CN103980371A - 苜蓿多糖的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物多糖成分的功能研究，具体地涉及利用复合酶技术从苜蓿中提取总多糖，采用Sevag法对苜蓿总多糖进行脱蛋白，得到脱蛋白的苜蓿总多糖；然后将脱蛋白的苜蓿多糖采用DEAE-纤维素层析柱和Sephadex G-100凝胶层析柱进行分级纯化，得到不同的苜蓿多糖组分APS-2a、APS-2b、APS-3a和APS-3b。体外细胞试验表明，本发明得到的苜蓿多糖组分具有提高蛋鸡肝细胞抗氧化能力和预防肝细胞脂肪变性的功能，为苜蓿多糖预防蛋鸡脂肪肝出血综合症提供理论依据，进而促进新型饲料添加剂——苜蓿多糖的创制与应用。
Description
技术领域
本发明涉及植物多糖成分的功能研究，具体地涉及从苜蓿中提取多糖成分，及其提高蛋鸡肝细胞抗氧化能力和预防肝细胞脂肪变性的功能。
背景技术
苜蓿是一种多年生优质草本豆科牧草，在世界各国广泛种植，素有“牧草之王”的美称，资源十分丰富。苜蓿多糖是从苜蓿茎叶中提取的水溶性多糖，具有多种生物功能，同时，苜蓿的广泛来源为苜蓿多糖的生产提供了充足且廉价的原料，因此苜蓿多糖具有良好的应用前景。
蛋鸡脂肪肝出血综合征是一种主要发生于产蛋高峰期蛋鸡的营养代谢紊乱性疾病。该病的主要特征为肝脏脂肪含量急剧上升，一般超过肝脏干重的40％，肝细胞脂肪变性明显，有严重者肝脏发生出血现象，最终导致蛋鸡产蛋率下降，甚至死亡，发病率为5％左右，进而降低养殖者的经济收益。蛋鸡脂肪肝出血综合征的发病原因主要有日粮因素、遗传因素和激素分泌等。患有该疾病的蛋鸡，血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力下降，血清和肝脏中的MDA含量升高，说明脂质发生过氧化造成的肝脏损伤在蛋鸡形成脂肪肝过程中起重要作用。由于该病属于营养代谢病，所以通过饲料添加剂技术，如微生态制剂、植物功能成分制剂等，调节蛋鸡的营养代谢，从而降低该病的发病率是研究人员达成的一致共识。
本发明在实验室前期试验的基础上，对通过复合酶技术提取的苜蓿多糖进行分级纯化，利用蛋鸡肝细胞做为体外研究模型，分别通过过氧化氢和混合脂肪酸诱导建立肝细胞氧化应激模型和脂肪变性模型，研究纯化苜蓿多糖对蛋鸡肝细胞氧化状态和脂肪代谢的影响，为苜蓿多糖预防蛋鸡脂肪肝出血综合症提供理论依据，进而促进新型饲料添加剂——苜蓿多糖的创制与应用。
发明内容
本发明提供了从苜蓿中分离得到多糖成分、其制备方法及其提高蛋鸡肝细胞抗氧化能力和预防肝细胞脂肪变性的生物功能，为苜蓿多糖应用到食品、饲料等领域中提供新的理论依据。
本发明第一方面涉及苜蓿多糖，其包含一种或数种苜蓿多糖成分：
(1)APS-2a的重均分子量为48536Da，单糖组成和摩尔比为阿拉伯糖∶半乳糖∶半乳糖醛酸＝4.88∶13.53∶1.00；
(2)APS-2b的重均分子量为6221Da，单糖组成和摩尔比为木糖∶阿拉伯糖∶鼠李糖∶半乳糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸＝1.00∶7.34∶4.98∶9.75∶3.25∶24.60；
(3)APS-3a的重均分子为4513Da和66559Da，单糖组成和摩尔比为木糖∶阿拉伯糖∶鼠李糖∶半乳糖∶半乳糖醛酸＝1.00∶1.77∶1.82∶4.65∶24.60；
(4)APS-3b的重均分子量13076Da，单糖组成和摩尔比为木糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖∶鼠李糖∶半乳糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸＝1.00∶2.35∶3.78∶3.05∶2.74∶11.45∶1.72。
本发明第二方面涉及本发明第一方面的苜蓿多糖的制备方法，其包括以下步骤：
(1)称取适量通过复合酶技术提取的苜蓿总多糖(中国专利，公开号CN103304678A，公布日2013.09.18)，蒸馏水溶解后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H2O、0.25mol/L NaHCO3和0.5mol/L NaHCO3进行洗脱，利用苯酚-硫酸法检测多糖含量，绘制多糖洗脱曲线，收集不同多糖组分，分别命名为APS-1、APS-2和APS-3；洗脱曲线见图1。
(2)APS-2洗脱组分经Sephadex G-100柱层析，获得苜蓿多糖APS-2a和APS-2b；洗脱曲线见图2和图3。
(3)APS-3洗脱组分经SephadexG-100柱层析，获得苜蓿多糖APS-3a和APS-3b；洗脱曲线见图4和图5。
本发明第三方面涉及本发明第一方面的一种或数种苜蓿多糖具有提高蛋鸡肝细胞抗氧化能力和预防肝细 胞脂肪变性的生物功能。
附图说明
