CN112626148A - 一种合生元的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种合生元的制备方法，以桑叶为原料，经半纤维素酶水解，并通过纳滤、超滤及柱层析纯化得到桑叶低聚糖，然后以桑叶低聚糖为碳源富集具有调控糖脂代谢活性的肠道菌群，分离得到最显著富集的菌株，最后将纯化得到的桑叶低聚糖与分离得到的富集菌株共培养制备富含桑叶低聚糖和菌株的合生元。本发明合生元的制备方法简单，并且制备得到的合生元能够有效调控糖脂代谢活性。
Description
技术领域
本发明涉及合生元技术领域，更具体的说是涉及一种合生元的制备方法。
背景技术
桑叶多糖已被报道具有调控糖脂代谢等生物活性，但由于桑叶多糖分子量及粘度大，导致其在机体内生物利用度低，同时研究发现多糖含有大量的非α-1,4构型的糖苷键，不能被人体消化液完全降解，可能是被降解成小分子功能性低聚糖调控肠道菌群而发挥功效。
功能性低聚糖由于不能被人体胃肠消化液所降解，而不能被人体直接吸收利用，而是作为益生元，为肠道微生物的能源物质，调控肠道菌群，促进益生菌生长，抑制有害菌增殖影响肠稳态，从而发挥健康效应。益生菌由于可合成降解非α-1,4构型的糖苷键的消化酶，从而利用低聚糖，降低小肠隐窝深度，增加绒毛高度，增加小肠表面积，并通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进肠道营养物质的吸收，保持肠道健康。合生元则是将益生元和益生菌进行复合，通过特异性益生元和益生菌的结合，同时发挥益生元和益生菌的健康效应。合生元作为一种新型功能物质，广泛应用于于食品、保健品、饮料、医药、饲料添加剂等领域，市场前景良好，成为当前研究的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种具有调控糖脂代谢活性的桑叶低聚糖，并以此为碳源，富集具有调控糖脂代谢活性的益生菌，并将二者进行复合，最终得到调控糖脂代谢活性更强的合生元。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种合生元的制备方法，包括以下步骤：
(1)以干燥的桑叶为原料，经过水提多糖、半纤维素酶水解，以及经过纳滤、超滤，得到初步纯化的桑叶低聚糖溶液；
(2)将初步纯化的桑叶低聚糖溶液加入到DEAE-52层析柱中，以去离子水为洗脱剂，收集50-200min的洗脱液，浓缩，然后将浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中，以去离子水为洗脱剂，收集150-250min的洗脱液，浓缩，得到纯化后的桑叶低聚糖溶液；
(3)以纯化后的桑叶低聚糖溶液为单一碳源，替代MRS培养基中的葡萄糖，体外厌氧培养由链脲佐菌素霉素和高脂饲料诱导糖脂代谢紊乱的小鼠粪菌，富集具有调控糖脂代谢活性的肠道菌群，并通过划线分离法得到罗伊氏乳杆菌；
(4)将富集到的罗伊氏乳杆菌接种至以桑叶低聚糖溶液为碳源的培养基中进行发酵，经过冷冻喷雾干燥，得到具有调控糖脂代谢活性的合生元。
优选的，在上述一种合生元的制备方法中，步骤(1)具体包括以下步骤：
(1-1)以干燥的桑叶为原料，将10-15％(w/v)桑叶粉添加至pH4.5-5.0的磷酸缓冲溶液中，在60-70℃的条件下水提多糖6-8h，5000×g离心5min，将上清液浓缩，得到桑叶多糖溶液；
(1-2)取3-3.5％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.5-1％(w/v)，调整pH值为5.5-6.0，在45-50℃的条件下反应6-8h，8000×g离心5min，将上清液浓缩，得到低聚糖粗反应液；
(1-3)将低聚糖粗反应液依次经过纳滤、超滤，将低聚糖粗反应液中的单糖和未被酶降解且分子量大于2000Da的多糖去除，得到初步纯化的桑叶低聚糖溶液。
优选的，在上述一种合生元的制备方法中，步骤(2)中初步纯化的桑叶低聚糖溶液的质量浓度为10-20％。
上述技术方案的有益效果是：若初步纯化的桑叶低聚糖溶液的质量浓度过低，会影响纳滤和超滤效果；若浓度过高，容易产生传质阻力，导致纳滤和超滤时压力过大，对分离膜造成损伤。
优选的，在上述一种合生元的制备方法中，步骤(3)的培养基中桑叶低聚糖溶液的含量为10-20g/L。
上述技术方案的有益效果是：若培养基中桑叶低聚糖溶液的浓度过低，影响益生菌的富集；而浓度过高会导致益生菌质壁分离，抑制显著富集菌的生长。
优选的，在上述一种合生元的制备方法中，步骤(3)中所述小鼠粪菌的有效活菌总数≥108CFU/mL，培养时间为48-72h。
上述技术方案的有益效果是：益生菌数量过低时，影响显著富集菌的分离；培养时间过短，菌株处于迟滞期，而时间过长菌株处于衰亡期，都会影响菌株活性，经过大量试验验证之后培养时间48-72h时菌株活性最高。
优选的，在上述一种合生元的制备方法中，步骤(3)中富集到的肠道菌群包括尿气球菌、罗伊氏乳杆菌、约氏乳酸杆菌、粪肠球菌和候选单胞生糖菌。
优选的，在上述一种合生元的制备方法中，步骤(3)中富集分离到的罗伊氏乳杆菌的有效活菌总数为108-1010CFU/mL。
优选的，在上述一种合生元的制备方法中，步骤(4)的培养基中桑叶低聚糖溶液的含量为20-30g/L。
上述技术方案的有益效果是：若浓度过低，会降低益生菌生长速率，影响益生效果；浓度过高会导致益生菌质壁分离。
优选的，在上述一种合生元的制备方法中，步骤(4)中所述发酵温度为30-40℃，发酵时间为48-96h，pH控制在5.5-6.2。
