CN118184795A - 抗hiv-1的重组蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体地，涉及一种融合蛋白，更具体地，涉及一种抗HIV‑1的重组蛋白及其应用。本发明包括一种重组蛋白，包括：1)CD4的D1D2结构域；2)DC‑SIGN的ND和CRD结构域；以及3)IgG1Fc段。使用本发明的重组蛋白，对HIV‑1具有很好的抑制效果，且具有广谱性，对很对HIV‑1的早期毒株也有抑制效果。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地，涉及一种融合蛋白，更具体地，涉及一种抗HIV-1的重组蛋白及其应用。
背景技术
人类获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)，简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒(Human Immuno-deficiency Virus，HIV)感染而引起。
迄今为止，HIV-1的疫苗研究均以失败告终。对HIV-1的药物治疗早期比较重要的成果是鸡尾酒疗法(Highly active antiretroviraltherapy，HAART)。持续性的鸡尾酒疗法，使得HIV-1感染者体内的病毒载量长期维持在一个低水平，但并不能清除病毒，病人需要长期服用药物，HIV-1感染者以及AIDS患者使用此类药物后会产生严重而复杂的副作用，而且长期服药又会导致HIV-1耐药株的产生。虽然HIV-1广谱中和抗体(bNAbs)也可以抑制多种HIV-1毒株感染宿主，近年来已被作为药物候选物进行临床前或临床实验，但是其费用十分昂贵，即使成功也难以大范围使用。目前抗HIV-1药物，如逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂等，多为化学类药物。生物类药物具有毒性小、可在病人体内实现持续或可控表达的优势，但目前用于临床的生物类药物及其匮乏，且仍然存在广谱性较差、抑制效果欠佳、副作用大以及存在抗性毒株等问题。
本领域需要一种产品，其抑制HIV-1的广谱性和抑制效果好，且用法安全。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种重组蛋白，包括：
1)CD4的D1D2(结构域1结构域2)结构域；
2)DC-SIGN的ND(颈结构域)和CRD(碳水化合物识别结构域)；以及
3)IgG1 Fc段。
进一步地，所述重组蛋白从N端到C端依次为1)、2)、3)，或者1)、3)、2)，或者3)、1)、2)，或者3)、2)、1)，或者2)、1)、3)，或者2)、3)、1)。
进一步地，所述重组蛋白优选从N端到C端依次为1)、2)、3)，或者1)、3)、2)。
进一步地，所述重组蛋白更优选从N端到C端依次为1)、3)、2)。
进一步地，所述重组蛋白还包括不同的种类和长度的linker。
在一些具体的实施方案中，所述linker可以是(G4S)n、AADP、(EAAAK)n、KESGSVSSEQLAQFRSLD、EGKSSGSGSESKST等
进一步地，CD4的D1D2结构域的序列为：
KKVVLGKKGDTVELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPSKLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEVEDQKEEVQLLVFGLTANSDTHLLQGQSLTLTLESPPGSSPSVQCRSPRGKNIQGEKTLSVSQLELQDSGTWTCTVLQNQKKVEFKIDIVVLA。
进一步地，DC-SIGN的ND和CRD的序列为：
VGELSEKSKLQEIYQELTQLKAAVGELPEKSKLQEIYQELTRLKAAVGELPEKSKLQEIYQELTWLKAAVGELPEKSKMQEIYQELTRLKAAVGELPEKSKQQEIYQELTRLKAAVGELPEKSKQQEIYQELTRLKAAVGELPEKSKQQEIYQELTQLKAAVERLCHPCPWEWTFFQGNCYFMSNSQRNWHDSITACKEVGAQLVVIKSAEEQNFLQLQSSRSNRFTWMGLSDLNQEGTWQWVDGSPLLPSFKQYWNRGEPNNVGEEDCAEFSGNGWNDDKCNLAKFWICKKSAASCSRDEEQFLSPAPATPNPPPA。
进一步地，IgG1 Fc段的序列为：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
使用本发明所述的重组蛋白，对HIV-1具有显著的抑制效果，且用法安全。
在一些具体的实施方案中，所述重组蛋白为如SEQ ID NO.1～4所示的蛋白。
在一些优选的实施方案中，所述重组蛋白为如SEQ ID NO.2～4所示的蛋白。
使用上述的重组蛋白，对HIV-1的抑制效果更佳，具有很好的广谱性。