图1苜蓿总多糖经DEAE-纤维素柱层析的洗脱曲线图
图2APS-2a洗脱组分经Sephadex G-100柱层析洗脱曲线图
图3APS-2b洗脱组分经Sephadex G-100柱层析洗脱曲线图
图4APS-3a洗脱组分经Sephadex G-100柱层析洗脱曲线图
图5APS-3b洗脱组分经Sephadex G-100柱层析洗脱曲线图
图6APS-2a的分子量测定的GPC自动标尺色谱图
其中纵坐标为电位，单位为毫伏(MV)，图7、图8和图9与此图相同。
图7APS-2b的分子量测定的GPC自动标尺色谱图
图8APS-3a的分子量测定的GPC自动标尺色谱图
图9APS-3b的分子量测定的GPC自动标尺色谱图
具体实施方式
下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中所用仪器及试剂未注明生产厂商者，均按照仪器制造商建议的条件进行，试剂均为通过市购获得的常规产品。
实施例1：苜蓿多糖APS-2a、APS-2b、APS-3a和APS-3b的制备
1、苜蓿总多糖制备：利用复合酶技术提取的苜蓿总多糖(中国专利，公开号CN103304678A，公布日2013.09.18)。
2、苜蓿总多糖脱蛋白：将三氯甲烷与正丁醇以4∶1比例混合，配成Sevag试剂，将总多糖用蒸馏水溶于烧杯中，加入1/4体积的Sevag试剂，磁力搅拌器剧烈搅拌后30min后，4000r/min离心10min，收集上清液。再加入相同比例的Sevag试剂，按上述步骤反复数次，直至下层溶液中不再有白色泡沫出现为止。
3、离子交换柱层析：填料为DEAE-纤维素，将脱蛋白的苜蓿总多糖(500mg)用1-2mL蒸馏水溶解，离心，收集上清；沉淀再用1mL蒸馏水溶解，离心，收集上清，最后合并上清液，用滴管缓慢上柱，防止将填料冲起。然后，依次用H2O、0.25mol/L NaHCO3和0.5mol/L NaHCO3进行洗脱，流速为1mL/min，用自动部份收集器收集，每管收集10mL。用苯酚-硫酸法检测糖含量，根据OD值绘制洗脱曲线，收集糖峰洗脱液，旋转蒸发仪浓缩、蒸馏水透析72h、再次浓缩，最后冷冻干燥，分别得到APS-1，APS-2和APS-3三个多糖组分(见图1)。
4、凝胶柱层析：填料为Sephadex G-100，将通过离子交换柱层析的APS-2和APS-3多糖组分分别用蒸馏水溶解，离心，取上清液，用滴管缓慢上柱，防止将填料冲起。然后，用0.1mol/L NaCl缓冲溶液洗脱柱子，流速为0.3mL/min，用自动部份收集器收集，每管收集3mL。用苯酚-硫酸法检测糖含量，根据OD值绘制洗脱曲线，根据洗脱峰收集糖峰洗脱液，旋转蒸发仪浓缩、蒸馏水透析72h、再次浓缩，最后冷冻干燥，获得APS-2a、APS-2b、APS-3a和APS-3b四个多糖组分(见图2-图5)。
5、多糖APS-2a、APS-2b、APS-3a和APS-3b分子量测定：
(1)GPC操作条件：以Waters600型HPLC仪，流动相为0.1mol/L Na2SO4，流速为0.6mL/min，TSKgel-G4000PWXL(7.8×300mm)，采用2414示差检测器与2998紫外检测器连用的方法进行测定；温度：35℃；进样量：20μL。
(2)绘制标准曲线，测定样品，根据标准曲线计算样品分子量。
(3)APS-2a的重均分子量为48536Da，见图6；APS-2b的重均分子量为6221Da，见图7；APS-3a的重均分子量为4513Da和66559Da，见图8；APS-3b的重均分子量为13076Da，见图9。
6、多糖APS-2a、APS-2b、APS-3a和APS-3b单糖组成测定(高效毛细管电泳法)
(1)多糖样品和标准品经过完全酸水解和PMP衍生处理后，将样品和标准品进行高效凝胶电泳分析。
(2)各个多糖组分的单糖组成如下表1所示
表1APS-2a，APS-2b、APS-3a和APS-3b多糖组分的单糖组成
注：a：未检测到
实施例2：苜蓿多糖组分APS-2a、APS-2b、APS-3a和APS-3b的生物功能
1、产蛋高峰期蛋鸡肝脏细胞分离：活体原位两步灌流法分离肝细胞(周筱丹等，2012)
2、苜蓿多糖对肝细胞氧化状态的影响：将刚分离获得的肝细胞悬液浓度调为106个/mL，接种在6孔板内，5％CO2、37℃的培养箱内连续培养约6小时，待细胞完全贴壁后换成生长培养液，再继续培养12h，然后全量换成不同浓度的多糖处理生长培养液继续培养一定时间，然后加入4mmol/L H2O2处理肝细胞2h，收集样品培养液，测定培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)含量；收集细胞，测定细胞内的总蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)含量和总抗氧化能力(TAOC)水平。
