KR20130079227A - 신규한 홍삼 발효용 미생물, 이를 이용한 홍삼 발효액 및 홍삼 발효 음료 - Google Patents

신규한 홍삼 발효용 미생물, 이를 이용한 홍삼 발효액 및 홍삼 발효 음료 Download PDF

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Abstract

서열 번호 8의 서열을 갖는, 홍삼 발효용 미생물에 관한 것이다.

Description

신규한 홍삼 발효용 미생물, 이를 이용한 홍삼 발효액 및 홍삼 발효 음료{NOVEL MICROORGANISM FOR RED GINSENG FERMENTING, FERMENT SOLUTION AND FERMENTATIVE RED GINSENG DRINK USING THE SAME}
본 발명은 신규한 홍삼 발효용 미생물, 이를 이용한 홍삼 발효액 제조방법 및 홍삼 발효 음료에 관한 것이다.
홍삼의 사포닌은 피로 회복, 면역력 증진, 혈행 개선 등의 효과가 입증되었을 뿐만 아니라, 노화방지, 간 기능보호, 혈액순환 개선, 치매, 간 기능 개선 등 지속적인 연구 결과가 보고되고 있다.
특히, 홍삼의 사포닌 중 흡수가 어려운 메이져(major) 사포닌 (Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 및 Rd)이 가수 분해되어 생성된 마이너(minor) 사포닌 (Rg3, Rh2, Compound-K등)은, 마우스에서 종양 세포 전이의 저해, 시험관 내 종양 세포 침입 저해, 암세포 세포자살 유발, 암세포 전이 억제, 혈압 강하, 카테콜아민(catecholamine) 분비 억제, 진통제 활성 및 면역력 증강 등 탁월한 약리 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다.
이렇게 마이너(minor) 사포닌의 우수한 약리 활성이 검증됨에 따라 마이너(minor) 사포닌 생성을 위한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 주로 산 가수분해, 열처리, 효소가수분해 및 유기합성 등의 방법이 시도되었다. 그 중에서도 효소에 의한 가수분해 방법은 낮은 온도에서 진행할 수 있고 조작이 간편하며 효소의 기질특이성 때문에 부산물이 적다는 점에서 마이너(minor) 사포닌 생산에 가장 적합한 방법이라 할 수 있다. 지금까지의 효소에 의한 사포닌의 전환연구는 주로 장내 세균, 토양 미생물 및 식물 조직에서 분리한 미생물에 집중되어 있는 실정이다. 그러나 이들 방법들은 식용에 적합하지 않다는 점에서 실용화에 다소 어려움이 있다.
한편, 유산균(lactic acid bacteria)은 유산(lactic acid)을 다량으로 생성하는 세균을 의미하며, 식품 내의 당(glucose)을 이용하여 유산을 생산하여 식품의 맛을 개선할 뿐 아니라 식품을 산성화시켜 다른 유해미생물이 잘 자라지 못하게 하는 역할을 한다. 또한 유산균은 각종 동물의 장관 내에 서식하여 소화관내의 점막의 보호 및 장내 이상발효의 개선, 소화흡수 촉진, 비타민 합성, 칼슘의 체내흡수 촉진 등 여러 가지 유익한 작용을 하며, 홍삼의 메이져(major) 사포닌으로부터의 마이너(minor) 사포닌 생성을 위해 활용 가능하다.
이러한, 유산균의 배양은 대표적 유산균 상업용 배지인 MRS배지 등을 이용하는 것이 일반적이나, 이러한 상업용 배지는 그 조성물이나 화학적 가공처리 방법에 있어서 어떠한 재료를 사용하였는지, 어떠한 화학적 처리를 하였는지 알 수가 없어 식용으로 사용하기에는 부적합하다. 일예로, 대한민국 등록특허 제0680318호에는, 트립톤, 소이톤, 펩톤 등을 포함하는 미생물 배양용 영양배지에 대한 내용이 기재되어 있으나, 상기 트립톤, 소이톤, 펩톤 등을 제조하는 과정이 매우 복잡할 뿐 아니라, 상기 제조 과정에 수산화나트륨 등의 강염기를 처리하는 등 인체에 해가 되는 화학적 처리 과정이 포함되어 있어, 이와 같은 배지에서 배양된 미생물은 바로 식용으로 사용할 수 없는 단점이 있다.
따라서, 홍삼의 메이져(major) 사포닌으로부터의 마이너(minor) 사포닌 생성을 위한 신규한 유산균 균주, 이를 이용한 홍삼 발효액의 제조 방법 및 식용으로 바로 이용할 수 있도록 인체에 무해한 소재를 사용한 유산균 배양용 배지의 개발이 요청된다.
대한민국 등록특허 제0680318호
본 발명은 홍삼 추출액에 포함되어 있는 기능성 마이너(minor) 사포닌의 전환 효율을 상승키는, 신규한 홍삼 발효용 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 상기 미생물을 이용한 홍삼 발효액 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 홍삼 추출액의 기능성 마이너(minor) 사포닌 함량을 극대화하여 면역 활성 및 항암 활성을 가지며, 안전하게 섭취할 수 있는 홍삼 발효 음료를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 서열 번호 8의 서열을 갖는, 홍삼 발효용 미생물을 제공한다.
본 발명의 일 예에 의하면, 상기 미생물은, 홍삼에 포함된 Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 및 Rd 중 하나 이상의 메이져 사포닌을 F2, Rg3, Rh2 및 컴파운드-k(Compound-K) 중 하나 이상의 마이너 사포닌으로 전환시키는 특성을 나타내는 것 일 수 있다.
본 발명의 일 예에 의하면, 상기 미생물은 상기 미생물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei) 의 염기 서열과 상동성 99% 이상을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 의하면, 상기 미생물은 KCTC12108BP의 기탁 번호를 갖는 것일 수 있다.
본 발명은, 상기 미생물을 홍삼 추출액에 가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 홍삼 발효액 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 예에 의하면, 상기 발효시키는 단계 후 효소를 첨가하여 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예에 의하면, 상기 발효시 설탕(sucrose) 또는 염(NaCl)을 첨가할 수 있다.
본 발명의 일 예에 의하면, 상기 발효시 사용되는 미생물 배양액이 배추, 무, 양상추, 양배추, 당근, 바나나, 감자, 상추로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터 제조된 것 일일 수 있다.
본 발명은, 상기에서 제조된 홍삼 발효액을 포함하는, 면역 증강용 홍삼 발효 음료를 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기에서 제조된 홍삼 발효액을 포함하는, 암 개선 및 예방용 홍삼 발효 음료를 제공한다.
본 발명의 신규한 홍삼 발효용 미생물은, 홍삼에 포함된 메이져 사포닌을 매우 우수한 효율로 마이너 사포닌으로 전환시키는 특성을 가지며, 이에 따라 체내의 사포닌 흡수 효율을 상승시키는 효과를 제공한다.
또한, 본 발명의 홍삼 발효액 제조방법은, 본 발명의 신규한 홍삼 발효용 미생물의 발효 환경을 최적화시켜 마이너(minor) 사포닌으로의 전환 효율을 2 ~ 3배 더욱 증가시키는 효과를 제공할 뿐 아니라 식용 가능한 미생물 배양 배지를 사용함으로서 식품에 대한 안전성과 원가 절감의 효과를 갖는다. 또한, 본 발명의 홍삼 발효 음료는 매우 우수한 면역활성 및 항암활성(암 개선 및 예방 효과)을 갖는다.
도 1은 본 발명에 의하여 선별된 WJ-1, 2, 4, 6, 23, 33 발효 균주의 16S DNA 염기서열을 나타낸 도면으로서, 도 1a는 WJ-1 균주, 1b는 WJ-2 균주, 도 1c는 WJ-4 균주, 도 1d는 WJ-6 균주, 도 1e는 WJ-23 균주, 도 1f는 WJ-33 균주의 16S rDNA 염기 서열이다.
도 2는 본 발명에 의하여 선별된 발효 균주의 minor 사포닌으로의 전환 능력을 TLC 크로마토그램을 이용하여 관찰한 결과로서,
도 2a는 WJ-1, 2, 4, 및 6 균주의 홍삼 추출액에서 major 사포닌을 minor 사포닌으로 전환 효과를 나타내는 사진이며(1번 레인: WJ-1, 2번 레인: WJ-2, 3번 레인: WJ-3, 4번 레인: WJ-4, 5번 레인: 스탠다드, 6번 레인: WJ-5, 7번 레인: WJ-6, 8번 레인: WJ-8, 9번 레인: WJ-9),
도 2b WJ-23, WJ-33 균주의 홍삼 추출액에서 major 사포닌을 minor 사포닌으로 전환 효과를 나타내는 사진이다(1번 레인: WJ-32, 2번 레인: WJ-33, 3번 레인: WJ-34, 4번 레인: WJ-35, 5번 레인: Standard, 6번 레인: WJ-36).
