CN1872875B - 灰树花抗病毒蛋白质、提取方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灰树花抗病毒蛋白质、提取方法及用途，提取方法是：(1)将灰树花子实体粉末加入70-90℃的水浸泡后离心；(2)上清液加入乙醇水溶液，在2-6℃，放置8-16小时后离心；(3)沉淀加入乙酸，在2-6℃，放置1-3小时后离心；(4)沉淀加入氢氧化钠水溶液，2-6℃，放置1-3小时后离心；(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，在2-6℃，放置8-16小时后离心；(6)沉淀加入重蒸馏水，透析；(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质，本发明的一种灰树花抗病毒蛋白质的提取步骤简单，提取成本较低，原料易得，实验证明对病毒性感染有一定的疗效。

Description

灰树花抗病毒蛋白质、提取方法及用途

技术领域

本发明涉及一种真菌提取物、提取方法及用途，特别是涉及一种灰树花提取物、提取方法及用途。

背景技术

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染眼部引起的单疱病毒性角膜炎(herpes simplexkeratitis，HSK)可导致角膜溶解、新生血管形成及溃疡穿孔等严重病理改变，是当今世界上危害严重的感染性眼病之一，发病率占角膜病的首位。由于抗生素、类固醇激素及其他免疫抑制剂的广泛应用，HSK发病率有明显上升趋势，往往因反复发作，迁延不愈，对视力功能损害较大，是常见的严重致盲性眼病。临床上尚缺乏有效控制和治愈HSK的药物。

乙型肝炎和丙型肝炎会导致肝硬化和肝癌，是严重危害人类健康的传染病；我国病毒性肝炎发病率居世界首位，每年我国治疗病毒性肝炎方面的相关支出在300亿至500亿元。但目前对病毒性疾病的治疗仍缺乏专属性强的药物。国际公认的临床治疗乙肝的药物有干扰素(IFN)及拉米夫定(3TC)，前者的远期疗效只有20％～30％左右；后者易产生耐药毒株。ACV是治疗HSV病毒的首选药物，但它易产生耐药毒株。因此，寻求高效、低毒的抗病毒药物成为国内外新药研究的热点。

20世纪60年代人们发现食用菌具有抗病毒活性。从皱褶罗鳞伞子实体中分离出一种名为RC-183的蛋白质，RC-183能抑制疱疹病毒、流感病毒及HIV病毒等多种病毒的复制。孙慧等曾从杨树菇等几种食用菌中分离到抑制TMF的蛋白，但迄今从食用菌中分离纯化出抗病毒蛋白还很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种灰树花抗病毒蛋白质。

本发明的第二个目的是提供一种灰树花抗病毒蛋白质的提取方法。

本发明的第三个目的是提供一种灰树花抗病毒蛋白质的用途。

本发明的技术方案概述如下：

一种灰树花抗病毒蛋白质，是用下述方法提取：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶1-15的比例加入70-90℃的水浸泡5-15小时后离心；

(2)上清液加入1-3体积倍的体积百分比浓度为60％-90％的乙醇水溶液，在2-6℃，放置8-16小时后离心；

(3)沉淀加入1-3质量倍的乙酸，在2-6℃，放置1-3小时后离心；

(4)沉淀加入1-3质量倍的质量百分比浓度为4％-10％的氢氧化钠水溶液，2-6℃，放置1-3小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，在2-6℃，放置8-16小时后离心；

(6)沉淀加入1-3质量倍的重蒸馏水，透析8-16小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.1mol/L-0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

优选的是：一种灰树花抗病毒蛋白质，所述提取方法是：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小时后离心；

(2)上清液加入2体积倍的体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小时后离心；

(3)沉淀加入2质量倍的乙酸，在4℃，放置2小时后离心；

(4)沉淀加入2质量倍的质量百分比浓度为6％的氢氧化钠水溶液，4℃，放置2小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，在4℃，放置12小时后离心；

(6)沉淀加入2质量倍的重蒸馏水，透析12小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.2mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

一种灰树花抗病毒蛋白质的提取方法，包括如下步骤：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶1-15的比例加入70-90℃的水浸泡5-15小时后离心；

(2)上清液加入1-3体积倍的体积百分比浓度为60％-90％的乙醇水溶液，在2-6℃，放置8-16小时后离心；

(3)沉淀加入1-3质量倍的乙酸，在2-6℃，放置1-3小时后离心；

(4)沉淀加入1-3质量倍的质量百分比浓度为4％-10％的氢氧化钠水溶液，2-6℃，放置1-3小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，在2-6℃，放置8-16小时后离心；

(6)沉淀加入1-3质量倍的重蒸馏水，透析8-16小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.1mol/L-0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

一种灰树花抗病毒蛋白质的提取方法，优选的提取步骤是：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小时后离心；

(2)上清液加入2体积倍的体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小时后离心；

(3)沉淀加入2质量倍的乙酸，在4℃，放置2小时后离心；

(4)沉淀加入2质量倍的质量百分比浓度为6％的氢氧化钠水溶液，4℃，放置2小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，在4℃，放置12小时后离心；

(6)沉淀加入2质量倍的重蒸馏水，透析12小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.2mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

