如专利（CN1872875A）公开了一种灰树花子实体抗病毒蛋白及其提取方法和用途，专利（CN1634983A）公开了一种具有免疫活性与抗肿瘤活性的灰树花子实体蛋白聚糖，专利（CN1398898A）公开了一种灰树花子实体糖肽，为制备各种适应症的药物提供了可能。以上公开的专利，在提取多糖及其复合物的过程，都用到了乙酸和强碱等试剂，甚至涉及了脱蛋白等有可能损害产品活性的步骤，这在一定程度上限制了该类产品使用的广泛性，同时也影响产品的安全性。
然而，对灰树花深层发酵菌丝体中糖蛋白或糖肽的纯化方法、结构分析和生物活性的研究还未见报道或技术保护。为了进一步促进灰树花活性成分的研究和推进开发新型抗癌药物的潮流，本发明以灰树花深层发酵菌丝体为原料，采用水提盐析结合柱层析的方法，简便安全地分离纯化出了一种高纯度的灰树花菌丝体糖蛋白，并通过胶上酶解结合MALDI-TOF-MS的手段初步测定出了它的氨基酸序列，且经体外实验证明了该糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和人乳腺癌细胞MCF-7增殖有显著的抑制作用。成果可广泛应用于药食用真菌糖蛋白的提取分离纯化等领域，具有巨大的实用价值和经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的深层发酵灰树花菌丝体糖蛋白及其制备方法。该方法是利用生物工程发酵技术培养灰树花菌丝体，并从中提取出具有抗肿瘤活性的灰树花菌丝体糖蛋白，获得其基本的理化性质，所用方法步骤清晰，方便操作。这种糖蛋白可用于生产保健产品或进一步开发成新的天然抗癌药物。
为实现本发明的上述目的：本发明的技术方案如下：
一种具有抗肿瘤活性的灰树花菌丝体糖蛋白，该糖蛋白中多糖含量为2～10%，由阿拉伯糖，果糖，甘露糖和葡萄糖4种单糖组成；蛋白质含量为30～90%，由天冬氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等17种氨基酸组成；其分子量范围为30～90KDa。
上述具有抗肿瘤活性的灰树花菌丝体糖蛋白的制备方法，按照下述步骤进行：
（1）将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L）斜面保存的灰树花（Grifolafrondosa）菌种活化，切割成小块接种到种子培养基（葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O1g/L，玉米浆15g/L）中25oC，150r/min条件下培养6d后收集种子液，接种于发酵罐中进行发酵10天，8000r/min离心后获得桑黄菌丝体；所得菌丝体的产率为每升培养基80g。
（2）将此灰树花菌丝体加入1~4倍体积的水后匀浆破碎，4~20oC浸提，离心，弃沉淀，取上清液,上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为60～90％，静置24~48h，高速离心取沉淀，加少量水复溶沉淀,将沉淀复溶液置入8000~14000Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液后浓缩，进行DEAE-SepharoseFastFlow柱层析，依次用蒸馏水和0.1，0.3，0.5mol/LNaCl溶液为洗脱液进行阶段式洗脱，收集0.3mol/LNaCl溶液洗脱的糖蛋白复合物D2组分,浓缩后进行SuperdexTM75prepgrad柱层析，用蒸馏水洗脱，收集S1组分，冷冻干燥S1组分即得到桑黄菌丝体糖蛋白复合物。
本发明所述灰树花（Grifolafrondosa）菌株购至中国微生物菌种保藏中心，保藏编号为50072。，但本发明的保护范围不限于该菌株。
本发明用红外、气相色谱、氨基酸分析仪、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS等确定了其理化性质。该糖蛋白中杂多糖含量为2～10%，由阿拉伯糖，果糖，甘露糖和葡萄糖4种单糖组成；蛋白质含量为50～90%，由天冬氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等17种氨基酸组成；其分子量范围为：30～90kDa。
本发明糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和人乳腺癌细胞MCF-7增殖的抑制作用结果。分析可知，灰树花菌丝体糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和人乳腺癌细胞MCF-7的生长具有显著的抑制作用，因此，该糖蛋白具有成为抗癌药物的可能性，具有极大的推广和应用前景。
本发明中的灰树花菌丝体糖蛋白，与其他糖蛋白的提取方法相比较，科技含量更高，技术优势明显，能获得组分单一的活性组分。
本发明所提供的灰树花菌丝体多糖复合物为一种全新的物质，且具有抗肿瘤活性，这种灰树花菌丝体糖蛋白复合物可望成为理想的和有开发前景的抗癌药物或药物前体物质。该复合物的制备方法由于采用价格低廉的麸皮提取液为主要原料，利用生物工程发酵技术培养桑黄菌丝体，并从中分离纯化出具有抗肿瘤活性的糖蛋白，生产工艺简单、易行，生产周期较短，生产成本低廉，且糖蛋白产率较高，因此具有广阔的应用前景和潜在的经济效益。
附图说明
图1为本发明灰树花抗肿瘤糖蛋白的DEAE-SepharoseFastFlow层析图；
图2为本发明灰树花抗肿瘤糖蛋白的SuperdexTM75prepgrad柱层析和SDS-PAGE图；
