CN101244263A - 包含混合干扰素-α亚型的混合物 - Google Patents

Abstract

本文公开了由人淋巴母细胞产生的人干扰素－α(IFN－α)亚型的混合物。这些纯化的IFN－α混合物包含更高的特异活性并且可以应用于治疗癌症、病毒、和免疫疾病。

Description

包含混合干扰素-α亚型的混合物

技术领域

本发明系有关一种分离的蛋白质组成，此种混合物为人类的淋巴母细胞所产生的人类干扰素-α。

背景技术

人类的干扰素主要有三种分类，分别为干扰素-α，干扰素-β及干扰素-γ。在这几种亚型中，干扰素-α被认为是治疗癌症最有效的。人类干扰素-α是由最少13个位于人类第九号染色体上的基因所组成。干扰素-α的各亚型之间有78％至95％的胺基酸相似(Henco，et al.，1985；Diaz，et al.，1996)。其中某些干扰素-α蛋白质有抗病毒、抗生长及免疫调节的功能。举例来说，有11种的干扰素-α亚型从被仙台病毒(Sendai virus)刺激的淋巴细胞培养基中被分离出来。每一种干扰素-α蛋白质由165或166个胺基酸所组成，分子量从18到27千道尔顿(kDa)，依据醣化(glycosylation)程度及干扰素种类而有所差异(Tolo，et al.，2001；Nyman，et al.，1998；Zoon，et al.，1992。

人类干扰素-α在人类的疾病像是癌症以及病毒的感染治疗效果已经被确定了。例如，从白血球细胞分离出来的包含各种亚型的干扰素-α在临床试验上被用来治疗病毒感染(Stewart，et al.，1980)。此外，美国专利号5,503,828及5,676,942有从白血球细胞株生产的治疗用的人类干扰素-α。在参考文献中有提及美国专利号5,503,828及5,676,942。

重组干扰素(IFN-α2a，IFNα2b)已经被用来治疗尖疣(Condylomaacuminate)、B型及C型肝炎(hepatitis B and C)、与艾滋病(AIDS)有关的卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、以及回复多种的恶性肿瘤。重组干扰素单独或是配合其它抗病毒的药物的SARS临床试验，目前也在进行中(Ciantl，etal.，2003；Stroher，et al.，2004)。

重组干扰素用基因工程的技术以培养大肠杆菌(E.Coli)的方式生产。干扰素-α2特别被用来作为当作产品，像是Schering Plough的INTRONATM(干扰素-α2b)及Hoffman-La Roche的ROFERON ATM(干扰素-α2a)。然而，重组干扰素只有一种人类的亚型组成，而且在生物体内并没有经过后转译(post-translationally)的修饰或修改。因为重组干扰素并不是由人类细胞生产的，所以并没有经过醣化的程序，而且其生物的活性可能会有限。

从人类细胞分离出来的干扰素比重组干扰素有更佳的治疗效果。例如，从白血球细胞株取得的干扰素-α在治疗疣(Condyloma)上，可以比重组干扰素低四倍的剂量。

人类天然干扰素-α亚型的组合也比单一亚型重组干扰素在治疗上有更好的效果。例如，以天然人类细胞产生的混合干扰素清除B型肝炎病毒(hepatitis B virus)，就比重组干扰素的效果好(Lin，et al.，2004)。

天然人类干扰素的来源包括淋巴母细胞(lynphoblastoid)、白血球细胞(leukocyte)、Namalwa细胞、以及外围白血球细胞株(peripheral bloodleukocyte cell lines)。从这些细胞株取得的干扰素-α可以被当作是人类天然干扰素。每一种天然人类干扰素都包含至少一种干扰素-α亚型，每一种亚型都有因为细胞种类、变异性及后转译过程而独特的结构及生物活性。

有越来越多的干扰素-α被使用在各种疾病的病人以及临床试验上。然而，它们都有一些副作用。副作用包括类感冒的症状像是发烧、低红血球或是肠胃道的不适像是呕吐或腹泻、肾脏的不适、肺部的不适、过敏的反应像是支气管痉挛、过敏性反应或皮肤疹、掉头发以及感染。这些副作用在市售干扰素-α的包装内说明书中都有说明。

在一些治疗上，如果使用剂量较大，这些副作用就会有严重的影响。为了达到有效的剂量，有些病人必须使用大的剂量或是持续使用很长一段时间。有时候这些因为大剂量造成的副作用比疾病本身的影响还大。