一种灰树花抗病毒蛋白质，在制备抗病毒药物中的应用。

本发明的优点：本发明的一种灰树花抗病毒蛋白质的提取步骤简单，提取成本较低，原料易得，实验证明对病毒性感染有一定的疗效。

附图说明

图1为一种灰树花抗病毒蛋白质的提取工艺流程图；

图2为用SDS-PAGE鉴定一种灰树花抗病毒蛋白质(GFAP)的分子量；

图3为一种灰树花抗病毒蛋白质(GFAP)对2.2.15细胞的毒性(MTT法)；

图4为一种灰树花抗病毒蛋白质(GFAP)对2.2.15细胞HBeAg分泌的抑制作用；

图5为GFAP对2.2.15细胞系HBV DNA的抑制作用；

图6为GFAP对HBsAg与抗HBs抗体结合的抑制作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种灰树花抗病毒蛋白质，用下述方法提取：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小时后，2500rpm离心20min；

(2)上清液加入2体积倍的体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小时后离心；

(3)沉淀加入2质量倍的乙酸，在4℃，放置2小时后离心；

(4)沉淀加入2质量倍的质量百分比浓度为6％的氢氧化钠水溶液，4℃，放置2小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，放置12小时后，10,000rpm离心10min；

(6)沉淀加入2质量倍的重蒸馏水，透析12小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.2mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

实施例2

一种灰树花抗病毒蛋白质，用下述方法提取：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶1的比例加入90℃的水浸泡15小时后离心；

(2)上清液加入3体积倍的体积百分比浓度为60％的乙醇水溶液，在6℃，放置8小时后离心；

(3)沉淀加入1质量倍的乙酸，6℃，放置3小时后离心；

(4)沉淀加入3质量倍的质量百分比浓度为4％的氢氧化钠水溶液，2℃，放置3小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，放置8小时后离心；

(6)沉淀加入1-3质量倍的重蒸馏水，透析16小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.1mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

实施例3

一种灰树花抗病毒蛋白质，用下述方法提取：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶15的比例加入70℃的水浸泡5小时后离心；

(2)上清液加入1体积倍的体积百分比浓度为90％的乙醇水溶液，在2℃，放置16小时后离心；

(3)沉淀加入3质量倍的乙酸，在2℃，放置1小时后离心；

(4)沉淀加入1质量倍的质量百分比浓度为10％的氢氧化钠水溶液，6℃，放置1小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，放置16小时后离心；

(6)沉淀加入1-3质量倍的重蒸馏水，透析8小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

实施例4

从灰树花子实体粉末分离到一种抗单纯疱疹病毒的蛋白质(Grifolan Frondosaantiviral protein，GFAP)，通过体外实验研究了GFAP抗HSV-1作用。为了验证其体内抗HSV-1作用，本实验采用小鼠HSK模型，观察了GFAP对小鼠病毒性角膜炎的治疗效果。现将结果报道如下：

实验1GFAP的分离、纯化及其生物学活性

1.1实验材料

1.1.1细胞和病毒株：Vero细胞为本研究室保存细胞株；HSV-1KOS株为天津医科大学保存毒株。

1.1.2主要试剂与药品：灰树花购自浙江方格药业有限公司；ACV为武汉普生公司生产注射用干粉。DEAE-Sepharose为Pharmacia公司产品；蛋白质分子质量标准为宝生物产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、SDS为上海生工生物工程有限公司产品。

1.1.3主要仪器：稳压稳流电泳仪、垂直电泳槽为北京六一仪器厂产品；切胶仪Spotpicker为Amersham Science产品；基质辅助激光解吸附飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/MS，Reflex III)为德国BRUKER公司产品。

1.2实验方法

1.2.1灰树花各组分的提取分离方法

见实施例1中步骤(1)-(6)，具体提取步骤见图1。

1.2.2各组分抗病毒实验

待Vero细胞长成单层后倾去培养基，每孔加入100TCID₅₀的HSV-1病毒悬液。感染病毒2h后弃去病毒液，使用维持液洗2遍。分别加入不同浓度的各个组分，样品每个浓度3复孔。将96孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，显微镜下观察细胞病变，记录各孔的CPE。待病毒对照孔细胞完全病变时，做MTT染色和光吸收值(OD₄₉₂)测定，并计算抑制率。

2.2.3组分3中蛋白质的离子交换柱分离

将图1中所示组分3中蛋白质浓缩后装入透析袋，4℃下在0.1M Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液中充分透析，透析后的样品上样于经0.1M Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液充分平衡的DEAE-sepharose(37x1.3cm)层析柱上，然后分别用20ml含0～1M NaCl作线性梯度洗脱，经280nm紫外检测，收集各蛋白质吸收峰，然后测定各组分抗HSV-1活性。

1.2.4蛋白质含量测定

采用考马斯亮兰法测定蛋白质的含量

以牛血清白蛋白作标准对照，绘制考马斯亮兰法测定蛋白质含量的标准曲线，然后测定GFAP的蛋白质含量。具体步骤如下：吸取1.0ml GFAP溶液加入到具塞试管中，以1.0ml蒸馏水作空白对照，各加考马斯亮兰溶液5.0ml，摇匀，4-6min后在分光光度计上于280nm处测定各样品的吸光度OD₂₈₀。计算求得GFAP的蛋白质含量。