上述技术方案的有益效果是：在此条件下，益生菌生长速率最快，活性最高。
本发明还提供了一种通过上述方法制备得到的合生元。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种合生元的制备方法，有益效果在于：
(1)本发明联合使用纳滤与超滤技术，大大简化了桑叶低聚糖的纯化步骤，并结合离子交换层析和葡聚糖凝胶色谱层析制备得到了纯度达到98％以上的功能性桑叶低聚糖；并且得到的桑叶低聚糖分子量均一，为1416Da，由摩尔质量百分比为20-25％的甘露糖、50-60％的葡萄糖、20-25％的半乳糖组成；
(2)本发明分离得到的桑叶低聚糖可以耐受人体消化液的降解，进入肠道调控菌群，并以依赖肠道菌群的方式发挥调控糖脂代谢活性的作用；
(3)本发明通过桑叶低聚糖从糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群中分离得到罗伊氏乳杆菌，并验证了其调控糖脂代谢活性，最终将二者进行复合，制备得到活性更强的合生元。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1桑叶低聚糖MLO1-2的分离纯化，其中(a)DEAE-52(b)G25；
图2附图为本发明实施例1桑叶低聚糖MLO1-2的单糖组成，其中(a)标准物质(b)MLO1-2；
图3附图为本发明实施例1桑叶低聚糖MLO1-2在不同消化液(a)唾液、(b)胃液、(c)肠液中分子量和还原糖(d)含量的变化；
图4附图为本发明实施例1桑叶低聚糖MLO1-2调控糖脂代谢活性的曲线图，其中(a)体重(b)血糖；
图5附图为本发明实施例1桑叶低聚糖MLO1-2显著富集糖脂代谢紊乱小鼠菌群；
图6附图为本发明实施例1-3及对比例1-2对内脏脂肪的影响。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到10％(w/v)溶液，在pH4.9、80℃下进行水提多糖，提取时间为8h，5000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶多糖溶液；
取3％桑叶多糖溶液，加入1％半纤维素酶，反应温度为50℃，反应时间为8h，反应pH 6.0，8000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶低聚糖粗反应液；
将桑叶低聚糖粗反应液通过联合使用纳滤(200Da)和超滤(2000Da)膜系统将低聚糖粗反应液中的单糖和未被酶降解且分子量大于2000Da的多糖去除，得到初步纯化的低聚糖溶液；
将上述初步纯化的低聚糖溶液(20％，w/v)加入到DEAE-52层析柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集50-200min的洗脱液MLO1，浓缩；随后将5％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集150-250min的洗脱液，浓缩得到分离纯化后的桑叶低聚糖MLO1-2溶液。
以20g/L桑叶低聚糖MLO1-2为单一碳源，替代MRS培养基中的葡萄糖，并将其用于体外厌氧培养糖脂代谢紊乱小鼠粪菌(108CFU/mL)72h，通过划线分离法分离罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reutri)；
取30g/L上述桑叶低聚糖MLO1-2溶液，加入1010CFU/mL罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reutri)，在37℃，pH 6.0的条件下发酵72h，最终冷冻喷雾干燥，得到富含桑叶低聚糖和罗伊氏乳杆菌的合生元。
实施例2
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到12.5％(w/v)溶液，在pH4.8、70℃下进行水提多糖，提取时间为7h，5000×g离心5min后取上清液，浓缩得到桑叶多糖溶液；
取3.25％桑叶多糖溶液，加入0.75％半纤维素酶，反应温度为45℃，反应时间为7h，反应pH 5.7，8000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶低聚糖粗反应液；
将桑叶低聚糖粗反应液通过联合使用纳滤(200Da)和超滤(2000Da)膜系统将低聚糖粗反应液中的单糖和未被酶降解且分子量大于2000Da的多糖去除，得到初步纯化的低聚糖溶液；
将上述初步纯化的低聚糖溶液(15％，w/v)加入到DEAE-52层析柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1.5mL/min洗脱，收集50-200min的洗脱液MLO1，浓缩；随后将2.5％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1.5mL/min洗脱，收集150-250min的洗脱液，浓缩，得到分离纯化后的桑叶低聚糖MLO1-2溶液。
以15g/L桑叶低聚糖MLO1-2为单一碳源，替代MRS培养基中的葡萄糖，并将其用于体外厌氧培养糖脂代谢紊乱小鼠粪菌(108CFU/mL)60h，通过划线分离法分离罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reutri)；