图3为本发明灰树花抗肿瘤糖蛋白经NCBI检索的肽指纹图谱。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
本发明所述方法制取的灰树花抗肿瘤糖蛋白复合物各项性能的测定试验方法如下：
（1）抗肿瘤活性测定实验
用完全培养基将灰树花糖蛋白样品稀释成不同浓度的样品溶液：500、200、100、80、60、40、20、10μg/mL；取对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901和人乳腺癌细胞MCF-7，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为3-5×105/mL，将细胞加入96孔板中，每孔加入150μL，置于37oC、5%CO2培养箱培养24h，再加入不同浓度的蛋白样品溶液150μL，空白对照组为加入等体积的RPMI1640完全培养；每组设6个复孔，将细胞培养板移入CO2培养箱中，在37oC、5%CO2及饱和湿度条件下培养48h后，用MTT法于570nm波长下测定并记录其吸光值，计算肿瘤细胞增殖抑制率。
经测定灰树花菌丝体糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和人乳腺癌细胞MCF-7的生长具有显著的抑制作用，结果见表1。
（2）热稳定性
灰树花抗肿瘤糖蛋白经不同的温度和时间水浴处理，抗肿瘤活性在37oC下处理30-120min依然显著；
（3）理化特性
①分子量
采用凝胶过滤层析法和SDS－PAGE垂直板电源法，测得本抗菌糖蛋白的分子量为30～90kDa；结果见图2；
②氨基酸序列分析
将SDS-PAGE中的灰树花抗肿瘤糖蛋白的单条带胶体切出，经还原烷基化蛋白质消化处理，再经MALDI-TOF-MS测定，然后再NCBI上检索出与其匹配度较高的同源蛋白质序列，见图3。
实施例1
灰树花菌株（Grifolafrondosa50072），购至中国微生物菌种保藏中心。首先在斜面培养基中培养菌种。培养用的试管以及棉塞均需在121oC灭菌30min，再装入培养基121oC灭菌30min，斜放冷却使其凝固成斜面。然后超净台接种。斜面培养在恒温25oC左右进行，为期7天。将斜面菌种切割成小块接种到种子培养液，培养基分装完毕后,在锥形瓶上塞上棉塞，以防止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好的通气性能。种子培养液组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O1g/L，玉米浆15g/L,其余为水，pH自然；在25oC，160rpm条件下培养7d后收集种子液,接种于20L发酵罐中得发酵培养液中，液体培养基的组成为:葡萄糖45.2g/L，KH2PO42.97g/L，蛋白胨6.58g/L，MgSO4·7H2O1g/L，玉米浆15g/L，其余为水，pH自然；25oC发酵9天。所得菌丝体呈棕黄色，有浓郁香味。
实施例2
100g灰树花菌丝体加入1倍体积的水后匀浆破碎,4oC浸提，离心，弃不溶物，收集上清液,上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为80％，静置24h，高速离心取沉淀，加少量水复溶上述沉淀,将复溶液置入8000-14000Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液，浓缩，进行DEAE-SepharoseFastFlow柱层析，依次用蒸馏水和不同浓度的NaCl为洗脱液进行梯度洗脱，收集不同浓度的NaCl溶液洗脱的糖蛋白复合物组分,冷冻干燥各收集液。
OD280在线检测，共3个峰；经抗肿瘤活性检测，其中D2组分抗肿瘤活性较强。收集D2组分，低温浓缩后，进行SuperdexTM75prepgrad柱层析，用蒸馏水洗脱得3个组分，经抗肿瘤活性检测，其中S2组分抗肿瘤活性显著，冷冻干燥后即得到桑黄菌丝体糖蛋白。糖蛋白样品呈白色絮状，采用红外、气相色谱、氨基酸分析仪、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS等确定了其理化性质。该糖蛋白中杂多糖含量为6.2%，由阿拉伯糖，果糖，甘露糖和葡萄糖4种单糖组成；蛋白质含量为57%，由天冬氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等17种氨基酸组成；该糖蛋白复合物分子量为81.08kDa。
实施例3
100g灰树花菌丝体加入1倍体积的水后匀浆破碎,4oC浸提，离心，弃不溶物，收集上清液,上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为70％，静置24h，高速离心取沉淀，加少量水复溶上述沉淀,将复溶液置入8000-14000Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液，浓缩，进行DEAE-SepharoseFastFlow柱层析，依次用蒸馏水和不同浓度的NaCl为洗脱液进行梯度洗脱，收集不同浓度的NaCl溶液洗脱的糖蛋白复合物组分,冷冻干燥各收集液。