1.2.5SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳

1.2.5.1按下表分别配制分离胶和浓缩胶

试剂                15％分离胶(ml)    5％浓缩胶(ml)

30％凝胶贮存液      5                 0.83

分离胶缓冲液        1.25              0

15％分离胶缓冲液    0                 1.26

10％SDS             0.1               0.05

重蒸水              3.55              2.81

10％过硫酸铵        0.1               0.05

1％TEMED            0.004             0.005

10％过硫酸铵和1％TEMED最后加入。

1.2.5.2灌制：迅速将分离胶加至两玻璃板的间隙，留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在分离胶上面小心注入一层水(约3mm高)，以阻止氧气进入凝胶溶液。待分离胶聚合完全后，倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温。待浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子。

1.2.5.3电泳：把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部两层玻璃板之间的气泡。

1.2.5.4处理样品：将待分析的样品与等体积的样品处理液混合，100℃水浴3-5分钟，冰浴冷却。

1.2.5.5加样：按预定顺序加入已处理的样品，加样量通常为10～25μl(1.5mm厚的胶)。

1.2.5.6电泳：将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约1cm，然后关闭电源。

1.2.5.7剥胶：从电泳装置上取出玻璃板，撬开玻璃板。紧靠最左边一孔(第一槽)凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

1.2.5.8染色：用考马斯亮蓝R250对SDS-PAGE电泳分离的蛋白质进行染色。染色1～2小时或过夜。

1.2.5.9脱色与保存

用脱色液脱色，需3～10小时，其间多次更换脱色液至背景清楚.用脱色液清洗，少量多换，直至条带清晰.脱色后，可将凝胶浸于甘油中，或装在塑料袋内放置于4℃保存.为永久性保存，可对凝胶进行拍照.

1.2.5GFAP的肽质量指纹谱(PMF)的分析及数据库检索

由国家生物医学分析中心使用MALDI-TOF/MS分析其分子量和PMF。具体方法如下：将GFAP蛋白质斑点从电泳凝胶上切下，用含100mM碳酸氢氨∶50％乙腈1∶1的溶液在37℃振摇30min，重复此步骤直到完全脱色，胶片真空干燥后用胰蛋白酶酶切提取肽段，然后与过量的基质混合，加在样品靶盘上，溶剂挥发后蛋白质与基质形成共结晶，再用脉冲激光照射靶点，导致蛋白质电离，经过质量分析器检测，获得PMF。将GFAP的质量指纹谱同NCBI等数据库中蛋白质序列进行比较，寻找具有相似肽指纹谱的蛋白质。

1.2.6GFAP的N端氨基酸序列分析

SDS-PAGE电泳后去除浓缩胶，将凝胶和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡20min，采用Bio-Rad公司的Mini TransBlot Cell装置，以200mA稳流1h将蛋白质从凝胶电转移到硝酸纤维素膜上。将滤膜置于100％甲醇中润湿几秒后在染色液中浸泡1min，甲醇脱色至蛋白质条带清楚并在超纯水中漂洗后自然晾干，然后进行N端氨基酸序列测定。N端氨基酸序列测定由国家生物医学分析中心色谱室完成。

1.3结果

1.3.1灰树花各组分抗病毒活性

通过40％硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析，从灰树花子实体中分离到了一种具有抗HSV-1作用的蛋白质(GFAP)。灰树花热水提取物(F1)和灰树花D组分(F2)抗HSV-1的IC₁₀₀分别是512μg/ml和128μg/ml。灰树花40％硫酸铵沉淀(F3)具有抗病毒活性。将灰树花40％硫酸铵分级沉淀溶于水，用DEAE-Sepharose交换柱层析分离，得到四个组分(F6-F9)。经抗病毒活性检测，组分7(F7)具有抗HSV-1活性(表2-1)。

表1灰树花中抗HSV-1物质的分离及活性

*：完全抑制HSV-1病毒感染细胞的样品最小浓度。

1.3.2GFAP的离子交换柱分离

将F3浓缩后透析，然后上样于DEAE-sepharose层析柱，用不同浓度的NaCl作线性梯度洗脱，收集各蛋白质吸收峰，获得到四个组分(F6-F9)，并测定各组分抗HSV-1活性.研究结果发现，F3中有四个主峰，其中峰2(F7)含抗HSV-1活性的蛋白质.将F7用透析袋在蒸馏水中透析12h，其间换水2～3次，再用聚乙二醇浓缩，得到GFAP.