因此，病人对于天然人类干扰素以及生产天然人类干扰素混合物及组合物有需求，因为其毒性低、活性高而且有最小的副作用。

发明内容

由人类淋巴母细胞生产取得的天然人类干扰素-α，此干扰素-α在用来治疗和病毒有关的疾病上有较佳的活性和较佳的抗病毒能力。本发明中其中一个实施例，从淋巴母细胞纯化取得的天然人类干扰素-α有最少一个亚型，其分子量介于19到27千道尔顿(kDa)之间，而且其抗病毒的活性大于92MIU/mg。在一个实施例中，从淋巴母细胞纯化取得的天然人类干扰素-α有IFN-α2、IFN-α2b、IFN-α2c、IFN-α4、IFN-α7、IFN-α8、IFN-α10、IFN-α16、IFN-α17、IFN-α21及其复合物。更进一步的，由人类淋巴母细胞生产取得的天然人类干扰素-α混合物包含IFN-α2和IFN-α8，IFN-α10和IFN-α8以及IFN-α17和IFN-α8。

从另一个观点，一个混合物包含IFN-α8，这里的IFN-α8是指从淋巴母细胞株纯化取得的，此混合物可以最少包含干扰素-α的一种亚型包括IFN-α2、IFN-α2b、IFN-α2c、IFN-α4、IFN-α7、IFN-α8、IFN-α10、IFN-α16、IFN-α17、IFN-α21。

更进一步的，有关从淋巴母细胞纯化取得天然人类干扰素-α的方法描述于淋巴母细胞的培养、以亲和性管柱从培养基中分离出干扰素-α、以及以逆相高压液态(reverse-phase high-pressure liquid)管柱将干扰素-α各亚型分离。天然的干扰素-α可以从淋巴母细胞，Namalwa细胞或更明确的，从智人B淋巴细胞(Homo sapiens B lymphocyte(Namalwa))DB009，保藏编号BCRC960246，寄存日期Nov.4，2005纯化取得。

本发明其中一个观点，一个药用的混合物包含上述的天然人类干扰素-α各亚型或是由上述的方法所纯化出的天然人类干扰素-α各亚型。有较佳抗病毒活性的干扰素-α的剂型有可能是以下几种剂型：注射用液体、重新溶解的注射用粉末、胶囊、锭剂、膏、口服液、糖浆、吸入型粉末或是治疗用的乳胶。

上述的混合物可以被用在哺乳动物的病毒感染、细菌感染、真菌感染以及癌症。上述的混合物有可能包含单一种干扰素-α亚型或是混合的干扰素-α亚型。此混合物有可能更进一步包含抗病毒、抗细菌、抗真菌还有抗癌症的药物、蛋白质或核苷酸。

发明详述

“干扰素”一词于此处是指一群经由各种刺激物质，例如病毒、细菌、真菌、寄生虫、种疡及其它抗原刺激细胞后所产生之可溶性热稳定之低分子量醣蛋白。

“第一类”干扰素是由12个亚型之干扰素-α，干扰素-β及干扰素-ω组成。第一类干扰素主要是由病毒刺激淋巴母细胞(lymphoblastoid)或Namalwa细胞所生成。各种亚型的干扰素主要是由病毒感染、细菌感染或是双股RNA刺激包括白血球细胞、淋巴母细胞、Namalwa细胞、纤维母细胞(fibroblasts)及其它种类细胞而产生。

”干扰素-α”或是”IFN-α”是指经由人类第9号短染色体的14个不同基因所表现的各亚型干扰素α之泛称。”IFN-2A”与”IFN-2B”是藉由基因重组技术所生产之干扰素，其主要是用于癌症治疗。

抗病毒活性是指抵抗病毒感染的能力。此处抗病毒活性是利用WISH细胞与encephalomyocarditis病毒(EMCV)系统来进行评估。简述如下，于含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，将104个WISH细胞接种于96孔细胞培养盘的每个孔中，并且静置6小时。而后将经过两倍序列稀释之标准品IFN-α(浓度分别为500、250、125、62.5、31.3、和15.6IU/ml)及待测样品(浓度稀释制约200IU/ml附近)加入适当安排之细胞培养盘各孔中静置过夜(16小时)。这些细胞在藉由添加EMCV来进行感染直到未添加IFN-α之细胞有75-95％有明显之细胞病变(cytopathic effect，CPE)发生。细胞培养盘之各孔中的活细胞数则是利用XTT细胞增值侦测试剂组(“CELLPROLIFERATION KIT II(XTT)TM”；ROCHE DIAGNOSTICSTM；Cat.No.11-465-015-001)来进行测量。待测样品的抗病毒活性则是以内插法计算出其相对于标准曲线的何性数值在乘以其稀释倍数。

“分离(isolated)”一词于此处是指将一个核酸或是蛋白质由它所处之天然环境移除。一个蛋白质分离的实施例便是在没有经过其它更多的处理程序，而只是利用多株抗体将特定蛋白质由细胞培养液中移除的步骤。另外利用盐析处理(salt-out protein preparations)、分子大小筛选处理(sizefractioned preparation)、亲和性吸附处理(affinity-absorbed preparations)等类似技术均包含在内。“分离”这个名词主要是指一个蛋白质再经过一定程序处理后其相对于其它蛋白质的浓度不超过50％。

