CN112724270A - 一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用 - Google Patents

一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用，低分子量苜蓿多糖的分子量为3~6 KDa，单糖组成包括0.75~1.16%甘露糖、68.57~81.02%葡萄糖、1.10~4.53%半乳糖；通过纤维素酶提取、Sevage试剂脱蛋白、棉絮状DEAE‑52纤维素脱色、颗粒状DEAE‑52纤维素分离纯化制备得到；具有调节肠道菌群的作用，促进双歧杆菌、乳酸菌等益生菌的增长，抑制柠檬酸杆菌、埃希菌等致病菌的生长，并酵解产生乙酸等短链脂肪酸，降低肠道的pH值。

Description

一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用
技术领域
本发明属于植物多糖技术领域，具体涉及一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用。
背景技术
苜蓿为豆科苜蓿属多年生草本植物，是世界上栽培面积最广的牧草品种之一；苜蓿也是一种传统的中草药，具有清热解毒、凉血通淋、益气健脾、温肾、降血脂等功效。苜蓿中含有多糖、皂苷、黄酮、多酚等生物活性成分，其中苜蓿多糖具有抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性，还可以用于促进家禽类的生产，且毒副作用小，已成为近年来的研究热点之一。
苜蓿多糖一般采用碱提取法、水提取法或酶提取法提取，后经分离纯化得到。CN103980371A公开了一种分子量为4.5~66.6KDa，由阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸等多种单糖组成的苜蓿多糖；该苜蓿多糖通过复合酶（纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶）提取，Sevage法脱蛋白，DEAE-纤维素柱和Sephadex G-100柱层析分级纯化得到。CN110790846A公开了一种分子量为8~20KDa，由鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、甘露糖和半乳糖组成的紫花苜蓿多糖；该紫花苜蓿多糖通过水提浸膏，Sevage法脱蛋白，AB-8树脂柱脱色，经过DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-200柱层析分离得到。但对于低分子量、单糖含量均一的苜蓿多糖及其在调节肠道菌群中的应用还鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种低分子量苜蓿多糖及其制备方法与调节肠道菌群的应用，通过控制纤维素酶的用量制得低分子量、单糖含量均一的苜蓿多糖，该苜蓿多糖具有调节肠道菌群的作用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种低分子量苜蓿多糖，分子量为3~6KDa，单糖组成包括0.75~1.16%甘露糖、68.57~81.02%葡萄糖、1.10~4.53%半乳糖。
优选的，所述分子量为5~6 KDa，单糖组成包括0.75%甘露糖、81.02%葡萄糖、1.1%半乳糖。
一种低分子量苜蓿多糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：将苜蓿原料干燥、粉碎，石油醚回流脱脂，过滤、干燥后得苜蓿干粉。
步骤2：取步骤1所得苜蓿干粉，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再加入纤维素酶，提取苜蓿多糖。灭酶活后离心收集上清液，浓缩、醇沉、离心，沉淀经冷冻干燥得粗制苜蓿多糖。
步骤3：将步骤2所得粗制苜蓿多糖加水溶解，加入Sevage试剂，振荡、离心脱蛋白，浓缩、醇沉、离心，沉淀得脱蛋白粗制苜蓿多糖。