1.3.3GFAP的纯度、分子质量、蛋白质含量和含糖量等测定

由SDS-PAGE电泳图(图2)中可以看出，考马斯亮蓝染色后，GFAP样品显示一条均一的蛋白质条带，说明GFAP已达到电泳纯。GFAP是一个单亚基蛋白，其分子质量约为29.5kDa。使用MALDI-TOF质谱技术直接分析它的分子量，测定分子量为29529Da。两种方法鉴定GFAP的分子量基本上是一致的。

由苯酚-硫酸法测得GFAP的含糖量约为1.5％，用考马斯亮兰法测定GFAP的蛋白质含量为95.3％。证实GFAP是一种天然糖蛋白。

1.3.4GFAP的PMF的制备及数据库检索

用PMF鉴定蛋白质主要基于以下参数：匹配的肽段数、质量精度、肽谱的质量、分子量、峰的强度、分子量和等电点实验值和理论值的差异。用MALDI-TOFs技术制备GFAP的PMF，共检出13条肽谱峰。通过查询NCBI等数据库，分析比较数据库的检索结果，筛选出最适匹配记录(表2)。相关检索结果中以真菌来源的一种Serine proteianse(Accession：gi28804524)为匹配最好。这种Serine proteianse的分子量为40410Da，而GFAP的分子量为29529kDa，两者的分子量有很大的差异。丝氨酸蛋白酶(Serine proteianse)是一个蛋白酶家族，它们的作用是断裂大分子蛋白质中的肽键，使之成为小分子蛋白质。在细胞内蛋白酶参与机体内许多反应，如：凝血过程、激素作用反应、补体的级联作用反应。但此酶具有抗病毒活性尚未见报道。

表2GFAP蛋白的数据库检索结果

1.3.5GFAP的N端氨基酸序列分析

N端氨基酸序列分析表明，GFAP的N端序列为：RTQDNAPNGLN。测得GFAP的N末端部分氨基酸序列后，将GFAP的N末端11个氨基酸的序列片段为靶序列，在NCBI服务器上采用BLAST程序进行序列对蛋白质序列数据库进行比较检索，寻找其和已知蛋白的同源性。在Blast检索结果中选择了相似性较高的3个蛋白进行对比分析，见表(3)。Hypothetical protein TTHERM_00324530全序列长1565氨基酸，发现它和GFAP具有87％的相似性。将它与GFAP所测得的N-氨基酸序列蛋白匹配发现，其N端第632个氨基酸是和GFAP的第1个氨基酸开始匹配的，这个蛋白的功能是未知的。Serine proteinase全序列长379氨基酸，发现它和GFAP具有82％(9/11)的相似性，其N端的第92个氨基酸是和GFAP的第1个氨基酸开始匹配的。Hypothetical protein TTHERM_00637630全序列长1076氨基酸，发现它和GFAP具有87％(7/8)的相似性.将它与GFAP蛋白匹配发现，其N端第206个氨基酸是和GFAP第4个氨基酸开始匹配的，这个蛋白的功能都是未知的.

表3GFAP的氨基酸序列同源性分析

Table3 Analysis of amino acid sequence homology of GFAP

1.4讨论

灰树花属多孔菌科的一种食用菌，其主要的生物活性物质为多糖，其次为蛋白质。据中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所检测，灰树花干品含蛋白质31.5％，碳水化合物49.69％，多糖28.5％。蛋白质是灰树花的主要成分之一，但目前对其中的蛋白质的结构和功能的研究还比较少。陈宁从灰树花中分离纯化出一种抑制TMV侵染的新蛋白质GFPP。GFPP含有两个亚基，其分子量分别为34kDa、40kDa。GFPP是一种酸性的热稳定性蛋白质，它可以耐受80℃高温。GFPP的40kDa蛋白的N端氨基酸测序表明，其为一个新的氨基酸序列^[71]，这是首次从灰树花中分离到抗病毒蛋白。这个蛋白具有抗植物病毒的活性，而它是否具有抗医学病毒作用还未见报道。我们利用疱疹病毒感染细胞模型从灰树花中分离到这种抗病毒蛋白质GFAP，分子量为29.5kDa，是单亚基蛋白质。其N末端的11个氨基酸序列与Serine proteianse、hypothetical protein等具有较高的相似性。

近年来随着生物质谱技术，如MALDI-TOF等质谱软电离技术的发展，PMF结合数据库检索的方法鉴定蛋白质是目前较为常用的鉴定方法。由于蛋白质的氨基酸序列各不相同，被酶切位点专一的蛋白酶水解后所得的肽混合物具有特征性，称为指纹谱。蛋白的基团越大，质谱检测的准确率越低。因此，在质谱检测之前，须将蛋白消化成小分子的多肽，以提高质谱检测的准确率。一般而言，6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶，它于蛋白的赖氨酸和精氨酸处将其切断。因此，同一种蛋白经胰蛋白酶消化后，会产生相同的多肽。应用MALDI-TOF测定肽混合物不需分离即可直接分析，谱峰简单，每个谱峰代表一种肽段，分析速度快，灵敏度高。本研究利用MALDI-TOF质谱技术，建立了PMF鉴定GFAP的方法。并用MALDI-TOF测定了GFAP的分子量，实现了对GFAP的初步鉴定。

凝胶电泳能够用来估计蛋白质的分子量，尽管在最佳条件下时误差为1-10％，但凝胶电泳依然是一种对蛋白分子量进行估计的高通量的方法。现在，通过质谱技术如MALDI-TOF可以获得更加精确的分子质量。MALDI-TOF质谱技术是目前蛋白质鉴定中精确测定测定分子量的手段，特别适合对混合蛋白多肽类物质的相对分子质量的测定^[77]。然而，质谱仪是昂贵的，并非每一个实验室都可以拥有，而且样品需要的纯化，因为这些方法通常不能耐受在生物学实验室广泛使用的含盐的缓冲液。质谱测定对样品的含盐量有着严格的要求，若含盐量过高将无法检测到样品峰。样品在测定前有必要进行透析完全去除盐分。本研究使用凝胶电泳和MALDI-TOF质谱技术分析GFAP的分子量，其分子量约为29.5kD。两种方法鉴定GFAP的分子量基本上是一致的。