도 3은 WJ-33 균주를 이용한 발효 과정 시, Sucrose 또는 NaCl을 각각 첨가하였을 때의 minor 사포닌으로의 전환되는 것을 나타내는 결과 사진이다(1번 레인: WJ-32, 2번 레인: WJ-33, 3번 레인: WJ-34, 4번 레인: WJ-35, 5번 레인: Standard, 6번 레인: WJ-36).
도 4는 본 발명에 의하여 선별된 발효 균주와 유도 인자로서 설탕(sucrose) 또는 염(NaCl)을 함께 이용하였을 때, minor 사포닌으로의 전환 효율을 관찰한 결과로서,
도 4a는 WJ-2 또는 WJ-4 균주와 설탕(sucrose)을 홍삼 추출액에 함께 처리하였을 때의 minor 사포닌의 생성을 관찰한 사진이며(1번 레인: WJ-1, 2번 레인: WJ-2, 3번 레인: WJ-3, 4번 레인: WJ-4, 5번 레인: 스탠다드, 6번 레인: WJ-5, 7번 레인: WJ-6, 8번 레인: WJ-8, 9번 레인: WJ-9),
4b는 WJ-2 또는 WJ-4 균주와 염(NaCl)을 홍삼 추출액에 함께 처리하였을 때의 minor 사포닌의 생성을 관찰한 사진이다(1번 레인: WJ-1, 2번 레인: WJ-2 3번 레인: WJ-3, 4번 레인: WJ-4, 5번 레인: 스탠다드, 6번 레인: WJ-5, 7번 레인: WJ-6, 8번 레인: WJ-8, 9번 레인: WJ-9).
도 5는 본 발명에 의하여 선별된 발효 균주로 발효 후 스크리닝한 Enzyme 함께 이용하였을 때, minor 사포닌으로의 전환 효율을 관찰한 결과이다.(각 레인별로
%를 다르게 접종 반응 시켰다.)
도 6는 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)의 NO 생성량 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)의 세포 생존률 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)의 TNF-α 발현량 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 9은 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)의 Phagocytosis activity 확인한 결과이다.
(Wild type; DMEM Media (10% FBS), P-CON; Zymosan,
I-CON; DMEM Media (10% FBS) + Inhibitor (2μM / 24hr) + zymosan,
홍삼; 미발효 홍삼 추출액 + zymosan,
발효홍삼 ; 본 발명의 홍삼 발효액 + zymosan)
도 10은 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)을 경구투여 한 마우스의 비장세포 증식능 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)을 경구투여 한 마우스 복강대식세포에서의 TNF-α 발현 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)을 경구투여 한 마우스 복강대식세포에서의 IL-1β 발현 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)을 경구투여 한 마우스 복강대식세포에서의 IL-6 발현 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)을 경구투여 한 마우스 혈장에서의 Compound K 함량 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)의 폐암세포 증식 억제 활성 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 16는 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)의 위암세포 증식 억제 활성 확인 결과
도 17은 본 발명의 홍삼 발효액 (“발효 홍삼”) 및 미발효 홍삼 추출액 (“홍삼”)의 대장암세포 증식 억제 활성 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 식물성 소재를 종류별로 각각 첨가한 배지에, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)를 배양한 후 O·D값을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 당을 종류별로 각각 첨가한 배지에, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)를 배양한 후 O·D값을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 20은 염분 및 영양성분을 농도별로 각각 첨가한 배지에, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)를 배양한 후 O·D값을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 식물성 소재를 추가 첨가한 배지에, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)를 배양한 후 O·D값을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 22은 식물성 소재 혼합 첨가한 배지에, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)를 24h 동안 배양한 후 O·D값을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은 신규한 미생물, 이를 이용한 홍삼 발효액의 제조방법 및 홍삼 발효 음료에 대한 것이다.
본 발명의 신규한 미생물은, 홍삼에 포함된 메이져 사포닌을 고효율로 마이너 사포닌으로 전환시키는 특성을 갖는 것으로, 홍삼막걸리 등에서 분리된 것일 수 있다. 본 발명의 신규한 미생물을 이용하여 홍삼을 발효하여 음료를 제조하는 경우, 마이너 사포닌이 고함량 함유되어, 우수한 면역 증강 효과 및 항함 효능을 나타낸다.
본 발명의 메이져 사포닌은, Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 및 Rd 중 하나 이상일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 마이너 사포닌은 F2, Rg3, Rh2 및 컴파운드-k(Compound-K) 중 하나 이상일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 신규한 미생물은 신규한 유산균일 수 있으며, 구체적으로, 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 파라부크네리(Lactobacillus parabuchneri), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei), 락토바실러스 하빈엔시스(Lactobacillus harbinensis) 또는 효모균 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae CBS405)의 염기 서열과 상동성 99% 이상을 나타내는 것이 바람직하며, 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 파라부크네리(Lactobacillus parabuchneri), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei), 락토바실러스 하빈엔시스(Lactobacillus harbinensis) 또는 효모균 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae CBS405)에 비해 현저히 우수한 마이너 사포닌 전환 효율을 나타내는 신규한 균주이다. 즉, 본 발명의 신규한 미생물은, 홍삼에 포함된 Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 및 Rd 중 하나 이상의 메이져 사포닌을 F2, Rg3, Rh2 및 컴파운드-k(Compound-K) 중 하나 이상의 마이너 사포닌으로 전환시키는 특성을 나타내는 것 일 수 있다. 특히, 본 발명의 신규한 미생물은, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)와 상동성 99%이상을 나타내는 신규 균주인 것이 바람직하다.
구체적으로, 상기 미생물은 서열 번호 3 내지 8 중 어느 하나의 서열을 갖는 것일 수 있으며, 특히, 서열 번호 8인 것이 바람직하다. 또한, 가장 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 KCTC12108BP의 기탁 번호를 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기 신규한 미생물을 홍삼 추출액에 가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 홍삼 발효액 제조방법에 대한 것이다. 본 발명의 일 예에 의하면, 상기 미생물은 홍삼 추출액 총 중량을 기준으로 0.001 ~ 3 %(v/w)로 접종되는 것일 수 있다.
본 발명의 홍삼 추출액은 홍삼으로부터 유효성분을 추출하기 위해 공지의 방법으로 수득한 추출액일 수 있다. 또한, 본 발명의 홍삼 추출액은, 홍삼으로부터 추출된 추출액을 그대로 사용할 수 있고, 농축하여 사용할 수 있고, 상기 홍삼 추출액 또는 농축된 홍삼 추출액을 희석하여 사용할 수 있다. 위와 같이 희석하여 사용하는 경우, 3brix에서 15brix까지 희석하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 홍삼 발효액 제조방법은, 설탕(sucrose) 또는 염(NaCl)을 홍삼 발효액 부피를 기준으로 0.001 ~ 3 %(v/v)로 더 첨가하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 신규한 미생물에 의한 홍삼 발효 후 사포닌(saponin) 전환 능력을 배가 시키기 위하여, 상기 홍삼 발효액에, 식용 가능 효소(Enzyme)를 더 첨가할 수 있으며, 상기 효소는 식용 가능한 효소이면 특별히 한정되지 않는다.
한편, 상기 발효 시 사용되는 미생물 배양액이 식용 가능한 물질로부터 만들어진 배양액일 수 있다. 상기 식용 가능한 물질은 식물성 소재; 당원; 및 영양성분을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 식물성 소재는 배추, 무, 양상추, 양배추, 당근, 바나나, 감자 및 상추 중 하나 이상일 수 있으며, 특히 무가 바람직하다. 또한, 식물성 소재로 무 및 당근 및 바나나 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 식물성 소재는 미생물 배양용 배지 조성물 총 중량 대비 3 ~ 25%의 중량을 첨가하는 것이 바람직하며, 이는 여러 식물성 소재가 혼합되어 에너지 원으로 사용되기 때문이다. 상기 식물성 소재는 농축액 형태(type) 또는 분말형태(type)로 첨가될 수 있다.
본 발명에서 당원은 설탕(sugar), 폴리덱스트로스(polydextrose), 프럭토오스(fructose), 말토올리고(maltooligo), 글루코오스(glucose), 덱스트린(dextrin), 프럭토올리고(fructooligo) 및 락토오즈(lactose) 중 하나 이상일 수 있으며, 특히 락토오즈 및 글루코오스 중 하나 이상인 것이 바람직하다. 상기 당원은 미생물 배양용 배지 조성물 총 중량 대비 1 ~ 2.5% 의 중량을 첨가하는 것이 바람직하며 이는 위 유산균이 어느 정도의 당원이 있을 때 생육이 활발히 때문이다.