3、苜蓿多糖对肝细胞脂肪代谢的影响：将刚分离获得的肝细胞悬液浓度调为106个/mL，接种在6孔板内，5％CO2、37℃的培养箱内连续培养约6小时，待细胞完全贴壁后换成生长培养液，再继续培养12h，然后全量换成不同浓度的多糖处理生长培养液和混合脂肪酸(油酸∶棕榈酸＝2∶1，培养基中的混合脂肪酸终浓度为1mM)继续培养24h，收集细胞，测定细胞内的总蛋白和甘油三酯(TG)含量。
4、结果表明：分离得到的各个多糖组分APS-2a、APS-2b、APS-3a和APS-3b均具有增强蛋鸡肝细胞SOD、CAT的活力和提高TAOC水平的功能，同时能够降低细胞培养液中LDH和MDA的含量，保持肝细胞膜的完整性，结果见表2-表5。此外，APS-2b、APS-3a多糖组分处理组的TG水平均显著降低，说明苜蓿多糖具有参与肝细胞脂代谢及防止肝细胞脂肪变性的功能，结果见表6。
表2APS-2a对肝细胞内SOD，CAT和TAOC，培养液中LDH和MDA活性的影响
同行肩标不用小写字母表示差异显著(P＜0.05)，数据以平均值±标准差表示(n＝3)
表3APS-2b对肝细胞内SOD，CAT和TAOC，培养液中LDH和MDA活性的影响
同行肩标不用小写字母表示差异显著(P＜0.05)，数据以平均值±标准差表示(n＝3)
表4APS-3a对肝细胞内SOD，CAT和TAOC，培养液中LDH和MDA活性的影响
同行肩标不用小写字母表示差异显著(P＜0.05)，数据以平均值±标准差表示(n＝3)
表5APS-3b对肝细胞内SOD，CAT和TAOC，培养液中LDH和MDA活性的影响
同行肩标不用小写字母表示差异显著(P＜0.05)，数据以平均值±标准差表示(n＝3)
表6苜蓿多糖各个组分对肝细胞内TG含量的影响
同行肩标不用小写字母表示差异显著(P＜0.05)，数据以平均值±标准差表示(n＝3) 。
Claims (3)
1.苜蓿多糖，其包含以下苜蓿多糖组分中的一种或数种，其特征在于：
(1)APS-2a的重均分子量为48536Da，单糖组成和摩尔比为阿拉伯糖∶半乳糖∶半乳糖醛酸＝4.88∶13.53∶1.00；
(2)APS-2b的重均分子量为6221Da，单糖组成和摩尔比为木糖∶阿拉伯糖∶鼠李糖∶半乳糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸＝1.00∶7.34∶4.98∶9.75∶3.25∶24.60；
(3)APS-3a的重均分子为4513Da和66559Da，单糖组成和摩尔比为木糖∶阿拉伯糖∶鼠李糖∶半乳糖∶半乳糖醛酸＝1.00∶1.77∶1.82∶4.65∶24.60；
(4)APS-3b的重均分子量13076Da，单糖组成和摩尔比为木糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖∶鼠李糖∶半乳糖∶葡萄糖醛酸∶半乳糖醛酸＝1.00∶2.35∶3.78∶3.05∶2.74∶11.45∶1.72。
2.根据权利要求1的苜蓿多糖的制备方法，其特征在于制备方法如下：
取利用复合酶提取的苜蓿总多糖，采用Sevag法进行脱蛋白处理，冷冻干燥得到脱蛋白的苜蓿总多糖；蒸馏水溶解脱蛋白的苜蓿总多糖后进行DEAE-纤维素柱层析，依次用H2O，0.25mol/L NaHCO3和0.5mol/LNaHCO3洗脱，苯酚-硫酸法检测多糖含量，分别得到苜蓿多糖组分APS-1，APS-2和APS-3；
苜蓿多糖组分APS-2经Sephadex G-100柱层析，纯化获得苜蓿多糖组分APS-2a，APS-2b；
苜蓿多糖组分APS-3经Sephadex G-100柱层析，纯化获得苜蓿多糖组分APS-3a，APS-3b。
3.根据权利要求1的苜蓿多糖具有提高蛋鸡肝细胞抗氧化能力和预防肝细胞脂肪变性的功能。
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| CN (1) | CN103980371B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104664086A (zh) * | 2015-03-31 | 2015-06-03 | 江西中成人药业有限公司 | 一种功能性复合植物多糖添加剂预混合饲料 |
| CN111683546A (zh) * | 2017-10-23 | 2020-09-18 | 纽崔莱公司 | 用于治疗或预防感染的酶促水解果胶多糖 |
| CN112724270A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-30 | 盐城工学院 | 一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用 |