1.5小结

通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析，我们从灰树花中分离到了一种抗病毒的蛋白质。经SDS-PAGE电泳显示为单一条带，其分子质量为29.5kDa。对GFAP进行了N端氨基酸序列测定，测定的11个氨基酸序列为VRTQDNAPNGLN。经数据库检索发现，其N末端的11个氨基酸序列与Serine proteianse、hypothetical protein等具有较高的相似性。

实施例5

GFAP体外抗乙型肝炎病毒作用

1.1实验材料

1.1.1细胞株：细胞株2.2.15是将HBV DNA克隆转染人肝癌细胞(HepG2)获得的，由美国Mount Sinai医学中心构建，解放军第302医院药理研究室引进后自行传代培养。该细胞系能转录、翻译HBV基因，并产生HBsAg、HBeAg和Dane颗粒。

1.1.2主要试剂和耗材：灰树花购自浙江方格药业有限公司；干扰素α-2b(IFN)为天津华立达生物工程公司生产的注射用水剂(批号：SA050101)。噻唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)为Sigma产品；DMEM培养基、胰酶、谷氨酰胺、胎牛血清系美国Gibco公司产品。由京科化学试剂公司进口分装。青霉素、链霉素系华北制药厂产品。其他化学试剂均为国产分析纯。DMEM生长液含胎牛血清10％、谷氨酰胺2％、G₄₁₈380.0μg/ml及青霉素、链霉素各100IU/ml，用NaHCO₃溶液调pH值至7.2。DMEM维持液含2％胎牛血清。细胞消化液含0.25％胰酶，用Hanks’液配制。MTT染色液浓度为5mg/ml，用PBS溶液配制。培养瓶、培养板为美国Corning公司产品；微孔滤膜为Millipore公司产品。

HBeAg、HBsAg固相放射免疫检测试剂盒，购自中国原子能研究所。HBV DNA荧光定量PCR检测试剂盒，购自中山大学达安基因股份有限公司。

1.1.3主要实验仪器：二氧化碳孵箱(日本，SANYO公司)；酶联免疫检测仪(奥地利，TECAN公司)；ABI

7000型荧光定量PCR仪(美国，ABI公司)；倒置显微镜BX-41型(日本，Olympus公司)；电子分析天平AE-240(梅特勒-托利多公司)；CG1200γ放射免疫计数仪(中国科技大学中佳光电仪器公司)；

1.2实验方法

1.2.1GFAP的提取工艺及配制

见实施例1

GFAP溶液的配制

实验时称取一定量的GFAP，用灭菌的PBS或DMEM维持液溶解，配成浓度为8.0mg/ml的溶液，使用0.22μm滤膜过滤除菌后备用.

1.2.22.2.15细胞的培养

在长满2.2.15细胞的培养瓶内加适量的0.25％胰酶，37℃消化3分钟，弃去胰酶，加适量生长液吹打成均匀的细胞悬液，1∶3传代，用细胞计数板计数，配制成5×10⁵个/ml细胞悬液后接种培养瓶或培养板，96孔板每孔0.1ml，24孔板每孔1ml。37℃、5％C0₂培养，细胞长至单层后可用于实验。

1.2.3GFAP对2.2.15细胞的毒性实验

1.2.3.1细胞病变法(CPE法)：将GFAP用培养液以2倍稀释至4.00、2.00、1.00、0.50、0.25mg/ml，加入到96孔板细胞孔中，每个浓度6个复孔，第4天更换含有相同GFAP浓度的培养液，设不加GFAP的细胞对照。将IFN用培养液配成浓度为102400.0IU/ml的溶液，以2倍稀释至不同浓度，加入到96孔细胞孔中，实验方法同上。每天在显微镜下观察细胞病变，细胞完全病变为4；75％为3；50％为2；25％为1；无病变为0。计算每个浓度GFAP和IFN对2.2.15细胞的破坏率。

1.2.3.2MTT法：药物与细胞作用第8天弃去上清，余下细胞加入含有5mg/mL MTT的培养液，37℃、5％CO₂孵育4小时，可见黄黑色甲瓒颗粒。弃MTT液，加入100％DMSO，每孔0.1ml，用酶联免疫检测仪于492nm处测定吸光度值。按Reed-Meuench法计算各药物的半数有毒浓度。

1.2.4GFAP对2.2.15细胞分泌HBeAg、HBsAg和HBV DNA的影响

将2.2.15细胞3×10⁵个/ml接种24孔板，每孔1ml，置于37℃、5％CO₂培养。根据药物毒性实验结果，以GFAP的最大无毒浓度为起始浓度，以2倍稀释至1.00、0.50、0.25、0.13mg/ml，加入24孔板中细胞中。第4天换用含有相同GFAP浓度的培养液。GFAP的每个浓度设3个复孔，同时设不加药的病毒对照。GFAP与细胞作用第8天时收获细胞上清液，马上进行检测或-20℃冷冻保存。