在一些更优选的实施方案中，所述重组蛋白为如SEQ ID NO.2～3所示的蛋白。
使用这些重组蛋白，对HIV-1的抑制效果最佳，且具有更佳的广谱性，对很对HIV-1的早期毒株也有很好的抑制效果。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的重组蛋白的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，所述分离的核酸分子编码本发明的重组蛋白。
在一些具体的实施方案中，所述核酸分子为如SEQ ID NO.5～8所示的核酸。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含本发明的分离的核酸分子。
在某些优选的实施方案中，所述载体包含编码本发明重组蛋白的核苷酸序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，病毒等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的重组蛋白。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的核酸分子或本发明的载体。
此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。
在某些优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是哺乳动物细胞，例如CHO(例如CHO-K1、CHO-S、CHO DG44)或HEK293。
在另一个方面，本发明提供了制备本发明的重组蛋白的方法，其包括，在允许所述重组蛋白表达的条件下，培养本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述重组蛋白。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括：
1)构建包含编码本发明重组蛋白的核苷酸序列的表达载体；
2)将步骤1)中所述的表达载体转化至宿主细胞；
3)在允许本发明的重组蛋白表达的条件下，培养步骤2)中所述的宿主细胞；和
4)从培养的宿主细胞培养物中回收所述重组蛋白。
在另一个方面，本发明提供了本发明所述的重组蛋白在制备抗HIV-1感染的药物中的用途。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明的重组蛋白，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明的重组蛋白或者本发明的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。
优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的重组蛋白，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。
此外，本发明的重组蛋白可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。在某些实施方案中，所述单位剂量为至少0.1mg，1mg，至少5mg，至少10mg，至少15mg，至少20mg，至少25mg，至少30mg，至少45mg，至少50mg，至少75mg，或至少100mg。在所述药物组合物为液体(例如，注射剂)剂型的情况下，其可以包含浓度至少为0.1mg/ml，如至少0.25mg/ml，至少0.5mg/ml，至少1mg/ml，至少2.5mg/ml，至少5mg/ml，至少8mg/ml，至少10mg/ml，至少15mg/ml，至少25mg/ml，至少50mg/ml，至少75mg/ml，或至少100mg/ml的本发明的重组蛋白。
本发明的重组蛋白或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的重组蛋白或药物组合物通过静脉输注或注射给予。
在本发明中，所述受试者可以为哺乳动物，例如人。
本发明所提供的药物组合物或重组蛋白可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如病毒抑制剂)联合使用。在某些优选的实施方案中，将本发明的重组蛋白与其它HIV-1抑制剂联合使用，以预防和/或治疗HIV-1感染。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的重组蛋白。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如进展为艾滋病)的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明的重组蛋白的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的重组蛋白。
附图说明