| CN114853918A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-05 | 沈阳化工大学 | 一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2296132C2 (ru) * | 2004-07-16 | 2007-03-27 | Российский государственный медицинский университет | Способ получения полисахаридов |
| CN102212144A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-10-12 | 沈阳农业大学 | 一种从紫花苜蓿干草中制备纯多糖的方法 |
| CN103304678A (zh) * | 2013-06-08 | 2013-09-18 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种利用复合酶提取苜蓿多糖的方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2296132C2 (ru) * | 2004-07-16 | 2007-03-27 | Российский государственный медицинский университет | Способ получения полисахаридов |
| CN102212144A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-10-12 | 沈阳农业大学 | 一种从紫花苜蓿干草中制备纯多糖的方法 |
| CN103304678A (zh) * | 2013-06-08 | 2013-09-18 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种利用复合酶提取苜蓿多糖的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| SHAOPU WANG等: ""Optimization of enzyme-assisted extraction of polysaccharides from"", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES》 * |
| SHAOPU WANG等: ""Optimization of enzyme-assisted extraction of polysaccharides from"", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES》, vol. 62, 1 October 2013 (2013-10-01), pages 387 - 396, XP028777701, DOI: doi:10.1016/j.ijbiomac.2013.09.029 * |
| W. DENG等: ""Effects of an aqueous alfalfa extract on production performance, egg quality and lipid metabolism of laying hens"", 《JOURNAL OF ANIMAL PHYSIOLOGY AND ANIMAL NUTRITION》 * |
| 张丽萍等: ""苜蓿多糖的提纯组分对 HIV 逆转录酶和蛋白酶活性"", 《中国食品学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104664086A (zh) * | 2015-03-31 | 2015-06-03 | 江西中成人药业有限公司 | 一种功能性复合植物多糖添加剂预混合饲料 |
| CN111683546A (zh) * | 2017-10-23 | 2020-09-18 | 纽崔莱公司 | 用于治疗或预防感染的酶促水解果胶多糖 |
| CN112724270A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-30 | 盐城工学院 | 一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用 |
| CN114853918A (zh) * | 2022-04-26 | 2022-08-05 | 沈阳化工大学 | 一种具有抗氧化降脂活性的紫花苜蓿根部多糖制备方法 |
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| Publication number | Publication date |
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