1.2.5HBeAg和HBsAg测定

采用固相放射免疫法检测HBeAg、HBsAg，具体操作按放射免疫检测试剂盒说明书进行，用放射免疫计数仪测定每孔cpm值，3个平行孔取均值后计算GFAP对HBeAg和HBsAg的抑制率。

1.2.6HBV DNA含量的测定

用中山大学达安基因股份有限公司研制的HBV DNA荧光定量PCR试剂盒检测HBV DNA含量，检测方法按试剂盒说明书进行，使用ABI Prism荧光定量PCR扩增仪测定HBV DNA含量。具体检测方法如下：

1.2.6.1HBV-DNA提取：取待测细胞上清液及试剂盒中的对照品各100μl，分别加到0.5ml离心管中；然后加入100μl DNA提取液1，振荡混匀，13000rpm离心10min；弃上清液(离心时注意固定离心管方向、尽可能吸弃上清液且不碰沉淀)；再加入25μl DNA提取液2，振荡混匀，2000rpm离心10s，100℃沸水浴10min，13000rpm离心10min，弃去沉淀，保留上清液备用。

1.2.6.2加样：分别取样本上清液、阴性对照、强阳性对照及阳性工作标准品2μl加入到PCR管中，然后每个PCR管中分别加入一定量的RT-PCR反应液和Taq酶。盖紧管盖后，充分混合均匀。

1.2.6.3RT-PCR反应及结果分析：将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。扩增条件：92℃1min预变性，然后按92℃5s、60℃30s，40个循环。仪器自动以阳性工作标准品拷贝浓度的对数值为横坐标，以实际测得的Cr值为纵坐标绘出标准曲线，仪器软件自动分析出定量结果。采用计算对数平均值的方法来计算HBV DNA平均拷贝数，遇有阴性结果，不参加平均值的统计。3个平行样品取均值，然后计算GFAP对HBV DNA抑制率。

1.2.7GFAP抗乙肝病毒的效果计算

根据药物对HBeAg、HBsAg分泌和HBV DNA的抑制率，计算药物的半数抑制浓度(IC₅₀)和治疗指数(TI)：

1.2.7.1抑制抗原百分率＝[(细胞对照cpm-给药组cpm)/细胞对照cpm]×100％；

1.2.7.2抑制HBV DNA百分率＝[(细胞对照DNA拷贝量-给药组DNA拷贝量)/细胞对照DNA拷贝量]×100％；

1.2.7.3药物的半数抑制浓度(IC₅₀)＝Antilog[logB+C×(50-B的抑制百分数)/(A的抑制百分数-B的抑制百分数)]，A＝＞50％药物浓度B＝＜50％药物浓度，C＝log稀释倍数；

1.2.7.4治疗指数TI＝TC₅₀/IC₅₀。TI可以用于评价药物临床应用前景。TI＞2为有效低毒，1＜TI＜2为低效有毒，TI＜1为有毒性作用。

1.2.8GFAP对HBsAg与抗HBs抗体结合的抑制实验

将不同浓度的GFAP与等体积纯化的HBsAg混合作为待测样品，设阴性(无纯化HBsAg)和阳性(无GFAP)对照，用固相放免试剂盒测定样品中HBsAg含量，计算GFAP对HBsAg与抗HBs抗体结合的抑制率。GFAP抑制它们结合的百分率＝[(阳性组cpm-实验组cpm)/(阳性组cpm-阴性组cpm)]×100％。

1.2.9统计学处理

各组数据均以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS10.0统计分析软件，以方差分析法计算各实验组的HBeAg、HBsAg、HBV DNA和对照组间的差别。

1.3.实验结果

1.3.1GFAP对2.2.15细胞的毒性

每天观察细胞病变，在接种2.2.15细胞第6天，8.0mg/ml GFAP处理的细胞开始明显病变。病变细胞形态略有肿胀，脱落。加入MTT液和DMSO溶解甲瓒颗粒后，测OD₄₉₂值，并分别计算GFAP对2.2.15细胞的TC₅₀和TC₀(见图3)。使用CPE法和MTT法测定GFAP对2.2.15细胞的TC₅₀分别为5.56mg/ml和5.07mg/ml，平均值为5.37±1.59mg/ml，TC₀为2.00±0.90mg/ml。使用MTT法测定IFN对2.2.15细胞的TC₅₀为83753.5IU/ml。

1.3.2GFAP对2.2.15细胞HBeAg分泌的抑制作用

采用2.2.15细胞在24孔板培养系统中实验证明：GFAP对HBeAg表达有明显的抑制作用(见图4)。GFAP 2.00、1.00、0.50、0.25和0.13mg/ml 5个剂量组分别加入2.2.15细胞中培养，第8天对细胞上清液HBeAg的抑制率(inhibition)分别为55.8％、55.3％、44.1％、23.5％和22.7％。GFAP对HBeAg的抑制作用与剂量呈依赖性。GFAP抑制HBeAg的IC₅₀和TI分别为0.77mg/ml和7.0。12800.0IU/ml IFN对HBeAg的抑制率为26.3％.因为IFN最大无毒浓度对HBeAg的抑制率没有超过50％，故不能统计IFN对HBeAg的IC₅₀。GFAP对HBeAg的抑制率与IFN相比差异非常显著(P＜0.01)，这表明GFAP对HBeAg的抑制作用明显强于IFN。