取25g/L上述桑叶低聚糖MLO1-2溶液，加入109CFU/mL罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reutri)，在40℃，pH 5.5的条件下发酵60h，最终冷冻喷雾干燥，得到富含桑叶低聚糖和罗伊氏乳杆菌的合生元。
实施例3
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到15％(w/v)溶液，在pH4.5、60℃下进行水提多糖，提取时间为6h，5000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶多糖溶液；
取3.5％桑叶多糖溶液，加入0.5％半纤维素酶，反应温度为45℃，反应时间为6h，反应pH 5.5，8000×g离心5min取上清液，浓缩，得到桑叶低聚糖粗反应液；
将上述桑叶低聚糖粗反应液通过联合使用纳滤(200Da)和超滤(2000Da)膜系统将低聚糖粗反应液中的单糖和未被酶降解且分子量大于2000Da的多糖去除，得到初步纯化的低聚糖溶液；
将上述初步纯化的低聚糖溶液(10％，w/v)加入到DEAE-52层析柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为2mL/min洗脱，收集50-200min的洗脱液MLO1，浓缩；随后将1％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为2mL/min洗脱，收集150-250min的洗脱液，浓缩得到分离纯化后的桑叶低聚糖MLO1-2溶液；
以10g/L桑叶低聚糖MLO1-2为单一碳源，替代MRS培养基中的葡萄糖，并将其用于体外厌氧培养糖脂代谢紊乱小鼠粪菌(108CFU/mL)48h，通过划线分离法分离罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reutri)；
取20g/L上述桑叶低聚糖MLO1-2溶液，加入108CFU/mL罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reutri)，在30℃，pH 6.2的条件下发酵48h，最终冷冻喷雾干燥，得到富含桑叶低聚糖和罗伊氏乳杆菌的合生元。
对比例1
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到10％(w/v)溶液，在pH4.9、80℃下水提多糖，提取时间为8h，5000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶多糖溶液；
取3％桑叶多糖溶液，加入1％半纤维素酶，反应温度为50℃，反应时间为8h，反应pH 6.0，8000×g离心5min后取上清液，得到桑叶低聚糖粗反应液；
将上述桑叶低聚糖粗反应液通过联合使用纳滤(200Da)和超滤(2000Da)膜系统将低聚糖粗反应液中的单糖和未被酶降解且分子量大于2000Da的多糖去除，得到初步纯化的低聚糖溶液；
将上述初步纯化的低聚糖溶液(20％，w/v)加入到DEAE-52层析柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集50-200min的洗脱液，浓缩；随后将5％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集150-250min的洗脱液，浓缩得到分离纯化后的桑叶低聚糖溶液。
取30g/L上述桑叶低聚糖溶液冷冻喷雾干燥，得到单纯的桑叶低聚糖。
对比例2
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到10％(w/v)溶液，在pH4.9、80℃下水提多糖，提取时间为8h，5000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶多糖溶液；
取3％桑叶多糖溶液，加入1％半纤维素酶，反应温度为50℃，反应时间为8h，反应pH 6.0，8000×g离心5min后取上清液，得到桑叶低聚糖粗反应液；
将上述桑叶低聚糖粗反应液通过联合使用纳滤(200Da)和超滤(2000Da)膜系统将低聚糖粗反应液中的单糖和未被酶降解且分子量大于2000Da的多糖去除，得到初步纯化的低聚糖溶液；
将上述初步纯化的低聚糖溶液(20％，w/v)加入到DEAE-52层析柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集50-200min的洗脱液，浓缩；随后将5％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集150-250min的洗脱液，浓缩得到分离纯化后的桑叶低聚糖溶液；
以20g/L桑叶低聚糖为单一碳源，替代MRS培养基中的葡萄糖，并将其用于体外厌氧培养糖脂代谢紊乱小鼠粪菌(108CFU/mL)72h，通过划线分离法分离罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reutri)；
取30g/L上述葡萄糖溶液，加入1010CFU/mL罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreutri)，在37℃，pH 6.0的条件下发酵72h，最终冷冻喷雾干燥，得到罗伊氏乳杆菌粉。
对实施例1-3及对比例1制备得到的桑叶低聚糖的纯度进行分析检测，测试结果参见表1.