图1为(A)不同处理组人包皮内板组织中培养液中的HIV-1p24浓度；(B)②、③和④蛋白在人包皮内板组织中抗BaL的抑制率。所示数据为平均值±标准差。
具体实施方式
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HIV-1感染)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如进展为艾滋病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明重组蛋白质粒构建
将不同组合的基因序列(SEQ ID NO.5-8)插入质粒pcDNA3.1(+)中构建表达目的蛋白的质粒，使用内切酶BamHI和XhoI对所有重组质粒进行双酶切，随后在1％琼脂糖凝胶中120V核酸胶电泳30min鉴定。
实施例2、本发明重组蛋白表达和纯化
表达
1)材料：
培养基：FreeStyle 293Expression Medium(Gibico，12338018，添加100U/mL青霉素和100U/mL链霉素(Sigma)
细胞：HEK 293F细胞系
转染试剂：PEI(Polyetherimide：Polysciences，23966-1)
2)操作步骤：
(1)HEK 293F细胞密度为1～1.2×106cells/mL时进行转染，每一百万个细胞转染1～1.2μg质粒。质粒与PEI(1mg/mL)使用比例为1:3；
(2)以250mL摇瓶为例(转染前种植细胞总体积为25mL，最终总培养体积为50mL)，在2.5mL无菌生理盐水中加入50μg质粒，轻轻混匀溶液，再加入50～200μL PEI转染试剂；
(3)涡旋振荡5s，静置10min，使PEI-DNA复合物形成；
(4)用移液器轻轻上下吹打混合液3次，边晃动摇瓶，边将PEI-DNA混合液加入更换了培养基的细胞培养瓶中，确保PEI-DNA复合物均匀分布，防止局部浓度过高。培养2～3h后补充25mL新鲜完全培养基37℃8％ CO2继续培养；
(5)转染后4d收样，1200rpm，离心5min，收取细胞上清，Western blot检测目的蛋白的表达。
纯化
1)材料
Protein A Resin(GenScript，L00210)纯化蛋白；
Binding/Wash Buffer：0.15M NaCl,20mM Na2HPO4,pH 7.0；
Elution Buffer：0.1M glycine,pH 3.0；
Neutralization Buffer：1M Tris-HCl,pH 8.5；蠕动泵
2)操作步骤：
(1)预先加入1mL Binding/Wash Buffer至色谱柱中，完全重悬Protein AResin后吸取2mL混合液填装至柱中；
(2)待Resin自然沉降，加入5mL Binding/Wash Buffer平衡，流速1mL/min；
(3)将样品与Binding/Wash Buffer至少体积比1:1的比例混合成样品稀释液，加入柱中，流速1mL/min；
(4)用30mL Binding/Wash Buffer洗涤平衡柱子，以2mL/min排出缓冲液；
(5)用15～20mL Elution Buffer洗脱，流速约为1mL/min，收集目的溶液，立即用收集溶液总体积1/10体积的Neutralization Buffer中和至pH 7.4；
(6)还原型SDS-PAGE电泳，再用考马斯亮蓝染色检测目的蛋白纯化情况。
实施例3、本发明重组蛋白中和活性评估
1)、材料
DEAE(Diethylaminoethyl，Sigma，D9885)；
NP40(Sigma-Aldrich，I8896；
Luciferase Assay System(Promega，E1501)
培养基：DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium-High，Sigma，D6429-500ML)，添加100U/mL青霉素和100U/mL链霉素(Sigma)，10％FBS(胎牛血清，Gibico，F9665-500ML)
2)确定DEAE的使用浓度：
(1)将100μL TZM-bl细胞铺到96孔平底细胞培养板中，密度为1×106cells/mL，于37℃CO2细胞培养箱中静置培养；
(2)次日，以3为系数梯度稀释DEAE溶液，稀释11个梯度，第12个孔为不含DEAE的完全培养基作为空白，做四个重复；
(3)准备好足够体积的已知毒量很高的病毒液；
(4)吸去旧培养基，100μL/孔加含DEAE的培养基以及100μL病毒液；
(5)48h后按照测HIV-1TCID50相同的方法读取吸光值；
(6)分析数据，读数最大的孔对应的DEAE的浓度即为工作浓度。
3)利用TZM-bl细胞系评估中和效果
(1)将培养的TZM-bl细胞制成单细胞悬液之后，按照1×104cells/孔加入96孔板之中，终体积为100μL，置于37℃ CO2细胞培养箱中培养；
(2)次日，将HIV-1稀释成200TCID50/mL；
(3)将纯化的目的蛋白以9μg/mL作为起始稀释梯度，然后以3为稀释系数向后稀释10个梯度，第12列为完全培养基；