“纯化(purified)”一词于此处是指将核酸或是蛋白质由它所处之天然环境中分离(separate)出来，使其相对于其它共存之核酸或是蛋白质的浓度不小于95％。此处蛋白质浓度的分析是利用一维SDS page电泳及银染(silverstain)来判定。而核酸的浓度则是以琼脂(agarose gel)电泳与EtBr染色判定。

“大致上纯化(substantially isolated)”一词于此处是指将核酸或是蛋白质由它所处之天然环境中分离(separate)出来，使其相对于其它共存之核酸或是蛋白质的浓度不小于75％。而纯度为80、85、或是90％均可包含于其中。

“核酸(nucleic acid)”或是“核酸序列(nucleic acid sequence)”一词于此处是指单股或是双股的聚核苷酸(polynucleotides)，包括gDNA、cDNA、或RNA。此一名词同时也包括月生肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、或是任何DNA或是RNA的化学类似物质。“cDNA”是指由细胞中的mRNA转译而成之DNA。“gDNA”是指genomic DNA。

“片段(fragments)”是指仍然保有抗原性、部分结构(structural domains)、或是完整蛋白质酵素活性的聚合月生肽(或是含有此段聚合月生肽密码的核酸序列)。”酵素活性(enzymatic activity)”于IFN-α上是指其抗病毒、抗肿瘤与免疫调节活性，此会影响细胞的代谢、生长与分化。“部分结构(structural domains)”是包括干扰素a/b domain(包含omega与tau)。螺旋(helices)A与C亦包含于第一型干扰素家族的部分结构。

干扰素聚合月生肽“差异(variant)”一词是指，干扰素氨基酸序列中一个或多个氨基酸差异。这些差异可能是天然发生或是人工造成的改变。一般的差异包括与相似蛋白质的“固定(conservative)”改变、断裂(truncations)、部分结构(domain)移动或是交换。决定哪一个氨基酸的改变(取代、插入、删除)不会影响原蛋白质的生物与免疫活性的预测可采用一般已知的计算机软件，例如LASERGENETM软件，来与许多已知差异的IFN-α1基因比较。

“自然发生差异(naturally occurring variant)”一词包括在人类中所发现自然发生变化的蛋白质对偶基因(alleles)。这些自然的对偶基因差异包括点(point)差异、接合(splice)差异及其它自然发生之差异。

“高度临界(high stringency)”是指以0.2倍SSC、0.1％SDS于65℃进行清洗。“中度临界(medium stringency)”是指以0.2倍SSC、0.1％SDS于55℃进行清洗。

于计算“相似度百分比(％identity)”时，未能并排比较的询问(query)序列尾部序列不计入计算中。相似度的计算是针对参考序列全长的部分进行计算，因此小区域询问的序列的配对并没有重大意义。(％identity＝询问序列中的配对数目/参考序列全长数目)。配对是利用BLAST homologyalignment方式进行，此一方法见于Fatusova TA&MaddenTL(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174：247-250.除非过滤器被关闭，否则内定参数会被使用。2001年1月1日的内定参数为：BLASTN or BLASTP as appropriate；Matrix＝none for BLASTN，BLOSUM62 for BLASTP；G Cost to open gap default＝5 for nucleotides，11 for proteins；E Cost t extend gap[Integer]default＝2 fornucleotides，1 for proteins；q Penalty for nucleotide mismatch[Integer]default＝-3；r reward for nucleotide match[Integer]default＝1；e except value[Real]default＝10；W wordsize[Integer]default＝11 for nucleotides，3 for proteins；y Dropoff(X)for blast extensions in bits(default if zero)default＝20 forblastn，7 for other programs；X dropoff value for gapped alignment(in bits)30for blastn，15 for other programs；Z final X dropoff value for gapped alignment(in bits)50 for blastn，25 for other programs.此一应用软件可于在线使用www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

天然干扰素-α拥有基因重组干扰素-α所没有的多种亚型组合。因此淋巴母细胞生产之天然干扰素-α的产量虽然没有基因重组干扰素-α的产量高，但是天然干扰素-α对于抗病毒复制及防止恶性肿瘤扩散的活性与专一性均较基因重组干扰素-α要高。

表一显示天然干扰素-α各亚型氨基酸数目

表一干扰素氨基酸参考序列

^*Reference squences from GenBank^TM are presented as examples of the natural variation in interferons.