본 발명에서 영양성분은 효모추출물(yeast extract)을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 효모추출물은 아미노산과 비타민등의 성분을 가지고 있는 천연 첨가물로서 상업용 식용 효모추출물을 구입하여 사용할 수 있다. 상기 영양성분은 미생물 배양용 배지 조성물 총 중량 대비 7 ~ 11%의 중량이 첨가되는 것이 바람직하다.
상기 미생물 배양용 배지 조성물은 염분을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 염분은, 제2인산칼륨(Dipotassium phosphate;K2HPO4)인 것이 바람직하다. 상기 염분은 미생물 배양용 배지 조성물 총 중량 대비 0.01 ~ 0.03%의 중량을 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 미생물 배양용 배지 조성물은 식물성 재료를 이용한 것으로, 바로 식용으로 사용할 수 있다는 것에 특징이 있다. 특히, 발효식품 제조에 사용되는 미생물의 배양에 사용할 수 있다.
본 발명은, 상기에서 제조된 홍삼 발효액을 포함하는 홍삼 발효 음료에 대한 것이다. 본 발명의 홍삼 발효 음료는, 매우 우수한 면역 증강 효과 및 암 개선 및 예방 효과를 나타낸다.
상기에서 홍삼 발효 음료의 제조 방법에 관하여 기재된 내용은 본 발명의 홍삼 발효 음료에 모두 적용될 수 있다.
이하, 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
< 신규한 홍삼 발효 균주의 수득 및 동정 >
실시예 1. 신규한 발효 균주의 수득
(1) 막걸리로부터 유산균의 분리 및 배양
홍삼 발효를 위한 유산균을 분리하기 위하여, 충남 금산, 충남 마전, 대전광역시의 인삼, 홍삼 막걸리 및 생 막걸리 등의 시료를 수집하였다(금산 장터에서 구매). 이로부터 유산균 100여 균주를 분리한 후, 상기 홍삼 막걸리의 멸균수를 이용하여 10-1~10-5까지 계열 희석(serial dilution)하여 MRS agar plate에 100 ㎕씩 스프레딩(spreading) 한 후, 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다.
(2) 베타- 글루코시다제 (β- glucosidase ) 분비 능력에 따른 발효 균주의 선별
상기 1)에서 분리 및 배양한 발효 균주 중 사포닌 전환 능력이 있는 균주를 선별하기 하고자, 사포닌 전환 능력을 검증할 수 있는 에스쿨린 아가(Esculin agar)방법을 이용하여 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 분비 균주를 다음과 같이 선별하였다.
베타-글루코시다제(β-glucosidase)분비 균주는 에스쿨린의 베타-글루코오스(β-glucose)를 절단하여 생성된 esculetin(에스쿨린에서 β-glucose가 떨어진 구조)이 구연산 철 암모늄(ferric ammonium citrate)과 반응하여 플레이트 상의 콜로니(colony) 주위에 흑색의 복합체(complex)를 형성한다는 것이 알려져 있다. 즉, 이러한 흑색의 복합체를 형성한 유산균들은 사포닌 전환 능력이 있으므로, 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 분비 균주를 우선적으로 선별하였다. 즉, 육안으로 보았을 때 유산균 주변으로 검정색 라운드가 생긴 균주를 선별하였으며, 이와 같이 선별된 균주는 하기 표 1에 기재된 바와 같이 명명하였다.
홍삼 막걸리로부터 선별된 베타- 글루코시다제 (β- glucosidase ) 분비 균주
베타-글루코시다제(β- glucosidase )분비 균주
WJ-1
WJ-2
WJ-4
WJ-6
WJ-23
WJ-33
비교예 1. 비교 균주의 수득
상기 실시예 1.(1)에서 분리, 배양된 100여 균주 중, 상기 실시예 1.(2)에서 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능력을 평가한 결과, 베타-글루코시다제(β-glucosidase)를 분비하지 않는 균주를 비교예로 분류하였다.
실험예 1. 신규한 발효 균주의 동정
(1) DNA 추출
상기 실시예 1의 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 분비 미생물로부터 염색체 DNA(chromosomal DNA)를 추출하였으며, 이 때 CoreOne bacterial DNA extraction kit(Coretech. Co. Ltd. Korea)를 이용하였다. 구체적으로 염색체 DNA를 추출하기 위하여, 분비 미생물은 플레이트 상에서 순수 배양된 균주를 1.5 ㎖ 튜브에 현탁하여 1번 세척 후 사용하였다. 그리고 추출한 DNA는 1% agarose gel을 이용하여 전기 영동을 통해 확인하였다.
(2) 16S rDNA 의 PCR 증폭
상기 실시예 1에서 선별된 미생물의 동정을 위하여 16S rDNA 영역을 증폭시키고자 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위하여 주형DNA(100 ng/㎕) 1 ㎕, 9F(100 pmol)(서열번호 1) 및 1512R(100 pmol) 프라이머 각각 1 ㎕, Taq polymerase(5 U/㎕) 0.5 ㎕, dNTP mix(10 mM each) 4 ㎕, 10 X 반응 버퍼 10 ㎕, 증류수 82.5 ㎕를 넣어 총 부피를 100 ㎕로 하여 반응 혼합물을 만들었다.
PCR 반응은 94℃에서 5분 선-변성 과정을 거친 다음, 94℃에서 1분간 변성(denaturation), 60℃에서 1분간 어닐링(annealing), 72℃에서 1분간 연장(extension) 과정을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 7분간 추가 증폭(extra-extension) 과정을 통해서 수행되었다. 그 후, 실험에 사용하기 전까지 4℃에서 보관하였다.
상기 16S rDNA 영역의 증폭을 위한 9F 및 1512R 프라이머는 하기 [표 3]에 기재된 바와 같으며, PCR 반응 후 증폭된 16S rDNA는 1% 아가로우즈 젤을 이용하여 전기 영동을 통해 확인하였다 (표 2 참조).
선-변성(Pre-denaturation) 94 ℃, 5 분 1 cycle
변성(Denaturation) 94 ℃, 1 분 30 cycles
어닐링(Annealing) 60 ℃, 1 분
연장(Elongation) 72 ℃, 1 분
Extra-extension 72 ℃, 7 분 1 cycle
보관 4 ℃ ∞
서열
9F(서열번호 1) 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
1512R(서열번호 2) 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'
(3) PCR 산물 정제 및 시퀀싱
상기 PCR 산물은 PCR purification kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 DNA를 정제하였다. 상기 정제된 16S rDNA의 염기서열은 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit(Applied Biosystems)와 Automatic DNA sequencer(model 3700, Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다.
(4) 염기 서열의 계통학적 분석
NCBI의 Blast을 이용하여 막걸리에서 분리한 WJ-1, 2, 4, 6, 23 및 33번 활성 균주와 가장 가까운 종류의 스트레인(strain)을 결정하였다. 또한 분리된 균주의 계통수를 그리기 위해서 GenBank에 등록되어 있는 서열 데이터(sequence data)를 이용하여 상기 선별된 균주와 비교적 가까운 위치에 있는 여러 종들의 type strain의 16S rDNA 염기 서열을 조사하고 이들의 염기 서열을 Bioedit program(Hall, 1999)과 Clustal X program을 이용하여 정렬(alignment)하였다(Thompson et al., 1997). 균주들의 진화 과정을 추적하는 작업은 Kimura two-parameter model을 이용하였고(Kimura, 1983), MEGA 3 Program 의 neighbor-joining 방법으로 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 분비 균주의 계통분류학적 위치를 결정하였다(Kumar et al., 2004).
그 결과, 각각 WJ-1은 1462bp, WJ-2는 854bp, WJ-4는 848bp, WJ-6은 1478bp, WJ-23은 1461bp, WJ-33은 1460bp의 염기로 구성되어 있으며(도 1의 a 내지 f), WJ-1은 Lactobacillus buchneri와 99.9%의 상동성을 나타냈으며, WJ-2 및 4는 Saccharomyces cerevisiae CBS405와 99%, WJ-6은 Lactobacillus buchneri와 99.9%, WJ-23 및 33은 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei와 99.4%, 99.6%의 상동성을 나타내었다(표 4 및 도 1의 a 내지 f).
Bp 유사 균주 상동성 서열번호
WJ-1 1462bp Lactobacillus buchneri 99.9% 3
WJ-2 854bp Saccharomyces cerevisiae CBS405 99% 4
WJ-4 848bp Saccharomyces cerevisiae CBS405 99% 5
WJ-6 1478bp Lactobacillus buchneri 99.9% 6
WJ-23 1461bp Lactobacillus paracasei subsp . paracasei 99.4% 7
WJ-33 1460bp Lactobacillus paracasei subsp . paracasei 99.6% 8
< 신규한 홍삼 발효 균주를 이용한 홍삼 발효액의 제조 및 특성 분석 >
실시예 2. 신규한 홍삼 발효 균주를 이용한 홍삼 발효액의 제조
실시예 2-1. 신규한 홍삼 발효 균주를 이용한 홍삼 발효액의 제조 ( 유도인자 첨가하지 않음)
상기 실시예 1.에서 선별된 베타-글루코시다제(β-glucosidase)를 분비하는 6개의 균주를 각각 ㈜성신에서 구입한 홍삼 농축액을 희석하여 500㎖에 0.001 ~ 3 %(v/w)의 농도로 접종한 후, 37℃에서 6 ~ 72 시간 발효시켰다.