表1测试结果
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 对比例1 | |
| 纯度(％) | 96.3 | 95.2 | 93.5 | 95.7 |
为了进一步说明本发明所能达到的效果，进行如下实验：
取70只8周龄雄性C57BL/6J小鼠(20±2g)分为7组，每组10只，分别为正常组、模型组、实验组(实施例1-3、对比例1及2)，正常组喂养普通饲料，模型组和实验组采用60％高脂饲料喂养小鼠诱导糖脂代谢紊乱模型，模型建立后，在喂养高脂饲料第二周开始，实验组灌胃实施例1-3及对比例1-2的产品(50mg/kg·bw)六周，同时正常组和模型组灌胃等剂量的生理盐水，观察小鼠体重、血糖和血脂变化，具体结果参见表2。
表2测试结果
| 体重 | 血糖 | TG | TC | HDL-C | LDL-C | |
| 正常组 | 23.85±0.16a | 4.98±0.46a | 1.91±0.20a | 6.11±0.92ab | 4.95±0.47c | 0.29±0.08b |
| 模型组 | 28.13±0.57d | 7.32±0.12d | 3.92±0.25c | 8.59±0.71c | 2.74±0.50a | 4.06±0.10e |
| 实施例1 | 24.11±0.15b | 6.03±0.17c | 1.96±0.23b | 6.01±0.15a | 4.96±0.32c | 0.16±0.05a |
| 实施例2 | 24.22±0.17b | 6.14±0.09bc | 1.99±0.13b | 6.05±0.13a | 4.90±0.17c | 0.25±0.07b |
| 实施例3 | 24.35±0.11bc | 6.25±0.16bc | 2.03±0.28b | 6.11±0.21a | 4.87±0.26c | 0.32±0.05b |
| 对比例1 | 24.53±0.13c | 6.40±0.18b | 2.04±0.31b | 6.55±0.47b | 4.86±0.25c | 0.76±0.07c |
| 对比例2 | 24.75±0.32c | 6.75±0.25b | 2.55±0.41b | 6.95±0.36b | 4.58±0.33b | 1.21±0.16d |
由表1可知，实施例1-3及对比例1-2都可以显著降低糖脂代谢紊乱小鼠的体重、血糖、TG、TC、HDL-C和LDL-C水平(P<0.05)，且实施例1-3降低体重、血糖、TC、LDL-C及提高HDL-C效果明显优于对比例1-2(P<0.05)，说明桑叶低聚糖与罗伊氏乳杆菌具有协同调控糖脂代谢活性的作用。
参见附图6，实施例1-3及对比例1-2对内脏脂肪的影响(即各自最终产品调控糖脂代谢活性)，可以发现，实施例1-3与对比例1-2都可以降低内脏脂肪细胞的大小(P<0.05)，且实施例1-3效果优于于对比例1-2(P<0.05)。
另外，本发明还专门针对制备得到的桑叶低聚糖进行了各种性能指标的测试分析，测试标准及分析结果如下：
(1)总糖的测定方法—苯酚-硫酸法：
取2mL不同浓度的葡萄糖溶液(0-400μg/mL)，依次加入1.0mL5％苯酚溶液，5mL浓硫酸，振荡摇匀，40℃下反应15min，以蒸馏水作空白对照，490nm下测定吸光值，绘制标准曲线。
样品处理：2mL一定浓度的样品+1mL 5％苯酚溶液+5mL浓硫酸，振荡摇匀，40℃下反应15min，测吸光值，计算出样品中总糖的含量。
(2)还原糖的测定方法：
取2mL不同浓度的葡萄糖溶液(0-500μg/mL)，加入3.0mL DNS溶液，振荡摇匀，沸水浴中反应10min，冷却后定容至15mL，以蒸馏水作空白对照，于分光光度计540nm波长下测吸光度，绘制标准曲线。
样品处理：2mL一定浓度的样品+3.0mL DNS溶液，振荡摇匀，沸水浴中反应10min，冷却后定容至15mL，测吸光值，并计算出样品中还原糖的含量。
(3)多糖含量的测定：多糖含量＝多糖提取液总糖含量-多糖提取液中还原糖含量。