本发明包括人类淋巴母细胞所生产之天然干扰素-α各亚型混合物与其间之相对组成量。此处生产用之人类淋巴母细胞株有较其它人类淋巴母细胞株高2倍的天然干扰素-α产量(US 6,159,712和US 6,489,144)。

由于此一生产用细胞株拥有高的细胞激素产量，因此可以预期藉由本发明能够降低天然干扰素-α的生产制造及临床研究成本。本发明中的天然干扰素-α组成成分包括单一干扰素α亚型或是由一定比例之各亚型组成。本发明之天然干扰素-α各亚型组成比例可以单独用于当成治疗病毒感染或是癌症的药物。另外此一天然干扰素-α各亚型组成亦可与已知之抗病毒或是抗肿瘤药物并用以增加其效能或减低使用剂量。这些减低剂量之已知抗病毒蛋白质或是化学药物可以藉由剂量减低之因素而降低其副作用的严重性。此一天然干扰素-α组成发明可应用于各种剂型以达到最佳治疗效果，这些剂型包括(但不限于)：注射溶液、可以复水(reconstitution)之注射用粉末、胶囊、药片、软膏、口服溶液、糖浆、鼻腔吸食粉末、或是乳胶(emulsions)。

本发明---抗病毒活性试验的特点是提供IFN-α能提供高抗病毒活性，”高抗病毒活性”的意思是这个IFN-α抗病毒合成(成分)的发明，比起大家熟知的IFN-α亚型(subtype)混合物或是商业用IFN-α2产品，比方说RoferonA，具有更大的抗病毒活性。本发明IFN-α的成分可以单独使用在抗病毒制药的成分上，或是添加在现有的抗病毒制药去增加抗病毒效用和减少使用抗病的的剂量。本发明的成分和自然产生的纯净干扰素合剂(purifiedinterferon mixtures)不同，它们是由美国专利管理的细胞激素调节因子大量表现细胞，从人类的淋巴细胞中制造的(U.S.Pat.No.6,159,712 and6,489,144)。本发明IFN-α的成分可以用在单一亚型(subtype)里，例如IFN-α8，或是IFN-α2和IFN-α8的混合物中。单一亚型(subtype)的存在，不单说明本发明的合成(成分)在制药成分的总重中含有单一IFN-α亚型(subtype)蛋白质。在本发明里单一亚型(subtype)的存在，也可能是合成物由超过一种的IFN-α亚型组成的---从IFN-α2，IFN-α4，IFN-α7，IFN-α8，IFN-α10，IFN-α16，IFN-α17的群体中挑选组合而成。此挑选的IFN-α亚型合成物，尤其使用在目前的发明，可以从他们的安基酸的排列，分子重量，功能和抗原，来界定本发明的成果为IFN-α的亚型，是从人类IFN-α亚型的单纯混合物独立出来，产生自人类的淋巴细胞。

此IFN-α有助抗病毒合成的发明在于从IFN-α2，IFN-α4，IFN-α7，IFN-α8，IFN-α10，IFN-α16，IFN-α17的群体构成中挑选出至少一种成分。本发明的其中一项成果是抗病毒成分包含IFN-α8。另一项发明的成果包含至少一个IFN-α8和一个IFN-α2。此外另一个本发明的成果包含一个IFN-α8和一个或是多个IFN-α蛋白质从IFN-α4，IFN-α7，IFN-α10，IFN-α16，IFN-α17，IFN-α21中挑选出来的结合体。以上说明了一个或是任何IFN-α成分(合成)的结合，可能提供制药成分合成最少包含了IFN-α8。

本发明说明纯化IFN-α亚型(subtye)和IFN-α经由逆相高压液相色谱法(RP-HPLC)分析是公开和描述在第一个实施例。此亚型(subtype)稍微不同疏水性，可以被一个逆相高压液相色谱法(RP_HPLC)圆柱分离，而此亚型可以被有机溶剂洗涤。RP_HPLC圆柱对IFN-α有效的是C4，C8，C18，而最有效的是C4。这种RP_HPLC使用的有机溶剂含有甲醇乙醇或是乙睛(Acetonitrile)。本发明的一个成果就是，可能会从40到50％的乙睛也可能从47.5到49.3％乙睛中洗脱。在此溶剂中三氟醋酸(TFA)剂量比例可能是0.5％-2.0％也可能是1.0％到2.0％。

本发明里的IFN-α合成物的物理和化学特性判断，已经在第二到第六个实施例里说明过。举例来说，分离的IFN-α亚型分子的重量是由聚合丙烯醯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来决定的，而IFN-α分子的表面重量是介在16-27(kilodaltons)左右。西方墨点法(Western Blot)分析IFN-α蛋白质在逐渐减少的条件下说明纯化的蛋白质群是人类的干扰素。这个纯化的IFN-α合成(成分)来自个别的亚型(subtype)及IFN-α的混合物本发明的好处同时被聚合丙烯醯胺凝胶电泳(SDS_PAGE)评鉴和西方墨点法(Western Blot)制造，在以下的第四个实施例有更详细的讨论。