실시예 2-2. 신규한 홍삼 발효 균주를 이용한 홍삼 발효액의 제조 (유도인자( elicitor )를 첨가)
상기 발효 균주의 사포닌 전환 활성을 극대화시키기 위하여 유도인자로서, 염(NaCl)과 설탕(Sucrose)을 발효 시 첨가하였다.
즉, 발효 균주의 발효 조건 및 TLC 분석 방법은 상기 실시예 2-1과 동일하나, 단지 발효 시작 시 염(NaCl) 또는 설탕(Sucrose)을 첨가하였다는 점만이 상이하다. 이 때, 염(NaCl)은 1% 농도로 발효 시 첨가하였으며, 설탕(Sucrose)은 1% 농도로 상기 균주에 각각 첨가하였으며 24시간 이내로 처리하였다.
비교예 2. 미발효 홍삼 추출액의 제조
상기 실시예 2-1에서, 발효과정을 거치지 않은 홍삼추출액을 준비하였다. 홍삼농축액은 ㈜성신에서 홍삼 농축액을 구입하여 사용하였다.
실험예 2. 실시예 2-1의 홍삼 발효액의 특성 분석
(1) 마이너( minor ) 사포닌으로의 전환 정도 분석
본 실험에 사용된 사포닌 Rb1은 경희대학교 인삼 유전자원 소재 은행에서 분양 받아 사용하였다.
발효 산물을 분석하기 위하여, TLC 크로마토그램을 수행하였다. TLC 크로마토그램을 수행하기 위해서 상기 홍삼 농축액에 균주를 첨가하여 발효시킨 홍삼 농축액을 수포화 부탄올과 1:1로 튜브에 넣은 뒤 볼텍스(vortex)한 후, 원심 분리하여, 부탄올층과 홍삼 농축액층을 분리하여 부탄올 추출액을 수득하였다. 구체적으로 silica gel 60 F254 TLC plate를 사용하였으며, 부탄올 추출액을 TLC plate에 점적한 후 CHCl3-MeOH-H2O 65:35:10 v/v/v, lower phase의 혼합 용매를 이용하여 전개하였다. 전개한 TLC plate는 10% 황산을 분무한 후 열을 가해 발색시켜 결과를 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 관찰된 바와 같이 선별된 균주 모두 메이져(major)사포닌을 체내에 흡수 가능한 Rg3, Rd, Rb1과 같은 마이너(minor) 사포닌으로 전환시키는 효과가 우수함을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로 WJ-1과 6 균주의 경우 Rd와 Rg3을 WJ-2와 4는 Rd를, WJ-23과 33은 Rg3과 F2로 전환시키는 능력이 우수함을 확인할 수 있었다(도 2 참조).
(2) pH 변화 분석
홍삼 농축액과 각각의 발효 균주와의 발효 전과 후의 pH의 변화를 분석 하기 위해 pH meter(Orion-550A)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 발효 전에는 pH 4.44의 수치였으며, 각 균주마다 약간의 차이는 있지만 발효가 진행됨에 따라 약간의 산성이 일어났음을 알 수 있었다(표 5 참조).
발효시간에 따른 pH 변화
2h 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 36h 44h
WJ-1 4.4 4.35 4.34 4.37 4.34 4.31 4.31 4.32 4.23 4.15
WJ-2 4.39 4.36 4.36 4.39 4.34 4.3 4.29 4.34 4.32 4.27
WJ-4 4.39 4.36 4.35 4.35 4.35 4.32 4.27 4.34 4.29 4.28
WJ-6 4.36 4.37 4.35 4.21 4.37 4.38 4.37 4.4 4.36 4.34
WJ-23 4.35 4.33 4.36 4.35 4.4 4.4 4.36 4.41 4.35 4.37
WJ-33 4.36 4.35 4.35 4.31 4.37 4.39 4.37 4.4 4.34 4.37
(3) 당도의 변화 분석
발효 전과 후의 Brix의 변화를 분석하기 위해 Brix meter(ATAGO-Rx-5000α)를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 발효 전에는 8.13 브릭스(Brix)였으며, 각 균주 마다 약간의 차이는 있지만 발효 전 보다 발효가 진행됨에 따라 당도가 약간 낮아짐을 알 수 있었다(표 6 참조).
발효시간에 따른 Brix 변화
2h 4h 8h 12h 16h 20h 24h 28h 36h 44h
WJ-1 7.87 7.9 7.89 7.96 7.91 7.77 7.9 7.9 7.92 7.91
WJ-2 7.9 7.87 7.86 7.82 7.64 6.76 6.67 6.62 6.6 6.43
WJ-4 7.88 7.87 7.86 7.82 7.64 6.91 6.67 6.77 6.9 6.88
WJ-6 7.9 7.9 7.93 7.96 7.93 7.89 7.92 7.9 7.91 7.96
WJ-23 7.94 7.94 7.91 7.94 7.9 7.73 7.96 7.92 7.91 7.93
WJ-33 7.91 7.9 7.9 7.93 7.92 7.94 7.95 7.9 7.91 7.94
실험예 3. 실시예 2-2의 발효액의 특성 분석 ( 유도인자 첨가에 따른 효과)
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 WJ-33 균주는 sucrose 보다 NaCl을 첨가하였을 때 Rg3와 F2가 더 많이 생성되었다(도 3 참조).
또한, WJ-2 균주의 경우에는 sucrose를 첨가하였을 때 major 사포닌 Rb1이 모두 분해되어 Rd와 compound-K가 생성되었고, WJ-4 균주의 경우에는 NaCl을 첨가하였을 때 Rd와 compound-K가 생성되었다(도 4a 및 4b 참조). 또한 WJ-1과 6 균주의 경우 sucrose보다 NaCl을 첨가하였을 때 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 활성이 높아지는 것이 확인되었다.
< 신규한 홍삼 발효 균주를 이용하여 제조한 홍삼 발효액의 기능성 확인( in vitro ) >
본 발명의 홍삼 발효액의 체내 흡수율 및 면역력 증강 효과 확인하기 위하여, 마우스 유래의 대식세포주인 Raw 264.7 cell을 이용하여 면역관련 인자들의 발현을 확인하였다.
실시예 3. 신규한 홍삼 발효 균주를 이용한 홍삼 발효액의 제조(발효 후 효소 첨가)
유산균 발효 후 사포닌(saponin) 전환 능력을 배가 시키기 위하여, 상기 실시예 2-1에서 제조한 홍삼 발효액에, 식용 가능 효소(Enzyme)를 첨가하여 처리하였다.
먼저 시중에 판매중인 모든 식용가능 β-glucosidase activity가 있는 효소를 수집하였다.
(주)성신에서 구입한 홍삼농축액을 3brix에서 15brix까지 희석하여 상기 실시예 2-1의과 동일한 방법으로 유산균 발효 후, 수집한 효소를 각각 0.5 ~ 5% 까지 접종한 후 45~60℃ 인큐베이터에서 10h ~ 72h 까지 반응 테스트를 진행하였다.
그 결과 많은 효소 중에서 (주)비젼바이오캠의 Multifect pectinase FE와 Novozymes사의Viscozyme L을 각각 3%씩 55℃ 40~48h 조건으로 반응시킨결과 일반 홍삼에는 없는 compound-K가 생성되었음을 확인하고(도 5), 위 방법으로 홍삼 발효액을 제조하였다.
실험예 4. Raw 264.7 ( mouse leukemic monocyte macrophage cell )을 이용한 Nitric Oxide 생성량 확인
(1)홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액( 비교예 2) 의 Nitric Oxide(NO) 생성 확인
Nitric Oxide(NO)는 각종 종양 세포나 미생물에 대한 세포독성을 지닌다고 알려져 있다. NO가 본 발명의 홍삼 발효액에 의해 유도되는지의 유무를 RAW264.7 세포주를 자극하여 얻은 배양 상등액 내에 유리된 NO의 양을 그 산화물 형태인 NO2 -(nitrite)의 양을 Griess reagent 와 표준물질(sodium nitrite)을 이용하여 확인하였다.
1) 세포 배양
Mouse macrophage cell 인 RAW 264.7 cell 은 한국세포주은행(서울대학교 의과 대학, Korea)에서 분양 받아 연구실에서 계대 배양 하여 사용하였다. RAW 264.7 mouse macrophage 세포를 세포 배양 접시에 부착시키고 penicillin 및 streptomycin 이 함유된 1% antibacterial-antifungal solution (PAA, Canada)과 10% FBS (PAA, Canada)를 첨가한 DMEM (PAA, Canada)을 사용하여 5% CO2, 37℃incubator에서 배양하였다. 배양액은 2~3일에 한번씩 교체하며, cell seeding 시 세포를 혼합한 배지 와 Tryphan blue 용액을 1:1로 혼합하여 hemocytometer 를 이용하여 tryphan blue 에 의해 염색되지 않은 세포를 계수하였다.