步骤4：将步骤3中的脱蛋白粗制苜蓿多糖用棉絮状DEAE-52纤维素进行脱色处理，分别用水和NaCl溶液洗脱。将收集的水洗脱液浓缩、醇沉后得到脱色脱蛋白粗制苜蓿多糖。
步骤5：将步骤4所得脱色脱蛋白粗制苜蓿多糖用颗粒状DEAE-52纤维素分离纯化，用水洗脱，合并对称洗脱峰溶液，浓缩、冷冻干燥得到低分子量苜蓿多糖。
优选的，所述步骤2中苜蓿干粉与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的料液比为1：20~30，纤维素酶用量为6~8%。
优选的，所述步骤2中苜蓿干粉与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的料液比为1：30，纤维素酶用量为6%。
一种低分子量苜蓿多糖调节肠道菌群的应用，包括将低分子量苜蓿多糖与人体肠道菌群混合，促进益生菌的增长，抑制致病菌的生长，并酵解产生短链脂肪酸、降低肠道pH。
优选的，所述益生菌双歧杆菌比例增长1.9~14.3%，乳酸菌比例增长18.0~ 24.0%，所述致病菌柠檬酸杆菌比例下降8.6~9.3%，埃希菌比例下降21.7~26.2%。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1）本发明通过调节纤维素酶用量制得分子量为3~6 KDa，单糖组成包括0.75~1.16%甘露糖、68.57~81.02%葡萄糖、1.10~4.53%半乳糖的低分子量苜蓿多糖，相比于现有苜蓿多糖分子量更低，单糖组成更均一，主要为葡萄糖。
2）本发明分别采用棉絮状DEAE纤维素和颗粒状DEAE-52纤维素对粗制苜蓿多糖进行脱色、分离纯化，省略柱层析步骤，简化了制备过程。
3）本发明制得的低分子量苜蓿多糖具有调节肠道菌群的作用，促进益生菌的增长，其中双歧杆菌比例增长1.9~14.3%，乳酸菌比例增长18.0~ 24.0%；抑制致病菌的生长，其中柠檬酸杆菌比例下降8.6~9.3%，埃希菌比例下降21.7~26.2%；并酵解产生15~30 mmol/L乙酸，控制降低肠道的pH 4.7~5.5，协助控制致病菌的生长。
附图说明
图1为实施例1低分子量苜蓿多糖的红外光谱图；
图2为实施例1低分子量苜蓿多糖的单糖组成成分分析HPLC图；
图3为实施例3酵解液pH值检测结果柱状图；
图4为实施例3酵解液乙酸含量检测结果柱状图；
图5为实施例3肠道菌群酵解产物菌群结构测定图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对技术方案作进一步说明。
实施例1 苜蓿多糖的制备
步骤1：原料预处理：苜蓿原料于60℃鼓风干燥箱中干燥24 h，粉碎过40目筛，用石油醚进行回流脱脂至无色，过滤，残渣挥干石油醚后60℃干燥24 h，得苜蓿干粉。
步骤2：提取：称取苜蓿干粉50 g，按照料液比1:30加入pH5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再加入6%纤维素酶，50℃提取苜蓿多糖40 min，90℃灭酶活10 min，8000 r/min离心15min，收集上清液。上清液用旋转蒸发仪浓缩至原来体积的1/5，得到苜蓿多糖浓缩液。按照体积比1:4向浓缩液中加入95%乙醇，醇沉24 h，10000 r/min离心15 min，取沉淀经冷冻干燥得粗制苜蓿多糖。
步骤3：脱蛋白：将粗制苜蓿多糖加水溶解，按体积比4:1向溶液中加入Sevage试剂，振荡30min，离心取上层溶液，再加入Sevage试剂重复操作10次，直至无变性蛋白残留，溶液减压浓缩后加入95%乙醇醇沉24h，离心取沉淀得脱蛋白粗制苜蓿多糖。
步骤4：脱色：将脱蛋白粗制苜蓿多糖用50 g棉絮状DEAE-52纤维素（上海源叶生物科技有限公司）进行脱色处理，分别用水和NaCl溶液洗脱。将收集的水洗脱溶液浓缩、醇沉后得到水洗脱多糖，NaCl洗脱溶液浓缩、透析、醇沉后得到NaCl洗脱多糖。测得水洗脱多糖占总多糖质量的90%以上，而NaCl洗脱多糖为10%以下，因此仅采用水洗脱多糖作为脱色脱蛋白粗制苜蓿多糖。
步骤5：分离纯化：将脱色脱蛋白粗制苜蓿多糖配制成30 mg/mL溶液，用颗粒状DEAE-52纤维素（合肥博美生物科技有限公司）进行分离纯化，用水洗脱，按照10 mL/管收集，采用苯酚-硫酸法在490 nm下检测收集的样品吸光度值，绘制洗脱曲线，合并对称洗脱峰，合并溶液浓缩后冷冻干燥得到苜蓿多糖。