在第3个实施例详细的说明利用电喷雾四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)分析IFN-α亚型的特性。这个结果显示至少八种亚型IFN-α被净化包含IFN-α2，IFN-α4，IFN-α7，IFN-α8，IFN-α10，IFN-α16，IFN-α17，IFN-α21。

实施例6利用人的上皮细胞(WISH)抵御脑心肌炎病毒(EMCV)的效果来描述IFN-α在个别或特定比例亚型(subtype)的抗病毒活性.在这测量过程中的干扰素单位在50％的结束点被定义为倒数的稀释已调整适应NIH参考标准(镓23-902-532).IFN-α的抗病毒特定活性为92到1268MIU/mgIFN.IFN-α的数量是利用商业酵素连结免疫吸附分析法(ELISA)(PBL，USA)测量而得.在1∶1摩尔分子量的比率方面IFN-α8有比较高的抗病毒活性，大约618MIU/mg IFN，这已经被证明与在这项发明过程中的其它组成相比。这上述的组成与商业IFN-α2产品，Roferon A相比较有更高的抗病毒活性一如实施例6所描述。

附图说明

图1显示已纯化IFN-α亚型(subtypes)的逆相高压液相色谱法(RP-HPLC)分析图；

图2显示逆相高压液相色谱法(RP-HPLC)洗脱峰(Elution peaks)的聚合丙烯醯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；

图3显示逆相高压液相色谱法(RP-HPLC)洗脱峰(Elution peaks)在使用LT-295单株抗体的西方墨点法(Western Blot)分析图；

图4显示IFN-α氨基酸序列的多序列比较。

具体实施方式

本发明提供组成的人类IFN-α混合物以人类的淋巴细胞生产，而它是细胞激素调节因子能大量表现的细胞。它可生产比其它人淋巴细胞至少2倍大量的人IFN-α混合物(U.S.Pat.No.6,159,712 and 6,489,144)。在治疗病毒传染病、细菌的传染病、真菌的传染病或者癌症上，单一IFN-α亚型或由特定比例组成的IFN-α亚型有更高的抗病毒活性。IFN-α亚型的组成成分可以被利用在医药辅料手册内所描述的医药公式，包括：注射溶剂，药粉再制作，胶囊，药片，药膏，口服溶剂，糖浆，吸入粉或者治疗的目的的乳剂。

下列更进一步的实施例说明那些分离和描述IFN-α组成的那些发明。这些实施例不打算限制发明在任何方法。

实施例1：淋巴细胞生长

Namalwa延伸的淋巴细胞株，DB009，被在这个实施例里使用。细胞利用由Pro293(Cambrex，MD，U.S.A.)，L-glutamine和MAXI-MAb(GTEC，CA，U.S.A.)组成的GM-11培养液培养。当细胞生长到1.5×106或2.0×106cells/ml时，利用相同的培养液稀释至浓度5×105cells/ml。

当细胞生长到需求浓度(大约3.5-5.0×106cells/ml)时，细胞使用priming试剂处理并且在37℃下培养24小时。然后将Sendai病毒加入培养液中(滴定浓度为100HA/106cells)并且在低温(大约30-36℃)的环境下培养一段时间。培养液使用下述的方式与DB009细胞分离。

试验二：纯化干扰素α

除了有特别说明的步骤外所有纯化步骤都在室温中进行。

A.粗培养液制程

在大约48小时的仙台病毒诱导后，DB009细胞液以5微米和0.22微米孔径的过滤器过滤并收集。为了后续的制程，过滤后的细胞培养液装于灭过菌的容器并储存于4℃中。

B.亲和性管柱纯化

人类干扰素α以亲和性层析方式纯化。先将一筛选过的单株抗体接合在已活化的CNBr Sepharose-4B上并保存于4℃中。每毫升的亲和性胶(内含2毫克的已接合单株抗体)可以加入约0.2毫克粗人类阿法干扰素过滤培养液。而干扰素α的量由ELISA确定。亲合性管柱在使用前须从4℃中取出并置于室温中回温，并以磷酸盐缓冲液(PBS)平衡管柱。在样品全部进入管柱后先以五倍管柱体积含0.1％的吐恩80的磷酸盐缓冲液清洗管柱，接着以二十倍管柱体积含0.2M氯化钾的磷酸盐缓冲液清洗管柱。再以五倍管柱体积磷酸盐缓冲液清洗管柱。最后以50mM的柠檬酸缓冲液(内含0.3M氯化钠)(pH2.0)冲提管柱中的干扰素α下来。