2) NO assay
RAW 264.7 세포를 48 well plate에 5×104 cell/well로 분주한 다음 24시간 후, 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 시료 처리 24시간 후에 세포배양 상등액 50 ㎕와 Griess 시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α-naphthylamide in H2O) 50 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader 를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 NO2 로 Standard curve를 작성하여 세포배양 상층액에 함유되어있는 NO 의 값을 계산하였다.
3) MTT assay
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 세포 독성을 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포를 이용하여 세포생존율을 확인하였다. RAW 264.7 세포를 48 well plate에 5×104 cell/well로 분주한 다음 24시간 후 홍삼 및 발효 홍삼 sample을 1, 10, 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 각 well 당 MTT(10 ㎕/well) 시약을 첨가하고 3시간 동안 37℃에서 배양한 후 MTT가 formazan 으로 분해되는 양을 ELISA reader를 이용하여 460 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 처리 군은 3 well씩 3회 반복실험을 하였으며, 홍삼 및 발효 홍삼에 대한 세포 증식효과는 3번 반복 실험의 평균값을 취한 후 아무것도 처리하지 않은 DMEM 용액에 배양한 대조군에 대한 백분율로 표시하였다.
Nitric Oxide(NO)는 각종 종양 세포나 미생물에 대한 세포독성을 지닌다고 알려져 있다. 이에 NO가 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)에 의해 유도되는지의 유무를 RAW264.7 세포주를 자극하여 얻은 배양 상등액 내에 유리된 NO의 양을 그 산화물 형태인 NO2 -(nitrite)의 양을 Griess reagent 와 표준물질(sodium nitrite)을 이용하여 확인하였다.
4) Nitric Oxide ( NO ) 생성 확인 결과
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)가 Nitric Oxide(NO) 생성에 미치는 효과 조사한 결과, LPS(1ug/ml) 만을 단독으로 처리하였을 때에는 NO의 생성이 4.5배 이상 증가한 것을 확인하였다. 이는 염증반응을 일으키는 물질인 LPS에 의하여 대식세포의 반응이 증가한 것을 의미한다. 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 경우 100ug/ml의 농도에서 2.5배, 홍삼 발효액(실시예 3)의 경우 100ug/ml의 농도에서 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 3.7배 NO의 생산을 유의하게 증가시키는 것으로 나타났다(도 6). 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 경우, 염증 유발 인자인 LPS를 단독으로 처리한 경우 보다 NO의 생성을 감소시켰다. 이러한 결과는 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)이 염증반응을 일으키지는 않지만 대식세포에서의 NO의 생성을 증가 시켜, 면역 반응에 도움을 줄 것으로 판단 된다. 또한, 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2) 내의 조사포닌을 기준으로 하여 조사포닌의 농도를 동일하게 처리하였지만, 홍삼 발효액(실시예 3)의 경우 미발효 홍삼 추출액(비교예 2) 보다 생리활성 기능이 많은 minor saponin인 Compound K, F2 등의 함량이 증가하여 면역 효능이 증가할 것으로 판단 된다.
실험예 5. Raw 264.7 ( mouse leukemic monocyte macrophage cell )을 이용한 TNF -α 생성량 확인
1) 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액( 비교예 2)의 TNF -α 생성 확인 방법
RAW 264.7 세포를 이용하여 pro-inflammatory cytokine인 TNF-α의 생성에 미치는 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 활성을 측정하였다. 10% FBS가 함유된 DMEM에서 배양한 RAW 264.7 세포를 24 well plate에 2 x 106 cell/ml의 농도로 접종한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 배양하였다. LSP와 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 첨가하여 24시간 배양하여 각각의 세포에서 분비한 상등액을 이용하여, ELISA Kit를 사용하여 TNF-α의 발현 량을 확인하였다.
2) RAW 264.7의 세포 생존율 확인 결과
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 RAW 264.7 세포에의 세포 독성을 나타내는지 확인하기 위하여 MTT assay를 확인한 결과 홍삼 및 발효 홍삼 추출물에서 세포독성은 나타나지 않는 것으로 확인 되었다. (도 7).
3) 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액( 비교예 2)의 TNF -α 생성에 미치는 효과 확인
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)이 대식세포주에서 활성을 지니는지 확인하기 위하여, cytokine인 TNF-α의 생성 유도능을 확인한 결과, 대식세포의 활성을 유발하는 LPS를 처리하지 않고 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2) 만을 단독으로 처리한 경우는 TNF-α의 생성에 큰 차이를 보이지 않는 것을 확인하였다. 하지만, 대식세포의 활성을 유발하는 LPS를 단독 또는 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)과 함께 처리한 경우에는, LPS 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 TNF-α 생성량 0.593 nM인 것에 비하여 1ug/ml 농도의 LPS 단독으로 세포를 자극하였을 경우 0.866 nM 로 약 46% 정도 증가 하였으며, 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 경우 100ug/ml의 농도에서 1.03 nM로 대조군에 비하여 약 70%, 양성대조군인 LPS 처리군에 비하여는 18% 증가 한 것을 확인하였다. 또한, 홍삼 발효액(실시예 3)의 경우에는 100ug/ml의 농도에서 1.166 nM로 대조군에 비하여 약 96%, 양성대조군인 LPS 처리군에 비하여 34% 증가 한 것을 확인하였다. 이러한 결과는 홍삼 발효액(실시예 3)이 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)과 비교하였을 때에도 대식세포를 활성화 시켜 면역관련 인자인 TNF-α의 생성을 20% 이상 증가시킨 것으로 확인 되어 면역반응을 활발히 일으킬 것으로 판단할 수 있는 근거가 된다(도 8).
실험예 6. Raw 264.7 cell 을 이용한 대식세포의 식작용 효능 확인
Raw 264.7 Cell에 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 처리하여 시료가 가지는 대식세포의 식작용 효능을 확인하였다
1) Raw 264.7 cell 을 이용한 대식세포의 식작용 효능 확인 방법
RAW 264.7 세포를 48 well plate에 5×104 cell/well로 분주한 다음 24시간 후 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 37℃ 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 24시간 배양 후 phagocytosis assay kit를 사용하여 대식세포의 식작용 효능을 확인하였다.
2) Phagocytosis activity 확인 결과
대식세포 대다수는 움직이지 않는 세포로 조직 안에 남아서, 이물질을 걸러 파괴시킨다. 그러나 일부는 떨어져 나와 순환계나 세포사이공간 안에서 떠돌아다닌다. 이러한 대식세포는 면역반응에 필수적인 요소로서, 대식세포의 식세포작용이 이물질의 표면분자(항원)를 표출시켜 림프구 반응을 자극하고 항체의 형성은 다시 대식세포의 식작용을 크게 자극한다. 이에 본 발명자는 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 이용하여 대식세포의 식작용 활성 정도를 확인하였다.(도 9)
in vitro 상에서 phagocytosis assay를 통해 대식세포의 식작용을 확인한 결과 추출물을 처리하지 않은 Wild type과 대식세포의 식작용을 억제하는 Inhibitor를 처리한 음성대조군의 경우 양성대조군(P-con)에 비하여 대식세포의 식작용이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 100ug/ml 처리한 경우에는 양성대조군과 비슷한 활성을 나타내었다. 반면, 홍삼 발효액(실시예 3)을 100ug/ml 처리한 경우에는 양성대조군과 비교하여 16% 이상 대식세포의 식작용을 활성화 시키는 것으로 확인하였지만, 유의적인 효과는 확인되지 않았다.
< 신규한 홍삼 발효 균주를 이용하여 제조한 홍삼 발효액의 기능성 확인( in vivo ) >
본 발명의 홍삼 발효액의 체내 흡수율 및 면역력 증강 효과 확인하기 위하여, 마우스 동물 모델을 이용하여 홍삼 및 발효 홍삼의 면역 증진 효능을 확인하였다.
실험예 7. 면역세포 증식능 확인
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 3주간 경구투여 한 후 마우스의 비장세포를 분리하여 비장세포의 증식능을 확인함으로써 시료의 면역증진 효능을 확인하였다.
1) 면역세포 증식능 확인 방법
무균 상태에서 비장을 취하여 적당량의 무균 HBSS 용액이 담긴 용기에 넣고, 핀셋으로 잘게 절단하여 단일 세포 현탁액으로 만든다. Filter로 여과하여 HBSS액에 세 번 세척한다. 매 세척 시 1,000 rpm에서 원심분리 한다. 세포를 완전배양액 2 ㎖에 띄워 염색한 후 생존 세포 수를 계산한다(95%이상 생존도). 세포 농도를 2 × 106 cells/㎖로 조절한다.