(4)低聚糖含量测定：低聚糖含量＝水解反应液中总糖含量-水解反应液中还原糖含量。
(5)低聚糖纯度分析：
将待测样品用0.22μm滤膜过滤后用于高效液相色谱分析低聚糖纯度，色谱条件为：检测器为蒸发光检测器，ELSD漂移管温度为45℃；色谱柱型号为Shodex AsahipakNH2P-504E(4.6mm×250mm，5μm)，柱温30℃；流动相为75％乙腈，流速为1mL/min，进样量为20μL，以聚合度为2-10的葡聚糖作为标准品。
(6)16S rDNA法
利用细菌DNA提取试剂盒提取发酵液中菌体16S rDNA，设计V3-V4高变区序列引物进行PCR扩增，然后构建Miseq文库，采用Illumina PE300测序。
参见图5，实施例1得到的桑叶低聚糖能显著富集Aerococcus urinaeequi,Lactobacillus reutri,Lactobacillus johnsonii,Enterococcus faecalis,CandidatusSaccharimonas。
(7)分子量的测定
低聚糖分子量采用Waters公司的GPC凝胶渗透色谱仪进行测定，色谱柱为APCAQ450,Acquity APC AQ 125和Acquity APC AQ 45串联柱，流动相为去离子水，流速为0.1mol/L。
参见附图1，实施例1得到的桑叶低聚糖的分子量为1416Da。
(8)单糖组成分析
将100μL三氟乙酸(4mol/L)加入至100μL 5mg/mL低聚糖溶液中，在120℃下水解2h，多余三氟乙酸通过氮吹仪除去，将水解物溶液125μL NaOH(0.12mol/L)，随后加入50μLPMP(0.5mol/L)于70℃衍生化100min，衍生化后加入1mL氯仿萃取过量的PMP三次，水层过0.45μm滤膜进行单糖组成分析，采用安捷伦1260液相色谱仪进行测定，配备Eclipse PlusC18柱(4.6×250mm,5μm)，流动相为0.1mol/L醋酸铵(pH 6.7)与乙腈13:87(v/v)，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为245nm。
参见附图2，实施例1得到的桑叶低聚糖的单糖组成为甘露糖、葡萄糖及半乳糖，各单糖的摩尔质量百分比含量分别为22.2％、55.6％、22.2％。
(9)模拟消化液消化
将5.0mL低聚糖溶液(2mg/mL)置于5.0mL模拟消化液中消化，分别于0.5h、1h、2h、4h和6h取样测定其分子量及还原糖含量。
模拟消化液的制备：
唾液：收集近一个月内未服用抗生素的健康志愿者唾液，5000×g离心10min取上清液。
模拟胃液：由3.1mg/mL NaCl、1.1mg/mL KCl、0.25mg/mLCaCl2和0.6mg/mL NaHCO3组成，然后于150mL模拟胃液中加入37.5mg胃脂肪酶、35.4mg胃蛋白酶及1.5mLCH3COONa(1mol/L，pH 5)溶液，最终用0.1mol/L HCl将模拟液pH调至3.0。
模拟肠液：由5.4mg/mL NaCl、0.65mg/mL KCl和0.33mg/mLCaCl2组成，用0.1mol/LNaOH调pH至7.0，随后在100g模拟肠液中加入200g胆盐(4％，w/w)、100g胰酶溶液(7％，w/w)和1.3mg胰蛋白酶，最后用0.1mol/L NaOH将模拟液pH调至7.5。
参见附图3，实施例1得到的桑叶低聚糖在唾液、人工模拟胃液及肠液中分子量基本不变化，且模拟液中还原糖含量无显著变化，结果表明其能耐受唾液、人工模拟胃液及肠液消化降解，最终达到肠道被肠道菌群分解利用，发挥调控肠道菌群的功效。
(9)桑叶低聚糖调控糖脂代谢活性
实验动物C57BL/6J分为8组，每组10只，分别为正常组、模型组、桑叶低聚糖MLO1-2处理组、抗生素处理组、桑叶低聚糖MLO1-2+抗生素处理组，利用高脂饲料构建糖脂代谢紊乱模型，分别给予实验组灌胃50mg/kg/d桑叶低聚糖MLO1、50mg/kg/d桑叶低聚糖MLO1+100μg/mL抗生素，空白组灌胃相同剂量的生理盐水，实验周期共计2个月。观察小鼠血糖变化及体重；并取内脏脂肪，通过4％多聚甲醛固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡、苏木精-伊红染色、脱水、透明、封片等步骤，随后在光学显微镜下观察并拍照。