1.3.3GFAP对2.2.15细胞HBsAg分泌的抑制作用

采用2.2.15细胞系在24孔板培养系统实验证明：GFAP对HBsAg表达有一定的抑制作用(表4)。GFAP 2.00、1.00、0.50、0.25和0.13mg/ml 5个剂量组加入到2.2.15细胞中，第8天对细胞上清液HBsAg的抑制率分别为28.1％、27.4％、27.2％、22.8％和15.9％。不能统计GFAP和IFN对HBsAg的IC₅₀。经方差分析，0.13mg/ml GFAP对HBsAg的抑制作用与12800.0IU/ml IFN统计学上差异无显著性，作用效果相当。

表4GFAP对2.2.15细胞HBsAg表达的抑制作用(n＝3，x±s)

Tab.4 Inhibitory effect of GFAP on the expression of HBsAg in 2.2.15

1.3.4GFAP对2.2.15细胞中HBV DNA的抑制作用

使用用荧光定量PCR检测试剂盒检测各药物处理组和细胞对照孔上清液中HBV DNA含量。GFAP 2.00、1.00、0.50、0.25和0.13mg/ml 5剂量组处理2.2.15细胞，第8天对HBV DNA的抑制率(inhibition)分别为73.8％、66.4％、45.0％、20.0％和3.3％(图5)。GFAP对HBV DNA的抑制作用与剂量呈依赖性。GFAP抑制HBV DNA的IC₅₀和TI分别为0.59mg/ml和9.1。IFN 3200、1600和800IU/ml各剂量组对HBV DNA的抑制率分别为93.3％、56.5％和23.0％。IFN抑制HBV DNA的IC₅₀和TI分别为1398.7IU/ml和59.9。

1.3.5GFAP对HBsAg与抗HBs抗体结合的抑制作用

用GFAP与HBsAg混合物作为待测样品，用放射免疫法测定样品中HBsAg含量，借此观察GFAP对HBsAg与抗HBs抗体结合的抑制作用。2.00mg/ml GFAP对HBsAg与抗HBs抗体结合的抑制率(inhibition)为48.8％(图6)。结果表明：GFAP对HBsAg与抗HBs抗体结合有一定的抑制作用。GFAP对它们结合的抑制作用，有助于阻断HBV吸附宿主细胞。

1.4讨论

转染细胞株2.2.15是美国Sells等利用电穿孔基因转移技术将HBV DNA导入人肝癌细胞株HepG₂中获得的，该细胞株能够长期、稳定地表达HBV的全部病毒标志，包括HBV DNA、HBsAg、HBeAg、HBcAg、DNA多聚酶，并从转染细胞系的培养上清中及细胞裂解物中证实了HBV Dane颗粒的存在(图1-5)。近十余年来已成功应用于抗HBV药物的筛选，是目前各实验室广泛应用于筛选和评价体外抗HBV药物较好的细胞模型，被中国卫生部收载于治疗肝炎的中药新药研究指南^[26]。因此，我们选用2.2.15细胞株作为乙肝病毒的模型。

HBV持续感染会导致肝硬化和原发性肝细胞癌变等肝脏疾病，是严重危害人类健康的疾病。目前认为，乙型肝炎的发病机制复杂，除与病毒的直接感染有关外，还与机体的免疫应答失调有关。由于有乙肝病毒自身免疫的参与，现有的治疗乙肝的药物疗效均不十分满意，因此，抗乙型肝炎天然药物的筛选与研究被重新高度重视，如珍珠草、苦参碱、香菇多糖和猪苓多糖等。

某些真菌(如香菇、灵芝等)具有很高的药用价值，并已开发成为药物。灰树花具有抗肿瘤、降低高血压、治疗肝病和改善高血脂等多种药理作用^[11-14]。1984年Nanba从灰树花的子实体和菌丝体中提取到GFAP。GFAP主要成分是β-葡聚糖，含有少量的蛋白质。与其他蘑菇类抗癌药相比，灰树花D组分具有口服有效、抗癌效果好等优点。1998年美国药物管理局批准其用于治疗第三、四期乳腺癌和前列腺癌。

Kruining等报道重组IFN2α2500U/ml对HBV DNA的抑制率＜20％，而不抑制HBsAg及HBeAg的表达，但Hagelstein等^[28]报道2.2.15细胞在20％～90％融合状态下，IFN2α可降低HBsAg 60％。我们测定IFNα-2b抑制HBV DNA的IC₅₀为1398.7IU/ml，TC₅₀为83753.2IU/ml。IFN 12800.0IU/ml对HBeAg和HBsAg的抑制率分别为26.3％和9.2％。IFN2α对HBsAg及HBeAg是否有抑制活性，各家的结果矛盾，这可能与各实验室实验条件不同有关。