C.酸处理和pH滴定

将从单株抗体亲合性管柱冲提下来的干扰素αα溶液(约pH2.0)放置于4℃中培养16～20小时。此酸培养步骤是为了可使仙台病毒失去活性。酸培养步骤后，为了接续的纯化制程，将干扰素α溶液以25mM醋酸钠缓冲液(内含0.05％ZWITTERGENT)(pH4.0)稀释五倍并在混合后pH直接近4.0。

D.SP Sepharose纯化

将稀释的干扰素α溶液加入内含SP SEPHAROSE胶体的管柱中。加入后先以二十倍管柱体积的缓冲液A(内含25mM醋酸钠，0.05％ZWITTERGENT，pH4.0)清洗管柱，再以以三十倍管柱体积的80％缓冲液A和20％缓冲液B(内含25mM醋酸钠，0.05％ZWITTERGENT，1M氯化钠pH4.0)混合液清洗管柱。接着以50％缓冲液A和50％缓冲液B的混合液冲提管柱中结合的阿法干扰素。最后以十倍管柱体积缓冲液B冲洗管柱，移除未被冲洗出的干扰素α残基。

E.G25除盐管柱和奈米过滤

先以300毫升的剂型缓冲液(内含10mM Tris，10mM苷氨酸和145mM氯化钠，pH7.0)平衡SEPHADEX G25管柱。将SP SEPHAROSE冲提下的干扰素α溶液加入到SEPHADEX G25管柱中，再以剂型缓冲液冲洗管柱。含有干扰素α的萃取液以无菌方式收集。最后，为了有效率的移除病毒的残基，将已纯化的干扰素α溶液以35奈米孔径中空纤维过滤组(PLANOVA 35N)过滤，过滤液储存于4℃。

试验三：RP-HPLC分离干扰素α各亚型

基于干扰素α各亚型间的疏水性不同，可用RP-HPLC进行分离。分离的原理是采用拉乙腈(acetonitrile)浓度梯度的方式。干扰素α的RP-HPLC分离图谱(附图一)是采用15～20微克的已纯化干扰素α，加入到分析级的”Protein C4”管柱(5微米/300安培，4.6×250毫米)(GRACEVYDACTM，USA；Cat，No.214TP54)进行分离。而C4RP-HPLC中线性分离梯度是采用表3中的自动缓冲液设定梯度。缓冲液A是100％水中含有0.15％的三氟醋酸，缓冲液B则是100％乙腈中含有0.15％的三氟醋酸。

表三干扰素α的RP-HPLC自动缓冲液设定程序

时间(分钟)	流速(毫升/分钟)	缓冲液A(百分比)	缓冲液B(百分比)
				0	0.18	60	40
30	0.18	60	40
				120	0.18	52.5	47.5
130	0.18	52.5	47.5
				140	0.18	51.7	48.3
150	0.18	51.7	48.3
				162	0.18	50.7	49.3
172	0.18	50.7	49.3
				174	0.18	0	100
224	0.18	0	100

226	0.18	60	40
				256	0.18	60	40

纯化过的干扰素α经过分离后可分成18个波峰来收集，并分别命名为波峰1～18。所有的波峰都分开收集。但为了易于分析，部分波峰收集后再一起合并分析。如附图一中可见，波峰1～10合为一起并重新标示为波峰1’；波峰11和12分别重新标示为2’和3’；波峰13～15合为一起并重新标示为波峰4’；波峰16～17合为一起并重新标示为波峰5’；波峰18重新标示为波峰6’。所有收集的蛋白波峰都以真空干燥机(SPEEDVAC，Savant)冻干便于以后使用。冻干的蛋白如要被用于接下来的分析时将以50mM的磷酸缓冲液(pH7.0)回溶。

试验四：一维电泳SDS-PAGE

附图3以LT-295单株抗体对干扰素α各亚型的专一性所做的西方墨点分析。

SDS-PAGE的分析方法是采用1977年在克里夫兰发表的电泳分析法。将试验一至三中所收集的干扰素α以还原环境下的16％SDS-PAGE分析。以银染方式来观察各蛋白的条带。另外同时以相同的SDS-PAGE作西方墨点法分析，以对干扰素α有免疫反应的单株抗体(源自PBL，USA)进行免疫染色。

从附图二和三中可证实被RP-HPLC分离的波峰中仍有差异性(单一波峰有超过一个以上的蛋白条带)。蛋白的分子量计算是使用跟蛋白分子量标准品比较的方式。分子量标准品(AMERSHAMTM)是由97千道尔顿(kDa)的磷酸化脢b(phosphorylase b)、66千道尔顿的血清蛋白(serum albumin)、45千道尔顿的卵白蛋白(ovalbumin)、30千道尔顿的碳酸氢脢(carbonicanhydrase)、20.1千道尔顿的胰蛋白脢抑制剂(trypsin inhibitor)和14.4千道尔顿的溶菌脢(lysozyme)所组成。由西方墨点法的分析可得知，在还原环境下所有可被银染法染出的蛋白条带都可以被LT-295单株抗体辨识到。这证实所有在SDS-PAGE上被侦测到的蛋白条带(附图二)都是干扰素α的各亚型。另外由西方墨点法的分析纯化过的干扰素α的组成后可得知其中的不纯物低于总蛋白量的百分之一。而接续下来的RP-HPLC分析更是看不到任何不纯物存在波峰中。