参见附图4，可以发现，实施例1得到的桑叶低聚糖可以显著抑制小鼠体重和血糖的增加，并以依赖肠道菌群的方式发挥调控糖脂代谢的活性。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的方案而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种合生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以干燥的桑叶为原料，经过水提多糖、半纤维素酶水解，以及经过纳滤、超滤，得到初步纯化的桑叶低聚糖溶液；
(2)将初步纯化的桑叶低聚糖溶液加入到DEAE-52层析柱中，以去离子水为洗脱剂，收集50-200min的洗脱液，浓缩，然后将浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中，以去离子水为洗脱剂，收集150-250min的洗脱液，浓缩，得到纯化后的桑叶低聚糖溶液；
(3)以纯化后的桑叶低聚糖溶液为单一碳源，替代MRS培养基中的葡萄糖，体外厌氧培养糖脂代谢紊乱的小鼠粪菌，富集具有调控糖脂代谢活性的肠道菌群，并通过划线分离法得到罗伊氏乳杆菌；
(4)将富集到的罗伊氏乳杆菌接种至以桑叶低聚糖溶液为碳源的培养基中进行发酵，经过冷冻喷雾干燥，得到具有调控糖脂代谢活性的合生元。
2.根据权利要求1所述的一种合生元的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括以下步骤：
(1-1)以干燥的桑叶为原料，将10-15％(w/v)桑叶粉添加至pH4.5-5.0的磷酸缓冲溶液中，在60-70℃的条件下水提多糖6-8h，5000×g离心5min，将上清液浓缩，得到桑叶多糖溶液；
(1-2)取3-3.5％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.5-1％(w/v)，调整pH值为5.5-6.0，在45-50℃的条件下反应6-8h，8000×g离心5min，将上清液浓缩，得到低聚糖粗反应液；
(1-3)将低聚糖粗反应液依次经过纳滤、超滤，将低聚糖粗反应液中的单糖和未被酶降解且分子量大于2000Da的多糖去除，得到初步纯化的桑叶低聚糖溶液。
3.根据权利要求1所述的一种合生元的制备方法，其特征在于，步骤(2)中初步纯化的桑叶低聚糖溶液的质量浓度为10-20％。
4.根据权利要求1所述的一种合生元的制备方法，其特征在于，步骤(3)的培养基中桑叶低聚糖溶液的含量为10-20g/L。
5.根据权利要求1所述的一种合生元的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述小鼠粪菌的有效活菌总数≥108CFU/mL，培养时间为48-72h。
6.根据权利要求1所述的一种合生元的制备方法，其特征在于，步骤(3)中富集到的肠道菌群包括尿气球菌、罗伊氏乳杆菌、约氏乳酸杆菌、粪肠球菌和候选单胞生糖菌。
7.根据权利要求1所述的一种合生元的制备方法，其特征在于，步骤(3)中富集分离到的罗伊氏乳杆菌的有效活菌总数为108-1010CFU/mL。
8.根据权利要求1所述的一种合生元的制备方法，其特征在于，步骤(4)的培养基中桑叶低聚糖溶液的含量为20-30g/L。
9.根据权利要求1所述的一种合生元的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述发酵温度为30-40℃，发酵时间为48-96h，pH控制在5.5-6.2。
10.一种权利要求1-9任一项所述的方法制备得到的合生元。
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