本研究从灰树花中提取分离到了GFAP，其多糖含量约为65％，蛋白含量约为27％。采用2.2.15细胞抑制实验评价了GFAP抗病毒活性。通过本研究发现：它对2.2.15细胞的半数有毒浓度平均为5.37±1.59mg/ml，最大无毒浓度为2.00mg/ml。它抑制HBeAg和HBV DNA的IC₅₀分别为0.77mg/ml和0.59mg/ml，治疗指数分别为7.0和9.1；2.00mg/mlGFAP对HBsAg的抑制率为28.1％。结果表明：GFAP在2.2.15细胞中对HBeAg、HBsAg及HBV DNA有抑制作用，说明GFAP在体外有明显地抗乙肝病毒作用。

以前研究表明：GFAP抑制肝脏线粒体膜的氧化损伤，防止和延缓肝纤维化，降低肝炎或肝损伤而引起的血液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶浓度，通过保肝降酶作用起到间接抗乙型肝炎病毒。我们研究发现，GFAP能够直接抗乙型肝炎病毒^[30]。因此，我们认为灰树花这一有效提取成分有可能成为新的抗乙肝药物，对乙型肝炎的治疗具有重大的意义。但是，由于利用细胞株进行药物体外筛选存在着一定的局限性，结果受多种因素影响。因此，实验结果有待进一步进行体内实验来确定评价。

1.5小结

GFAP对2.2.15细胞的TC₅₀为5.37mg/ml，TC₀为2.00mg/ml；其抑制HBeAg和HBV DNA的IC₅₀分别为0.77mg/ml和0.59mg/ml，其TI分别为7.0和9.1；GFAP 2.00mg/ml对HBsAg的抑制率为28.1％。IFNα-2b抑制HBV DNA的IC₅₀和TI分别为1398.7IU/ml和59.9；12800.0IU/ml IFNα-2b对HBeAg和HBsAg的抑制率分别为26.3％和19.2％。GFAP对HBeAg的抑制作用与IFN相比差异非常显著(P＜0.01)；1.00mg/ml GFAP对HBV DNA的抑制率与1600IU/ml IFN的抑制率差异没有显著性(P＞0.05)。GFAP对HBeAg的抑制作用比IFN明显，而对HBV DNA的抑制作用与IFN相当。我们上述研究结果，证实了GFAP在体外细胞培养系统中抗乙型肝炎病毒作用，迄今国内外文献尚无报道。

实施例6

将本发明的一种灰树花抗病毒蛋白质按常规方法制成病人可接受的剂型，用于单纯疱疹病毒1型、乙型肝炎病毒性疾病的治疗。

Claims (5)

1.一种灰树花抗病毒蛋白质，其特征是用下述方法提取：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶1-15的比例加入70-90℃的水浸泡5-15小时后离心；

(2)上清液加入1-3体积倍的体积百分比浓度为60％-90％的乙醇水溶液，在2-6℃，放置8-16小时后离心；

(3)沉淀加入1-3质量倍的乙酸，在2-6℃，放置1-3小时后离心；

(4)沉淀加入1-3质量倍的质量百分比浓度为4％-10％的氢氧化钠水溶液，2-6℃，放置1-3小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，在2-6℃，放置8-16小时后离心；

(6)沉淀加入1-3质量倍的重蒸馏水，透析8-16小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.1mol/L-0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

2.根据权利要求1所述的一种灰树花抗病毒蛋白质，其特征是所述提取方法是：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小时后离心；

(2)上清液加入2体积倍的体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小时后离心；

(3)沉淀加入2质量倍的乙酸，在4℃，放置2小时后离心；

(4)沉淀加入2质量倍的质量百分比浓度为6％的氢氧化钠水溶液，4℃，放置2小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，在4℃，放置12小时后离心；

(6)沉淀加入2质量倍的重蒸馏水，透析12小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.2mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

3.一种灰树花抗病毒蛋白质的提取方法，其特征是包括如下步骤：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶1-15的比例加入70-90℃的水浸泡5-15小时后离心；

(2)上清液加入1-3体积倍的体积百分比浓度为60％-90％的乙醇水溶液，在2-6℃，放置8-16小时后离心；

(3)沉淀加入1-3质量倍的乙酸，在2-6℃，放置1-3小时后离心；

(4)沉淀加入1-3质量倍的质量百分比浓度为4％-10％的氢氧化钠水溶液，2-6℃，放置1-3小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，在2-6℃，放置8-16小时后离心；

(6)沉淀加入1-3质量倍的重蒸馏水，透析8-16小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.1mol/L-0.3mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

4.根据权利要求3所述的一种灰树花抗病毒蛋白质的提取方法，其特征是所述步骤是：

(1)将灰树花子实体粉末按质量比1∶3的比例加入80℃的水浸泡10小时后离心；

(2)上清液加入2体积倍的体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液，在4℃，放置12小时后离心；

(3)沉淀加入2质量倍的乙酸，在4℃，放置2小时后离心；

(4)沉淀加入2质量倍的质量百分比浓度为6％的氢氧化钠水溶液，4℃，放置2小时后离心；

(5)上清液加硫酸铵至饱和度为40％，在4℃，放置12小时后离心；

(6)沉淀加入2质量倍的重蒸馏水，透析12小时；

(7)沉淀经阴离子交换柱分离，用0.2mol/L的氯化钠水溶液洗脱得到灰树花抗病毒蛋白质。

5.权利要求1或2所述的灰树花抗病毒蛋白质在制备抗HSV-1或HBV的药物中的应用。

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