세포 현탁액을 24 well plate에 넣고 각 well마다 1 ㎖씩 넣고 B cell을 자극하는 인자인 LPS와 T cell을 자극하는 인자인 Con A 용액 (5 ㎍/㎖에 해당)을 넣는다. 대조군과 함께 CO2 5%, 37℃ 배양기에서 72시간 배양한다. 배양 종료 4시간 전에 각 well마다 상등액 0.7 ㎖를 빼고 FBS를 함유하지 않은 RPMI 1640 배양액 0.7 ㎖를 넣는 동시에 MTT액 (5 ㎎/㎖)을 50 ㎕/well의 양으로 넣고 4시간 동안 계속 배양 한다. 배양 종료 후 well마다 1 ㎖의 산성 아이소프로페놀을 넣어 보라색 결정체가 완전히 용해될 때까지 혼합한다. 그런 후 96 well plate에 나눠 담는다. 각 well은 3-6 well에 나눠 570 nm 파장에서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) reader로 측정 한다.
2) 면역세포 증식능 확인 결과
비장은 세포성 면역과 체액성 면역에 관여하는 중요한 이차면역 기관으로 생체 내 초기 면역 반응을 담당한다. 이에 본 발명자는 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 경구투여가 마우스 비장세포 증식능에 미치는 영향을 확인하기 위한 지표로 MTT assay를 이용하여 비장세포 증식능을 측정하였다. 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)에 의한 비장세포 증식능의 결과는 도 10 에 나타내었다.
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 3주간 경구투여 한 후, 비장세포를 분리하여 T cell이나 B cell을 활성화시키는 mitogen을 첨가하지 않은 경우의 세포 증식률은 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 경구 투여한 군에서 모두 세포 증식에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다. 또한, 세포성 면역에서 T cell을 선택적으로 증가 시키는 Concanavalin A(Con A, 5ug/ml)를 처리한 경우에는, 홍삼 발효액(실시예 3)을 200mg/kg의 농도로 경구 투여한 군에서 약 38% 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)과 비교하여도 15%이상 증식률이 좋은 것으로 확인 되었다. 하지만, 체액성 면역에서 B cell을 선택적으로 증가 시키는 Lipopolysaccharide(LPS, 5ug/ml)를 처리한 경우에는 모든 군에서 세포증식률의 차이가 크지 않은 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는, 본 발명의 홍삼 발효액(실시예 3)이 T cell의 면역 반응을 활성화 시켜 인체의 면역 증진에 도움을 줄 것으로 판단 된다.
실험예 8. 복강대식세포에서의 Cytokine 분비능 확인
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 3주간 경구투여 한 후 마우스의 복강대식세포를 분리하여 마우스의 복강대식세포에서 분비하는 TNF-α 및 IL-6의 발현량을 확인함으로써 시료의 면역증진 효능을 확인하였다
1) 복강대식세포에서의 Cytokine 분비능 확인 방법
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 3주간 경구투여 한 후, 마취한 마우스의 복강에 20ml의 RPMI 1640 배지를 주사기로 주입한 후, 10분간 마사지하여 준다. 그 후 pipette을 사용하여 배지를 다시 회수하고, 50ml 튜브에 옮겨 4℃에서 1500rpm으로 10분간 원심분리 하였다. RPMI 1640 배지로 3회 세척한 후 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 1 × 106 cells/㎖로 희석하였다. 희석된 세포액 100ul를 96 well plate에 분주하고, 5% CO2, 37℃ 배양기에서 2시간 배양하여 부착시켰다. 부유 된 세포를 제거한 후 부착된 대식세포를 이용하였다.
분리한 복강대식세포를 배양하여 생긴 배양 상층액으로부터 분비되는 사이토카인 (IL-1β, TNF-α)분비량을 각각 측정하였다. 비부착성 세포를 제거하고 부착성 세포만을 얻은 후, 10%-FBS RPMI 1640, 900 μL와 대식세포를 활성화시키는 미토젠인 LPS와 배지를 100 μL 가한 후 37℃, 5% CO2 incubator (Sanyo)에서 48시간 배양하였다. 배양 상층액을 분리하여 배양액에 축적된 IL-1β, TNF-α의 양을 ELISA 사이토카인 kit (R&D system, USA)를 이용하여 측정하였다.
2) 자연살해세포( NK cell ) 활성 측정
홍삼 및 발효 홍삼을 경구투여 한 후 마우스의 비장세포를 분리하여 표적세포인 YAC-1 세포와 함께 배양하여 Natural Killer cell의 활성을 확인함으로써 시료의 면역증진 효능을 확인하였다.
- 표적세포 및 효능세포의 배양
실험 24시간 전에 표적세포(YAC-1 cell)를 배양한다. 사용 전 HBSS용액으로 3번 세척하고 RPMI-1640 배양액으로 세포농도를 1 × 105 cells/㎖ 로 조정하였다.
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 3주간 경구 투여한 마우스에서 비장세포를 분리한 후, RPMI-1640 배양액으로 세포농도를 1 × 105 cells/㎖ 로 조정하였다.
3) 사이토카인 분비능 확인 결과
-. 복강대식세포를 이용한 TNF -α의 발현량 확인
Tumor necrosis factor (TNF)은 대식세포에서 주로 분비되며 항원에 의해 자극된 T 세포, NK세포 그리고 비만세포에 의해서도 생산이 되는 사이토카인으로 17kD 크기의 당단백질이다. TNF는 대식세포의 활성화에 T 세포와 NK 세포가 생산한 IFN-γ와 함께 상승 작용하며, 특히 반응성 질소 대사물인 NO를 유도하여 대식세포가 폭 넓은 항 미생물 작용을 갖도록 한다. 이에 본 발명자는 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 3주간 경구투여 한 마우스의 복강대식세포의 TNF-α 발현량에 미치는 영향을 확인하였다.
복강대식세포에서 LPS의 자극으로 인한 TNF-α의 생성 유도능을 확인한 결과, LPS 및 시료를 처리하지 않은 대조군의 TNF-α 생성량은 4571 pg/ml 이었으며, LPS만을 처리한 양성대조군의 경우에는 6293 pg/ml로 무처리군에 비하여 37% 증가 한 것을 알 수 있었다.
미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 경우 200mg/kg의 농도로 경구투여 한 군에서 6312 pg/ml로 무처리 대조군과 비교하여 약 38% 정도 증가하여 LPS를 처리한 양성대조군과 비슷한 생성량을 보였다. 하지만, 홍삼 발효액(실시예 3)의 경우 200mg/kg의 농도로 경구투여 한 군에서 6976 pg/ml로 무처리 대조군과 비교하여 약 52% 정도 증가 한 것을 확인하였다. 또한, 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)과 비교하여도 14% 이상 증가한 것을 확인 하였다(도 11).
또한, LPS의 자극 없이 홍삼 및 발효 홍삼 추출물 만을 단독으로 처리한 경우, 시료를 처리하지 않은 대조군 보다 TNF-α 생성량은 증가하지만, 시료간의 유의적인 차이는 보이지 않는 것으로 확인 되었다.
이러한 결과는 본 발명의 홍삼 발효액(실시예 3) 섭취에 의하여 면역 활성을 잠재적으로 가지고 있다가 외부물질(항원물질)이 체내로 침입하게 될 경우 홍삼 발효액(실시예 3)이 면역세포의 활성화에 작용하여 면역기능에 영향을 미치는 것으로 판단 된다.
- 복강대식세포를 이용한 IL -1β의 발현량 확인
IL-1β는 사이토카인 중에서 가장 핵심이 되는 염증반응의 매개체로서 대식세포에서 가장 만이 생성되며, 특정한 염증 자극을 받았을 때 그 반응의 결과로 생성된다. 또한, IL-1β는 T cell의 활성화와 같은 사이토카인 네트워크에서 중요한 역할을 한다. 이러한 IL-1β의 감소는 감염성 질병에 대한 저항성을 약화시키는 역할을 하므로 면역 반응에서 중요한 요소이다.
복강대식세포에서의 IL-1β의 생성 유도능을 확인한 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군의 IL-1β 생성량은 198 pg/ml 이었으며, 대식세포의 자극원으로 LPS를 처리한 경우에는 337 pg/ml로 약 70%가 증가한 것을 확인하였다.
반면, 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 경우 200mg/kg의 농도로 경구투여 한 군에서 280 pg/ml 로 확인 되었으며, 이는 IL-1β의 생성이 대조군 보다는 40% 증가한 것을 확인하였다. 또한, 홍삼 발효액(실시예 3)의 경우 200mg/kg의 농도로 경구투여 한 군에서 348 pg/ml 로 약 73% 정도 증가 한 것을 확인하였다(도 12).