实施例五：质谱分析特性

实验数据显示第一收集峰为干扰素-α第二亚型(IFN-α2)，第二收集峰为干扰素-α第四亚型(IFN-α4)，第三收集峰为干扰素-α第十亚型(IFN-α10)，第四收集峰为干扰素-α第八(IFN-α8)及十七亚型(IFN-α17)，第五收集峰为干扰素-α第七亚型(IFN-α7)，第六收集峰为干扰素-α第八亚型(IFN-α8)。其中，第二亚型中分别可能包含2b或2c两种亚型。图四中数据显示，经由上述纯化技术纯化后之干扰素-α中，2b或2c两种亚型可能会同时存在，此两种亚型的差异只在于胺基酸序列中的第三十三个胺基酸位置，其中2c在胺基酸残基序列第34到49间具有蛋白酵素的切位，可利用质谱分析技术测得两者的差异。

表四：以逆向高效能液相层析仪分离之各收集峰亚型鉴定

收集峰	干扰素α亚型
		1’	第二亚型(2c/2b)
2’	第四亚型
		3’	第十亚型
4’	第十七亚型与第八亚型(微量)
		5’	第七亚型
6’	第八亚型

实施例六：抗病毒活性分析

建立以WISH cell及EMCV为系统之抗病毒活性分析方法。96孔盘中加入每孔1万个细胞数，培养隔夜后，干扰素样品经系列稀释，加入细胞中共同培养隔夜后，再加入EMCV感染细胞，经培养隔夜后，以显微镜观察病毒对照、细胞对照与样品的细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，接续细胞处以「细胞增生试剂套组」(Cell Proliferation Kit II XTTTM，Roche Diagnostics，Cat.No.11-465-015-001)，以微孔盘光度分光仪侦测颜色变化，对照国际干扰素标准品(NIH Interferon reference，Ga23-902-532)计算出样品的相对活性值。干扰素另以「人类干扰素-α酵素联结免疫反应套组」(Human Interferon Alpha ELISA KitTM，PBL-Biomedical LaboratroiesTM，NJ.Cat.No.41105-1)进行定量。表五数据中显示干扰素第八亚型具有最高的比活性值，为其它亚型的2.5至14倍之高。目前已商品化产品「罗飞龙」为干扰素第二亚型(IFN-α2a)，其比活性标示值为250百万国际单位/毫克干扰素，可用来作为对照品，即每毫升溶液中含有2微克的干扰素第二亚型(IFN-α2a)，具有1000国际单位的抗病毒活性。

1百万国际单位(MIU)＝10⁶国际单位(IU)＝1百万国际活性单位(million international unit of specific activity)

干扰素α的比活性数据列于表四及表五，以百万国际单位/毫克(MIU/mg)表示。更进一步可由表六数据中显示，在莫耳浓度一比一混合比例下，干扰素α第二亚型与第八亚型的混合相较于其它不同亚型的混合，可获得较高的比活性值，其比活性值约为1030百万国际单位/毫克干扰素α。

表五各干扰素-α亚型的抗病毒活性

收集峰	1’	2’	3’	4’	5’	6’
							干扰素-α亚	IFN-α2	IFN-α4	IFN-α10	IFN-α17	IFN-α7	IFN-α8

型				IFN-α8
							抗病毒活性(MIU/mgIFN)	283	92	670	422	280	1268

表六混合干扰素-α亚型的抗病毒活性

干扰素-α亚型的比例(摩尔比)	IFN-α2∶IFN-α8(1∶1)	IFN-α10∶IFN-α8(1∶1)	IFN-α17∶IFN-α8(1∶1)
				抗病毒活性(MIU/mg IFN)	1030	850	723

如同结果所述，干扰素α不同亚型间分别独自或是组合使用可增加抗病毒活性，尤其对于病毒性疾病，可针对医药上的目的而加以组合使用。综合来说，干扰素α不同亚型组合的发明，或是添加已知添加物，以增加抗病毒活性而达到降低剂量使用之目的。医疗用药含干扰素α成分可应用于下列所述，但不局限于下列所述剂型：注射液、浓缩粉末、胶囊、锭剂、软膏、口服液、糖浆、或乳液供作处方用途。

