CN1398898A

CN1398898A - 灰树花子实体多糖肽的提取分离方法

Info

Publication number: CN1398898A
Application number: CN 02136693
Authority: CN
Inventors: 茅仁刚; 蓝德刚; 王强
Original assignee: Weijing Zhonghua (shanghai) Biological Pharmacological Tech Co Ltd
Current assignee: Weijing Zhonghua (shanghai) Biological Pharmacological Tech Co Ltd
Priority date: 2002-08-28
Filing date: 2002-08-28
Publication date: 2003-02-26

Abstract

本发明涉及灰树花子实体多糖肽的提取分离方法。该方法是将灰树花子实体粉碎，热水提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得水溶性粗多糖肽，然后进行分级分离；提取水溶性多糖肽后得残渣加稀酸提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得酸溶性粗多糖肽；提取酸溶性多糖肽后的残渣加稀碱提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得碱溶性粗多糖肽。本发明利用酸性多糖肽、碱性多糖肽在不同pH条件下呈现的不同性质将灰树花子实体多糖肽分离纯化，为发挥各种灰树花子实体多糖肽的药效作用，制备各种适应症的药物提供了可能。

Description

灰树花子实体多糖肽的提取分离方法

技术领域

本发明涉及中药有效成份提取分离方法，具体涉及一种灰树花子实体多糖肽的提取分离方法。

背景技术

灰树花是属于担子菌纲多孔菌科的一种食用菌，其学名为Grifolafrondosa(Maitake)。研究发现灰树花多糖肽具有广泛的药理作用，可以抑制肿瘤、稳定血压、降低血糖、改善脂肪代谢。灰树花子实体中有多种多糖肽，不同的多糖肽具有各自不同的药理作用，目前尚缺乏对其多糖肽分级提取的有效方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是利用不同的多糖肽在不同PH条件下的不同性质，使灰树花子实体多糖肽得到分级分离纯化，提供一种有效的分级提取多糖肽的方法。

本发明实现灰树花子实体多糖肽分级分离纯化的技术方案为：

将原料粉碎，热水提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得水溶性多糖肽，然后进行分级分离；提取水溶性多糖肽后得残渣加稀酸提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得酸溶性粗多糖肽；提取酸溶性多糖肽后的残渣加稀碱提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得碱溶性粗多糖肽。

本发明分离纯化技术方案是通过下述具体步骤得以实现的：

1.水溶性粗多糖的提取：

以灰树花子实体为原料，粉碎成细粉，加2-20倍蒸馏水，热水50-121℃提取1-20小时，离心，上清液备用；残渣重复提取2-5次合并所有上清液，减压浓缩，缓慢加入1-4倍体积95％乙醇，搅匀，4℃过夜，离心，沉淀减压干燥，粉碎过100目，即得灰树花水溶性粗多糖肽；多糖含量为5％-90％，多肽含量为80％-5％。

2.水溶性多糖肽的分级分离

(1)粗多糖肽溶解于蒸馏水中，加1倍量95％乙醇沉淀，离心分离，沉淀溶于蒸馏水中。

(2)加1-20％CAT-OH至不再产生沉淀或加CAT-Br并用NaOH溶液调节pH≥8，离心分离，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-1。

(3)取上述(2)分离后沉淀加入1-50％乙酸5-100ml，离心，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-2。

(4)取上述(3)分离后沉淀加入0.5-20％NaOH溶液溶解，离心，取上清液，用乙酸调节pH5-8，加入1-4倍量95％乙醇，离心分离沉淀，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-3。

5)取上述(4)分离后沉淀溶解于蒸馏水中，脱蛋白，加1-4倍量95％乙醇，离心，沉淀用95％乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，减压干燥，碾碎即得FB-4。

FB-1组分为不与CAT-基团结合的多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。

FB-2、3、4组分别为能与CAT-基团结合的多糖肽，结合物不溶于水，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。

FB-2的主要组分为溶于乙酸的酸溶性多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。

FB-3的主要组分为溶于氢氧化钠的碱溶性多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。

FB-4的主要组分为溶于氢氧化钠的碱溶性多糖肽其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％。FB-4组分的多糖平均分子量为1×10⁴-1×10⁶，其单糖组成以葡萄糖为主，其中以β-1，3糖苷键为主要连接键。