苜蓿多糖的结构表征：
红外光谱表征：苜蓿多糖的红外光谱如图1所示，3425.94 cm-1处吸收峰为-OH伸缩振动，2974.36 cm-1、2927.54 cm-1和2878.63 cm-1处吸收峰为C-H伸缩振动，1463.25 cm-1处吸收峰为C-H变角弯曲振动，1382.31 cm-1和1319.66 cm-1处吸收峰为C-H弯曲振动，1261.54 cm-1处吸收峰为C-O伸缩振动，1162.39 cm-1和1111.11 cm-1处吸收峰为醇羟基变角振动，1066.18 cm-1处吸收峰为吡喃糖环C-O-C中C-O伸缩振动，899.15 cm-1处吸收峰为β型糖苷键吸收峰，542.34 cm-1处吸收峰为吡喃型糖环特征，证明苜蓿多糖的成功制备。
分子量测定：选取分子量为T5、T10、T20、T40、T70、T100葡聚糖标准品，分别将其配制成2 mg/mL的标准溶液，用HPLC测定分子量。分析条件为：示差折光检测器，进样量20 μL，流速0.5 mL/min，流动相为超纯水，30℃分析30 min。苜蓿多糖制成2 mg/mL的溶液进样，用葡聚糖标准品得到的线性回归方程计算苜蓿多糖的分子量。
测得苜蓿多糖的分子量为5~6 KDa。
单糖组成成分分析：将苜蓿多糖置于三氟乙酸溶液中110℃水解5 h。将混合的单糖溶液与水解后的苜蓿多糖溶液进行PMP 衍生处理，经乙酸异戊酯、氯仿分离后的水溶液，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，进行HPLC分析。分析的条件为：进样量10 µL，流速1.0 mL/min，波长为250 nm，流动相为乙腈：0.1 mol/L 乙酸铵（83:17）。
HPLC图谱如图2所示，根据峰面积计算出单糖组成包括0.75 %甘露糖：81.02%葡萄糖：1.1%半乳糖。
实施例2苜蓿多糖的制备
与实施例1的区别在于：步骤2中按照料液比1:20加入pH5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再加入8%纤维素酶。
制得的苜蓿多糖的分子量为3~5 KDa，单糖组成包括1.16%甘露糖：68.57%葡萄糖：4.53%半乳糖。
实施例3 苜蓿多糖调节肠道菌群的应用
制备人体肠道菌群：从肠道健康且3个月内没有服用抗生素的三名志愿者取相同质量的新鲜粪便，混匀后立即加入体积分数为10%的D-PBS溶液，配制成质量分数为20%的固液混合物，用无菌玻璃棒搅拌均匀，四层无菌纱布过滤，收集过滤液即得人体肠道菌群。
体外发酵：将实施例1所得苜蓿多糖与酵解培养基混合均匀，配制成苜蓿多糖浓度为2%的培养液，9 mL/瓶分装至厌氧培养瓶中并灭菌。在厌氧且无菌条件下，将1 mL步骤1所得人体肠道菌群加入上述含培养液的厌氧培养瓶中，在37℃，120 rpm条件下摇床振荡培养，记为APS-E组。
酵解产物理化性质测定：培养0、6、12、24、48 h分别取样，4℃、8000 rpm离心10min，取上清液。用pH计测定酵解液的pH值。用HPLC检测乙酸含量。
酵解产物菌群结构测定：培养48 h后，取2 mL酵解产物，按照DNA提取试剂盒说明书提取酵解液中的DNA。使用引物F341和R806对16sRNA基因的V3-V4区进行PCR扩增。纯化产物用AMPure XP beads纯化，使用Illumina HiSeq 2500系统进行测序。
对比例1：与实施例3的区别在于：在体外发酵步骤中，用苜蓿多糖（分子量为60~100KDa，单糖组包括4.96%鼠李糖、9.84%葡萄糖醛酸、6.67%半乳糖醛酸、3.74%葡萄糖、13.94%半乳糖、0.29%木糖、15.36%阿拉伯糖）代替实施例1苜蓿多糖与酵解培养基混合均匀，配制成苜蓿多糖浓度为2%的培养液，记为APS-H组。
对比例2：与实施例3的区别在于：在体外发酵步骤中，用蒸馏水代替实施例1苜蓿多糖与酵解培养基混合均匀，配制成培养液，记为Blank组。