하지만, IL-1β 생성의 경우에는 양성대조군으로 사용한 LPS 보다 홍삼 및 발효 홍삼 추출물의 효능이 유의적으로 나타나지는 않은 것을 확인 하였다.
- 복강대식세포를 이용한 IL -6의 발현량 확인
IL-6는 inflammatory, metabolic, physiological, haematopoietic과 같은 immunological 활성도와같은 여러 가지 특성을 가지고 있다. IL-6는 원래 B세포의 분화 인자로 B세포의 항체 생산을 증가시키는 단백질로 알려져 있었다. 최근의 연구에 의하면, IL-6는 면역 반응 및 조혈조절 등 숙주 방어기전의 중추적인 역할을 하는 사이토카인으로 밝혀져 면역 반응에서 중요한 요소로 인식되고 있다.
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 3주간 경구 투여한 마우스의 복강대식세포에서의 IL-6의 생성 유도능을 확인한 결과, 시료를 처리하지 않은 대조군의 IL-6 생성량은 107 pg/ml 이었으며, 대식세포에 자극을 주기 위하여 LPS를 처리한 경우 193 pg/ml로 약 180% 정도 IL-6의 생성을 증가시켰다.
미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 경우 200mg/kg의 농도로 경구투여 한 군에서 208 pg/ml로 확인 된 반면, 홍삼 발효액(실시예 3)의 경우 200mg/kg의 농도로 경구투여 한 군에서 227pg/ml로 대조군에 비하여 약 212% 정도 증가 한 것을 확인하였다(도 13). 또한, 홍삼 발효액(실시예 3)은 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)과 비교하여도 IL-6 생성량을 18% 이상 증가시키는 것을 확인 하였다.
이러한 결과는 홍삼 발효액(실시예 3) 섭취에 의하여 면역 활성을 잠재적으로 가지고 있다가 외부물질(항원물질)이 체내로 침입하게 될 경우 홍삼 발효액(실시예 3)이 마우스의 복강 대식세포를 활성화시켜 IL-6의 생성을 촉진 시킴으로써 면역기능 증강에 효과적인 영향을 미칠 것으로 판단 된다.
실험예 9. 홍삼 및 발효 홍삼의 채내 흡수율 확인
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 경구투여 한 후 마우스의 혈액을 채취한 후, 혈액에서 혈장을 분리하여 혈장내의 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 기능성 성분이라 판단되는 Compound K의 함량을 분석함으로써 시료의 체내 흡수율을 확인하였다.
1) 분석 장비 및 기기
- Mass spectrometry: API 4000 Q-trap Mass Spectrometer
- LC system: Agilent 1100 series
- Peak Simple Chromatography Data System: Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems)
2) 분석 조건
하기 표 7에 나타낸 바와 같다.
Analysis method LC-MS/MS
Detector API 4000 Q-trap Mass Spectrometer
Column Luna C18 (2.0ⅹ100 mm i.d, 3 m)
Mobile phase 10mM ammonium acetate/Methanol/Acetonitrile
(5/47.5/47.5, v/v/v)
Flow rate 0.5 mL/min
Injection volumn 10 μL
MS/MS parameter MRM mode
Compound K: 621.494 → 161.0
Internal standard (digoxin): 779.395 → 649.500
3) 검량선 작성
Compound K 표준품을 methanol에 녹여 compound K의 농도를 1 mg/mL로 만든 후 mouse plasma에 녹여 1, 2, 5, 10, 100, 400, 800, 1000 ng/mL의 농도가 되도록 표준혈장시료를 만들었다. 각각의 100 μL 시료에 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4)를 100 μL씩을 가한 후, ethyl acetate 900 μL를 넣고 vortexing하고, 2,500 g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액 300 μL를 30°C에서 증발 농축하고 이동상 100 μL로 용해시킨 후, 내부표준물질 10 μL를 넣어 vortexing 한 후 LC-MS/MS에 주입하여 분석하였다. 검체 분석 중에는 검량선 작성시료를 먼저 측정한 후 시료 분석 전 QC 시료들을 측정하여 이론치의 ±15% 이내에 들어오는지 확인하였다.
4) 혈장시료의 처리
-20°C에 보관하였던 각 mouse plasma를 실온에 방치하여 녹인 후 vortexing 하고 필요량만큼 취하여 검량선 작성 방법과 동일한 방법으로 전처리 한 후 LC-MS/MS에 주입하였다.
5) 혈중농도 계산
얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크면적에 대한 compound K의 피크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량선으로부터 혈장 시료 중 compound K의 농도를 구하였다.
6) 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액( 비교예 2)의 체내 흡수율 확인결과
홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 경구투여 한 후 마우스의 혈액을 채취한 후, 혈액에서 혈장을 분리하여 혈장내의 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 기능성 성분이라 판단되는 Compound K의 함량을 분석함으로써 시료의 체내 흡수율을 확인하였다.(도 14 및 도 15)
그 결과 대조군 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 경구투여 한 마우스의 혈장에서는 Compound K의 함량이 1ng/ml 이하로 확인은 되었지만, 이러한 결과는 검량선 작성시 측정한 이론치의 ±15% 이내에 들어오지 않아 체내에 흡수가 되지 않은 것으로 사료 되었다.
하지만, 홍삼 발효액(실시예 3)을 200mg/kg의 농도로 경구투여 한 마우스의 혈장에서는 6ng/ml로 확인되어, Compound K가 마우스의 체내에 흡수가 된 것으로 판단 할 수 있다. 이러한 결과는 홍삼 발효액(실시예 3)의 기능 성분인 Compound K가 체내에 흡수되어 면역 증진에 영향을 줄 것이라 사료된다.
<본 발명의 홍삼 발효액의 암세포의 증식억제 결과>
본 발명자는 폐암세포주인 A549-1 세포, 위암세포주인 AGS-1 세포, 대장암세포주인 HT 29 세포를 사용하여 각각의 암세포의 세포 증식억제에 미치는 홍삼 발효액(실시예 3) 및 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)의 영향을 확인하였다.
실험예 10. 본 발명의 홍삼 발효액의 폐암세포 증식 억제 효과 확인
폐암세포주인 A549-2 세포의 세포증식률은 홍삼 발효액(실시예 3)을 100ug/ml의 농도로 처리하였을 때 20% 정도의 세포 생존율을 보여 페암세포의 증식률을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. 반면, 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 100ug/ml의 농도로 처리한 경우에는 80% 이상의 세포 생존율을 보여 폐암세포의 증식률을 크게 억제하지 않는 것으로 확인 되었다. (도 15)
실험예 11. 본 발명의 홍삼 발효액의 위암세포 증식 억제 효과 확인
다음으로, 위암세포주인 AGS-1 세포의 세포증식률은 홍삼 발효액(실시예 3)을 100ug/ml의 농도로 처리하였을 때 25% 정도의 세포 생존율을 보여 위암세포의 증식률을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. 반면, 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 100ug/ml의 농도로 처리한 경우에는 80% 이상의 세포 생존율을 보여 위암세포의 증식률을 크게 억제하지 않는 것으로 확인 되었다.(도 16)
실험예 12. 본 발명의 홍삼 발효액의 대장암세포 증식 억제 효과 확인
다음으로, 대장암세포주인 HT 29 세포의 세포증식률은 홍삼 발효액(실시예 3)을 100ug/ml의 농도로 처리하였을 때 40% 정도의 세포 생존율을 보여 대장암세포의 증식률을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. 반면, 미발효 홍삼 추출액(비교예 2)을 100ug/ml의 농도로 처리한 경우에는 70% 이상의 세포 생존율을 보여 대장암세포의 증식률을 크게 억제하지 않는 것으로 확인 되었다.(도 17)
< 식물성 소재를 포함하는 배지를 이용한 홍삼 발효액의 제조 >
실험 재료
1. 실험재료
본 실험에 사용된 재료들은 식품제조 회사인 (주)세계에프엘에서 각 식품재료를 공급받아 사용하였다.
2. 실험에 사용한 유산균
웅진식품(주)에서 한국미생물 보존센터에 기탁한 특허 출원 유산균(KCTC 12108BP)인 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)를 이용하여 실험하였다.
실험예 13. 기본 배지 조성 실험
(1) 식물성 소재의 종류에 따른 미생물 배양 실험
유산균의 생육에 관여할 수 있는 소재(material)인 당근(Carrot), 바나나(Banana), 무(Radish) 및 양상추(Lettuce)를 각각 첨가한 배지에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)을 배양하여, 개별적으로 유산균의 O?값을 측정하였다. 그 결과를 표 8 및 도 18에 나타내었다.
1% 5% 10% 20% 30%
당근(Carrot) 0.131 0.492 0.354 0.078 0.091
바나나(Banana) 0.031 0.383 0.417 0.329 0.305
무(Radish) 0.046 0.211 0.551 0.884 0.748
양상추(Lettuce) 0.018 0.065 0.104 0.13 0.211
표 8과 도 18을 참고하면, 무, 당근, 바나나, 양상추 순으로 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)의 생육에 적합하며, 가장 적합한 것은 무임을 알 수 있다.