3.酸溶性多糖肽的提取：

将上述步骤1中灰树花子实体热水提取后留下的残渣加入3-20倍量1-10％盐酸、醋酸等酸，室温至80℃下浸提6-48小时，离心得到酸提液，重复3次，酸提液合并，用碱调节pH7-10，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析12-48小时，对蒸馏水透析0.5-2天，减压干燥即得FBAc-1；透析液浓缩，加1∶0.5-4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得FbAc-2。酸溶性多糖肽中糖含量为5-99％，蛋白质含量为50-0.5％。

4.碱溶性多糖肽得提取：

将上述步骤3中灰树花子实体热水提取后留下得残渣加入3-20倍量1-30％碱，此碱可以是氢氧化钠、氢氧化钙等，室温至80℃下浸提12-48小时，离心得到碱提液，重复3次，碱提液合并，用乙酸调节pH4-9，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析12-48小时，对蒸馏水透析0.5-2天，减压干燥即得FBA1-1；透析液浓缩，加1∶0.5-4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得FbA1-2。碱溶性多糖肽中糖含量为5-99％，蛋白质含量为50-0.5％。

用本发明分离获得的多糖肽可用Sevag法、三氯乙酸法和酶法或几种方法同时应用进行脱蛋白处理，以得到纯化多糖，多糖含量为10-99.5％。

本发明采用有机溶剂沉淀，除上述所用的乙醇外，还可采用丙酮。

本发明利用水提有机溶剂沉法提取总多糖肽，再利用酸性多糖肽、碱性多糖肽在不同PH条件下呈现的不同性质而得到分离纯化。本发明方法操作简便，各种多糖肽分离效果显著，为发挥各种灰树花子实体多糖肽的药效作用，制备各种适应症的药物提供了可能。

具体实施方式实施例1 灰树花水溶性粗多糖肽的提取

称取灰树花子实体细粉1000g，加8000ml蒸馏水，95±2℃水浴提取1小时，5000rpm离心15分钟，上清液留用。残渣加入8000ml蒸馏水，95±2℃水浴提取2小时，重复3次，合并所有上清液。减压浓缩，加入4倍体积95％乙醇，4℃过夜，5000rpm离心15分钟，沉淀减压干燥，碾碎，即得灰树花粗多糖肽224.8g，其中多糖肽含量为48.6％。实施例2 灰树花水溶性粗多糖肽的提取

称取灰树花子实体小块1000g，加8000ml蒸馏水，121℃高压提取1.5小时，8000rpm离心15分钟，上清液留用。残渣加入8000ml蒸馏水，121℃高压提取1小时，8000rpm离心15分钟，重复3次，合并所有上清液。减压浓缩，加入4倍体积95％乙醇，4℃过夜，5000rpm离心15分钟，沉淀减压干燥，碾碎，即得灰树花粗多糖肽224.7g，其中多糖肽含量为58.7％。实施例3 灰树花酸溶性多糖肽的提取

将灰树花子实体热水提取后留下的残渣加入5％盐酸5000ml，40℃下浸提12小时，离心得到酸提液，重复3次，酸提液合并，用碱调节PH9，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析24小时，对蒸馏水透析24小时，减压干燥即得20g FBAc-1；透析液浓缩，加4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得62g FbAc-2，其中多糖肽的含量分别为62.6％、48.5％。实施例4 灰树花碱溶性多糖肽的提取

将灰树花子实体酸水提取后留下的残渣加入5000ml，5％氢氧化钠，60℃下浸提24小时，离心得到碱提液，重复3次，碱提液合并，用乙酸调节PH5，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析24小时，对蒸馏水透析48小时，减压干燥即得8.2g FBA1-1；透析液浓缩，加4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得50g FbA1-2，其中多糖肽的含量分别为73.2％、54.8％。。实施例5 灰树花粗多糖肽的分级分离

灰树花水溶性粗多糖肽100g溶解于蒸馏水中，加10％CAT-OH至不再产生沉淀，离心分离，上清液浓缩，采用蛋白酶+Sevag法脱蛋白：加Na₂CO₃调节pH7.8，加蛋白酶1.0g，37℃保温3昼夜，对自来水、蒸馏水各透析24小时，适当浓缩，加入Sevag试剂50ml，充分振摇，5000rpm离心15min，分离有机相，水层重复脱蛋白10次，减压干燥。加4倍量95％乙醇沉淀，干燥得4.8g FB-1，多糖肽的含量为74.8％。沉淀加入20％乙酸50ml，离心，上清液浓缩，采用蛋白酶+Sevag法脱蛋白，加入4倍量95％乙醇沉淀，干燥得24.7gFB-2，多糖肽的含量为72.6％。沉淀加入6％NaOH溶液溶解，离心，取上清液，采用蛋白酶+Sevag法脱蛋白，加入4倍量95％乙醇沉淀，干燥得2.8g FB-3，多糖肽的含量为64.7％。沉淀溶解于20ml蒸馏水中，采用蛋白酶+Sevag法脱蛋白，加4倍量95％乙醇，离心，沉淀用95％乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，丙酮洗涤，减压干燥，碾碎即得4.3g FB-4多糖肽的含量为81.4％。