酵解液pH值检测结果如图3所示，Blank组维持pH 7.2~7.8，APS-H组维持pH 5.0~5.5，APS-E组维持pH 4.7~5.0。酵解液乙酸含量检测结果如图4所示，Blank组乙酸含量维持在约12 mmol/L，APS-H组乙酸含量维持在约15mmol/L，APS-E组乙酸含量维持在约30 mmol/L。说明苜蓿多糖能在酵解过程中分解产生乙酸等短链脂肪酸，降低肠道pH值抑制部分有害菌的繁衍，并参与体内能量代谢过程；而低分子量的苜蓿多糖的酵解产生短链脂肪酸、降低肠道的pH值作用更为显著。
酵解产物菌群结构测定结果如图5所示，相比于Blank组，APS-H组中Bifidobacterium（双歧杆菌属）由2.7%增加至5.6%，Lactobacillus（乳酸菌属）由0.0%增加至24.0%，Citrobacter（柠檬酸杆菌属）由9.7%降低至0.4%，Escherichia（埃希菌属）由29.0%降低至2.8%，说明苜蓿多糖具有调节肠道菌群的作用，促进双歧杆菌、乳酸菌等益生菌的增长，抑制柠檬酸杆菌、埃希菌属等致病菌的生长。APS-E组双歧杆菌属为17.0%，乳酸菌属为18.0%，柠檬酸杆菌属为1.1%，埃希菌属为7.3%，说明低分子量、单糖组成主要为葡萄糖的苜蓿多糖促进益生菌增长的调节作用更强，尤其是双歧杆菌属增长率，为APS-H组的3.0倍。
以上所述仅为本发明的优选实施例，本发明的保护范围并不限于此，本领域的技术人员根据本发明的精神和原则所作的任何修改、等同替换﹑改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种低分子量苜蓿多糖，其特征在于，分子量为3~6 KDa，单糖组成包括0.75~1.16%甘露糖、68.57~81.02%葡萄糖、1.10~4.53%半乳糖。
2.如权利要求1所述低分子量苜蓿多糖，其特征在于，所述分子量为5~6 KDa，单糖组成包括0.75%甘露糖、81.02%葡萄糖、1.1%半乳糖。
3.权利要求1所述低分子量苜蓿多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将苜蓿原料干燥、粉碎，石油醚回流脱脂，过滤、干燥后得苜蓿干粉；
步骤2：取步骤1所得苜蓿干粉，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再加入纤维素酶，提取苜蓿多糖；灭酶活后离心收集上清液，浓缩、醇沉、离心，沉淀经冷冻干燥得粗制苜蓿多糖；
步骤3：将步骤2所得粗制苜蓿多糖加水溶解，加入Sevage试剂，振荡、离心脱蛋白，浓缩、醇沉、离心，沉淀得脱蛋白粗制苜蓿多糖；
步骤4：将步骤3中的脱蛋白粗制苜蓿多糖用棉絮状DEAE-52纤维素进行脱色处理，分别用水和NaCl溶液洗脱；将收集的水洗脱液浓缩、醇沉后得到脱色脱蛋白粗制苜蓿多糖；
步骤5：将步骤4所得脱色脱蛋白粗制苜蓿多糖用颗粒状DEAE-52纤维素分离纯化，用水洗脱，合并对称洗脱峰溶液，浓缩、冷冻干燥得到低分子量苜蓿多糖。
4.如权利要求3所述低分子量苜蓿多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2中苜蓿干粉与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的料液比为1：20~30，纤维素酶用量为6~8%。
5.如权利要求3所述低分子量苜蓿多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2中苜蓿干粉与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的料液比为1：30，纤维素酶用量为6%。
6.权利要求1所述低分子量苜蓿多糖调节肠道菌群的应用，其特征在于，包括将低分子量苜蓿多糖与人体肠道菌群混合，促进益生菌的增长，抑制致病菌的生长，并酵解产生短链脂肪酸、降低肠道pH。
7.如权利要求6所述低分子量苜蓿多糖调节肠道菌群的应用，其特征在于，所述益生菌双歧杆菌比例增长1.9~14.3%，乳酸菌比例增长18.0~24.0%，所述致病菌柠檬酸杆菌比例下降8.6~9.3%，埃希菌比例下降21.7~26.2%。
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