本发明的具体实践已经在特定实施例中描述了，这些实施例的用意是展示而非限制，许多变化、修饰、添加、及改进是可能的，准此，单一实施例的描述可提供多数实施例所用。除此之外，目前各亚型单一的结构及功能性的标准结构图，亦可作为不同亚型组合时所用，这些及其它变化、修饰、添加、及改进亦在以下的权利要求所定义的发明的范畴内。

参考文献。

此列附上参考文献以作为举证，并重新列上以方便查询：

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Claims (19)

1. 一种混合物，包含天然的人类干扰素α，其中所述的天然的人类干扰素α系纯化自人类淋巴母细胞，其中所述的天然的人类干扰素α包含至少一种干扰素α亚型，其中所述的干扰素α亚型的分子重量大约为19到27千道尔顿(kDa)；以及其中所述的天然的人类干扰素α亚型在介于约90和约1300百万活性单位/每毫克干扰素(MIU/mg IFN)之间时具有抗病毒活性。

2. 如权利要求1所述的混合物，其中所述的天然的干扰素α包含至少一种干扰素α亚型系选自由干扰素α2、干扰素α2b、干扰素α2c、干扰素α4、干扰素α7、干扰素α8、干扰素α10、干扰素α16、干扰素α17、和干扰素α21所组成的群组。

3. 如权利要求1所述的混合物，其中所述的天然的干扰素α包含干扰素α8以及至少一种干扰素α亚型系选自由干扰素α2、干扰素α2b、干扰素α2c、干扰素α4、干扰素α7、干扰素α10、干扰素α16、干扰素α17、和干扰素α21所组成的群组。

4. 如权利要求3所述的混合物，其中所述的天然的干扰素α包含干扰素α8及干扰素α2、干扰素α8及干扰素α10、或干扰素α8及干扰素α17。

5. 如权利要求1所述的混合物，包含一种医药剂型系选自由注射液、浓缩粉末、胶囊、锭剂、软膏、口服液、糖浆、粉状吸入剂、和乳液所组成的群组。

6. 如权利要求1所述的混合物，其中所述的天然的人类干扰素α系纯化自人类淋巴母细胞株、Namalwa细胞株、或标号BCRC960246的细胞株。

7. 一种医药混合物，包含天然的人类干扰素α亚型，其中所述的天然的人类干扰素α亚型具有分子重量介于约19000和约27000道尔顿之间，以及其中所述的干扰素α在介于约90和约1300百万活性单位/每毫克干扰素(MIU/mg IFN)之间时具有抗病毒活性。

8. 如权利要求7所述的混合物，包含一种医药剂型系选自由注射液、浓缩粉末、胶囊、锭剂、软膏、口服液、糖浆、粉状吸入剂、和乳液所组成的群组。

9. 如权利要求7所述的混合物，其中所述的干扰素α亚型系选自由干扰素α2、干扰素α2b、干扰素α2c、干扰素α4、干扰素α7、干扰素α8、干扰素α10、干扰素α16、干扰素α17和干扰素α21所组成的群组。

10. 如权利要求7所述的混合物，其中所述的干扰素α亚型包含干扰素α8以及至少一种干扰素α亚型系选自由干扰素α2、干扰素α2b、干扰素α2c、干扰素α4、干扰素α7、干扰素α10、干扰素α16、干扰素α17和干扰素α21所组成的群组。

11. 如权利要求10所述的混合物，其中所述的天然的干扰素α包含干扰素α8及干扰素α2、干扰素α8及干扰素α10、或干扰素α8及干扰素α17。

12. 一种制造天然的人类干扰素α的方法，包含：

a.培养人类淋巴母细胞；

b.亲和性管柱层析；以及

c.逆相高压液态管柱层析，其中所述的天然的人类干扰素α在介于约90和约1300百万活性单位/每毫克干扰素(MIU/mg IFN)之间时具有抗病毒活性。

13. 如权利要求12所述的方法，其中所述的细胞系选自由淋巴母细胞、Namalwa细胞、和标号BCRC960246的细胞株所组成的群组。

14. 如权利要求12所述的方法，其中所述的细胞系DB009细胞。

15. 一种混合物，包含干扰素α8，其中所述的干扰素α8系纯化自淋巴母细胞系。

16. 如权利要求15所述的混合物，更包含至少一种额外的干扰素α亚型系选自由干扰素α2、干扰素α2b、干扰素α2c、干扰素α4、干扰素α7、干扰素α10、干扰素α16、干扰素α17、和干扰素α21所组成的群组。

17. 如权利要求15所述的混合物，更包含干扰素α2、干扰素α10、或干扰素α17。

18. 如权利要求15所述的混合物，更包含干扰素α2，其与所述的干扰素α8含量的比例为1∶1。

19. 如权利要求15所述的混合物，更包含抗病毒活性蛋白。

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