Claims

1、灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于该方法是将灰树花子实体粉碎，热水提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得水溶性粗多糖肽，然后进行分级分离；提取水溶性多糖肽后得残渣加稀酸提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得酸溶性粗多糖肽；提取酸溶性多糖肽后的残渣加稀碱提取，乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，得碱溶性粗多糖肽。

2、如权利要求1所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的水溶性多糖肽的分离包括下列步骤：

A、水溶性粗多糖的提取：

以灰树花子实体为原料，粉碎成细粉，加2-20倍蒸馏水，热水50-121℃提取1-20小时，离心，上清液备用；残渣重复提取2-5次合并所有上清液，减压浓缩，缓慢加入1-4倍体积95％乙醇，搅匀，4℃过夜，离心，沉淀减压干燥，粉碎过100目，即得灰树花水溶性粗多糖肽；多糖含量为5％-90％，多肽含量为80％-5％；

B.水溶性多糖肽的分级分离

(1)粗多糖肽溶解于蒸馏水中，加1倍量95％乙醇沉淀，离心分离，沉淀溶于蒸馏水中；

(2)加1-20％CAT-OH至不再产生沉淀或加CAT-Br并用NaOH溶液调节pH≥8，离心分离，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-1；

(3)取上述(2)分离后沉淀加入1-50％乙酸5-100ml，离心，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-2；

(4)取上述(3)分离后沉淀加入0.5-20％NaOH溶液溶解，离心，取上清液，用乙酸调节pH5-8，加入1-4倍量95％乙醇，离心分离沉淀，上清液浓缩，脱蛋白，加入2-4倍量95％乙醇沉淀，干燥得FB-3；

3、如权利要求1所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的酸溶性多糖肽的提取包括下列步骤：

将权利要求2步骤A中灰树花子实体热水提取后留下的残渣加入3-20倍量1-10％盐酸、醋酸等酸，室温至80℃下浸提6-48小时，离心得到酸提液，重复3次，酸提液合并，用碱调节pH7-10，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析12-48小时，对蒸馏水透析0.5-2天，减压干燥即得FBAc-1；透析液浓缩，加1∶0.5-4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得FbAc-2；酸溶性多糖肽中糖含量为5-99％，蛋白质含量为50-0.5％。

4、如权利要求1所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的碱溶性多糖肽得提取包括下列步骤：

将权利要求3中灰树花子实体热水提取后留下得残渣加入3-20倍量1-30％碱，此碱可以是氢氧化钠、氢氧化钙等，室温至80℃下浸提12-48小时，离心得到碱提液，重复3次，碱提液合并，用乙酸调节pH4-9，离心，沉淀用蒸馏水溶解，对自来水流水透析12-48小时，对蒸馏水透析0.5-2天，减压干燥即得FBA1-1；透析液浓缩，加1∶0.5-4倍体积95％乙醇，4℃过夜，离心得沉淀溶于蒸馏水，透析，减压干燥得FbA1-2；碱溶性多糖肽中糖含量为5-99％，蛋白质含量为50-0.5％。

5、如权利要求1或2所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的：

FB-1组分为不与CAT-基团结合的多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％；

FB-2、3、4组分为能与CAT-基团结合的多糖肽，结合物不溶于水，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量分别为80-5％；

FB-2的主要组分为溶于乙酸的酸溶性多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％；

FB-3的主要组分为溶于氢氧化钠的碱溶性多糖肽，其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％；

FB-4的主要组分为溶于氢氧化钠的碱溶性多糖肽其中糖含量为5-80％，蛋白质含量为80-5％；FB-4组分的多糖平均分子量为1×10⁴-1×10⁶，其单糖组成以葡萄糖为主，其中以β-1，3糖苷键为主要连接键。

6、如权利要求1或2或3或4所述的灰树花子实体多糖肽的提取分离方法，其特征在于其中所述的分离获得的多糖肽可用Sevag法、三氯乙酸法、盒酶法或几种方法同时应用进行脱蛋白处理，以得到纯化多糖，多糖含量为10-99.5％。