OD280在线检测，得3个峰；经抗肿瘤活性检测，其中D2组分活性较强，具有抗癌作用。收集B组分，低温浓缩，进行SuperdexTM75prepgrad柱层析，用蒸馏水洗脱得3个组分，经抗肿瘤活性检测，其中S2组分抗肿瘤活性显著，冷冻干燥后即得到桑黄菌丝体糖蛋白复合物，样品呈白色粉状，采用红外、气相色谱、氨基酸分析仪、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS等确定了其理化性质。该糖蛋白中杂多糖含量为7.8%，由阿拉伯糖，果糖，甘露糖和葡萄糖4种单糖组成；蛋白质含量为56%，由天冬氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等17种氨基酸组成；该糖蛋白复合物分子量为70.20kDa。
实施例4
100g灰树花菌丝体加入1倍体积的水后匀浆破碎,4oC浸提，离心，弃不溶物，收集上清液,上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为60％，静置24h，高速离心取沉淀，加少量水复溶上述沉淀,将复溶液置入8000-14000Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液，浓缩，进行DEAE-SepharoseFastFlow柱层析，依次用蒸馏水和不同浓度的NaCl为洗脱液进行梯度洗脱，收集不同浓度的NaCl溶液洗脱的糖蛋白复合物组分,冷冻干燥各收集液。
OD280在线检测，得3个峰；经抗肿瘤活性检测，其中D2组分活性较强，具有抗癌作用。收集B组分，低温浓缩，进行SuperdexTM75prepgrad柱层析，用蒸馏水洗脱得3个组分，经抗肿瘤活性检测，其中S2组分抗肿瘤活性显著，冷冻干燥后即得到桑黄菌丝体糖蛋白复合物，样品呈白色粉状，采用红外、气相色谱、氨基酸分析仪、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS等确定了其理化性质。该糖蛋白中杂多糖含量为2.56%，由阿拉伯糖，果糖，甘露糖和葡萄糖4种单糖组成；蛋白质含量为66.8%，由天冬氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等17种氨基酸组成；该糖蛋白复合物分子量为33.10kDa。
实施例5
用完全培养基将灰树花糖蛋白样品稀释成不同浓度的样品溶液：500、200、100、80、60、40、20、10μg/mL；取对数生长期的人胃癌细胞SGC-7901和人乳腺癌细胞MCF-7，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为3-5×105/mL，将细胞加入96孔板中，每孔加入150μL，置于37oC、5%CO2培养箱培养24h，再加入不同浓度的蛋白样品溶液150μL，空白对照组为加入等体积的RPMI1640完全培养；每组设6个复孔，将细胞培养板移入CO2培养箱中，在37oC、5%CO2及饱和湿度条件下培养48h后，用MTT法于570nm波长下测定并记录其吸光值，计算肿瘤细胞增殖抑制率。经测定灰树花菌丝体糖蛋白对人胃癌细胞SGC-7901和人乳腺癌细胞MCF-7的生长具有显著的抑制作用.
本发明以深层发酵灰树花菌丝体为原料，分离纯化出了菌丝体中的糖蛋白，保持了糖蛋白的活性，经验证，该蛋白具有抗肿瘤活性。本发明能普遍用于各种发酵菌丝体内糖蛋白的分离纯化。
表1灰树花抗肿瘤糖蛋白对SGC-7901和MCF-7细胞株增殖抑制的影响
注：**，阴性对照组相比，P<0.01；*与阴性对照组相比，P<0.05
Claims (1)
1.一种具有抗肿瘤活性的灰树花菌丝体糖蛋白的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
（1）将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基斜面保存的灰树花（Grifolafrondosa）菌种活化，切割成小块接种到种子培养基中25℃，150r/min条件下培养6d后收集种子液，接种于发酵罐中进行发酵10天，8000r/min离心后获得灰树花菌丝体；所得菌丝体的产率为30g/L；
（2）将灰树花菌丝体加入1~4倍体积的水后匀浆破碎，4~20℃浸提，离心，弃沉淀，取上清液,上清液浓缩后加入硫酸铵至饱和度为60～90％，静置24~48h，高速离心取沉淀，加少量水复溶沉淀,将沉淀复溶液置入8000~14000Da的透析袋，去离子水透析，收集透析液后浓缩，进行DEAE-SepharoseFastFlow柱层析，依次用蒸馏水和0.1，0.3，0.5mol/LNaCl溶液为洗脱液进行阶段式洗脱，收集0.3mol/LNaCl溶液洗脱的糖蛋白复合物D2组分，浓缩后进行SuperdexTM75prepgrad柱层析，用蒸馏水洗脱，收集S1组分，冷冻干燥S1组分即得到灰树花菌丝体糖蛋白；该糖蛋白中多糖含量为2～10%，由阿拉伯糖，果糖，甘露糖和葡萄糖4种单糖组成；蛋白质含量为30～90%，由天冬氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等17种氨基酸组成；其分子量范围为30～90KDa；
步骤（1）中马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基组成如下：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L；种子培养基组成如下：葡萄糖20g/L，蛋白胨2g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O1g/L，玉米浆15g/L。
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