(4)将60μL蛋白或抗体稀释溶液与60μL HIV-1稀释液混合，共同在37℃ CO2细胞培养箱中孵育1h。每个实验孔做3个复孔；
(5)弃去细胞旧培养基，加入100μL含DEAE的新鲜DMEM培养基，然后加入100μL孵育好的混合溶液，于37℃细胞培养箱中培养；
(6)48h后，弃去培养基，弃去培养基，以200μL/孔PBS缓冲液清洗一遍，加入200μL/孔的0.5％ NP40裂解液室温裂解5～10min；
(7)1000rpm，室温离心5min，用排枪各取50μL上清至96孔白板中；
(8)加入荧光素酶底物50μL/孔，使用酶标仪中读取吸光值；
(9)分析数据，以未加蛋白孔的为0％抑制率来计算各浓度下的抑制率，并使用GraphPad Prism 8.0计算IC50值。
针对HIV-1毒株NL4-3和BaL的中和检测结果如表1所示(①～④对应蛋白质序列SEQ ID NO.1～4)：
表1
| 蛋白 | NL4-3 IC50(nM) | BaL IC50(nM) |
| ① | 27.00 | 46.60 |
| ② | 0.46 | 0.52 |
| ③ | 0.22 | 0.19 |
| ④ | 5.52 | 5.29 |
实施例4、本发明重组蛋白对不同毒株的中和活性
使用实施例3的方法，评估了多个不同毒株的中和活性，具体结果如表2所示。
表2
注：a.IC50，50％抑制浓度，单位nM，摩尔浓度根据蛋白质单体分子量(②和③：170kDa；CLD(仅具有CD4和DC-SIGN的融合蛋白)：60kDa)计算。
b.No，无抑制效果。
c.ND，未测试。
实施例5、人包皮组织块评估HIV-1的中和效果
(1)用无血清RMPI-1640培养基清洗人包皮组织数次；
(2)小心去除脂肪组织，切割成约3mm×3mm大小的组织块；
(3)培养在48孔板中，1块组织/孔，每孔加500μL RMPI-1640完全培养基，添加50μg/mL庆大霉素，于37℃CO2细胞培养箱中培养。
(4)用RPMI-1640完全培养基将纯化的蛋白以100μg/mL作为终浓度稀释，用RPMI-1640完全培养基将HIV-1稀释成2000TCID50/mL；
(5)将250μL蛋白稀释溶液或RPMI-1640完全培养基与250μL HIV-1稀释液混合，共同在37℃细胞培养箱中孵育1h。每个实验孔做3个复孔；
(6)将500μL孵育好的混合溶液加入组织块，37℃细胞培养箱中培养1h；
(7)以500μL/孔PBS缓冲液清洗5遍；
(8)去掉PBS，加入500μL含庆大霉素(终浓度为50μg/mL)的RPMI-1640完全培养基，于37℃细胞培养箱中培养；
(9)于感染后7天，取100μL培养液，加入TritonX-100(终浓度为1％)，37℃细胞培养箱中孵育1h，ELISA检测上清中的p24含量。每次取完样后补加100μL含庆大霉素(终浓度为50μg/mL)的新鲜RPMI-1640完全培养基至培养板。
具体中和结果如图1所示，(A)为不同处理组人包皮内板组织中培养液中的HIV-1p24浓度。HIV-1p24是HIV-1病毒颗粒的主要结构蛋白，检测p24能代表病毒含量，p24浓度越高代表HIV-1数量越多。以不加抗病毒蛋白的培养基为对照，可见②、③和④的p24含量明显低于对照组。
(B)为②、③和④蛋白在人包皮内板组织中抗BaL的抑制率。以未加蛋白的培养基对照组为0％抑制率计算的②、③和④蛋白的抑制率。
Claims (10)
1.一种重组蛋白，包括：
1)CD4的D1D2结构域；
2)DC-SIGN的ND和CRD结构域；以及
3)IgG1 Fc段。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白从N端到C端依次为1)、3)、2)。
3.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白还包括linker。
4.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白为如SEQ ID NO.1～4所示的序列。
5.一种分离的核酸分子，包括编码如权利要求1～4中任一项所述的重组蛋白的核苷酸序列。
6.一种载体，包括如权利要求5所述的分离的核酸分子。
7.一种宿主细胞，包括如权利要求5所述的分离的核酸分子或如权利要求6所述的载体。
8.一种制备重组蛋白的方法，包括，在允许所述重组蛋白表达的条件下，培养如权利要求7所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述重组蛋白。
9.如权利要求1～4中任一项所述的重组蛋白在制备抗HIV-1感染的药物中的用途。
10.一种药物组合物，包括
如权利要求1～4中任一项所述的重组蛋白；以及
药学上可接受的载体和/或赋形剂。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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