(2) 당의 종류에 따른 미생물 배양 실험
유산균이 이용가능한 당원인 설탕(sugar), 폴리덱스트로스(polydextrose), 프럭토오스(fructose), 말토올리고(maltooligo), 글루코오스(glucose), 덱스트린(dextrin), 프럭토올리고(fructooligo) 및 락토오즈(lactose)을 각각 첨가한 배지에 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)을 배양하여, 개별적으로 유산균의 O?값을 측정하였다. 그 결과를 표 9 및 도 19에 나타내었다.
당 종류
(Carbon source)		 OD600 당 종류
(Carbon source)		 OD600
Control 0.363 글루코오스(glucose) 0.71
설탕(sugar) 0.69 덱스트린(dextrin) 0.692
폴리덱스트로스(polydextrose) 0.663 프럭토올리고(fructooligo) 0.695
프럭토오스(fructose) 0.681 락토오즈(lactose) 0.745
말토올리고(maltooligo) 0.66 　 　
표 9와 도 19을 참고하면, 락토오즈와 글루코오스가 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)의 생육에 적합함을 알 수 있다.
(3) 염분 및 영양성분의 종류에 따른 미생물 배양 실험
유산균이 이용가능한 염분과 영양성분에 대하여 실험한 결과를, 표 10 및 도 20에 나타내었다. 표 10 및 도 20을 참고하면, 제2인산칼륨(Dipotassium phosphate;K2HPO4)의 농도 0.1 대비 효모추출물(yeast extract)을 0.5 내지 5의 농도로 첨가한 경우 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)의 생육에 적합함을 알 수 있다.
Salt OD600 Salt OD600 Salt OD600
K 0.1 Y 0.1 0.52 K 0.5 Y 0.1 0.319 K 1 Y 0.1 0.326
K 0.1 Y 0.5 0.821 K 0.5 Y 0.5 0.442 K 1 Y 0.5 0.392
K 0.1 Y 1 0.952 K 0.5 Y 1 0.493 K 1 Y 1 0.491
K 0.1 Y 5 0.984 K 0.5 Y 5 0.581 K 1 Y 5 0.564
표 10 및 도 20에서 K는 제2인산칼륨(Dipotassium phosphate;K2HPO4)을 나타내며, Y는 효모추출물(yeast extract)을 나타낸다.
위 결과를 토대로 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)의 생육에는, 전체 배지 조성물 중량 대비, 무와 락토오즈 0.2중량%, 글루코오스 0.2중량% 그리고 제2인산칼륨(Dipotassium phosphate;K2HPO4) 0.1중량% 와 5중량%의 효모추출물(yeast extract)의 함량이 가장 적합한 배합임을 알 수 있었다.
실험예 14. 추가 첨가물 조성 실험
(1) 식물성 소재 추가에 따른 미생물 배양 실험
상기 실험예 12의 결과에 따라, 전체 배지 조성물 중량 대비, 무와 락토오즈 0.2중량%, 글루코오스 0.2중량% 그리고 제2인산칼륨(Dipotassium phosphate;K2HPO4) 0.1중량% 와 효모추출물(yeast extract) 5중량%를 포함하는 배지 조성물에 식물성 소재로 배추(Cabbage), 당근(Carrot), 바나나(Banana), 양상추(Lettuce) 등을 각각 0.1중량%, 0.5중량%, 1중량%의 비율로 첨가한 배지 조성물을 제조하여, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)를 24h 동안 배양한 후 O?값을 측정하여, 표 11 및 도 21에 각각 나타내었다.
소재(농도) OD600 소재(농도) OD600
배추(Cabbage) 0.1% 0.988 당근(Carrot) 0.1% 0.789
배추(Cabbage) 0.5% 0.609 당근(Carrot) 0.5% 0.852
배추(Cabbage) 1% 0.569 당근(Carrot) 1% 1.052
소재(농도) OD600 소재(농도) OD600
바나나(Banana) 0.1% 1.053 양상추(Lettuce) 0.1% 0.835
바나나(Banana) 0.5% 1.06 양상추(Lettuce) 0.5% 1.043
바나나(Banana) 1% 1.088 양상추(Lettuce) 1% 1.059
그 결과 당근과 바나나를 각각 1중량%로 첨가하였을 때 가장 우수한 배양효과를 나타냄을 알 수 있었다.
(2) 식물성 소재 혼합 첨가에 따른 미생물 배양 실험
상기 실험예 12의 결과에 따라, 전체 배지 조성물 중량 대비, 무와 락토오즈 0.2중량%, 글루코오스 0.2중량% 그리고 제2인산칼륨(Dipotassium phosphate;K2HPO4) 0.1중량% 와 효모추출물(yeast extract) 5중량%를 포함하는 배지 조성물에 표 5에 나타낸 바와 같이 식물성 소재를 혼합 첨가한 배지 조성물을 제조하여, 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)를 24h 동안 배양한 후 O?값을 측정하여, 표 12 및 도 22에 각각 나타내었다.
MatrialMix
concentration		 Control 바나나+양상추
(Banana+
Lettuce)1%		 배추+바나나(Cabbage+
Banana)1%		 배추+양상추(Cabbage+
Lettuce)1%
OD600 0.815 1.096 1.069 0.968
MatrialMix
concentration		 당근+바나나
(Carrot+
Banana)1%		 당근+양상추
(Carrot+
Lettuce)1%		 배추+당근
(Cabbage+
Carrot)1%
OD600 1.127 0.983 1.053
그 결과 당근과 바나나를 총 조성물 중량 대비 1 중량 %씩 혼합하여 첨가하였을 때 가장 우수한 배양효과를 나타냄을 알 수 있었다.
한국생명공학연구원 KCTC12108BP 20111221
<110> WOONGJIN FOODS CO., LTD <120> RED GINSENG FERMENTING MICROORGANISM INCLUDING PROBIOTICS LACTIC ACID BACTERIA AND THE METHOD FOR MANUFACTURING FERMENTATIVE RED GINSENG <130> HY111398 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for PCR(16S rDNA) <400> 1 gagtttgatc ctggctcag 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer for PCR(16S rDNA) <400> 2 acggctacct tgttacgact t 21 <210> 3 <211> 1462 <212> DNA <213> Lactobacillus buchneri <400> 3 ggctagacgc atagattgat ctgactcgga gccgtataag gtagccgtat gcagttgaaa 60 catttccatt gagacgagtg gcgaactggt gagtaacacg tgggtaacct gcccttgaag 120 taggggataa cacttggaaa caggtgctaa taccgtataa caaccaaaac cacctggttt 180 tggtttaaaa gacggcttcg gctgtcactt taggatggac ccgcggcgta ttagcttgtt 240 ggtaaggtaa cggcctacca aggcgatgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca 300 cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca 360 atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgatg aagggtttcg gctcgtaaaa 420 ctctgttgtt ggagaagaac aggtgtcaga gtaactgttg acatcttgac ggtatccaac 480 cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg 540 tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taggtctgat gtgaaagcct 600 tcggcttaac cggagaagtg catcggaaac cgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg 660 gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg 720 gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat 780 accctggtag tccatgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca 840 gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc 900 aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgctacgc 960 gaagaacctt accaggtctt gacatcttct gccaacctaa gagattaggc gttcccttcg 1020 gggacagaat gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080 agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattgtt agttgccagc attcagttgg gcactctagc 1140 aagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1200 tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cggtacaacg agtcgcgaaa ccgcgaggtc 1260 aagctaatct cttaaagccg ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa 1320 gttggaatcg ctagtaatcg tggatcagca tgccacggtg aatacgttcc cgggccttgt 1380 acacaccgcc cgtcacacca tgagagtctg ttctgagaaa atccgtgacg aacagtcgaa 1440 acaagcgcct acgaactcct aa 1462 <210> 4 <211> 854 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 gccttctttt cggtgggggg tctgggaagg atcattaaag aaatttaata attttgaaaa 60 tggatttttt ttgttttggc aagagcatga gagcttttac tgggcaagaa gacaagagat 120 ggagagtcca gccgggcctg cgcttaagtg cgcggtcttg ctaggcttgt aagtttcttt 180 cttgctattc caaacggtga gagatttctg tgcttttgtt ataggacaat taaaaccgtt 240 tcaatacaac acactgtgga gttttcatat ctttgcaact ttttctttgg gcattcgagc 300 aatcggggcc cagaggtaac aaacacaaac aattttattt attcattaaa tttttgtcaa 360 aaacaagaat tttcgtaact ggaaatttta aaatattaaa aactttcaac aacggatctc 420 ttggttctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata cgtaatgtga attgcagaat 480 tccgtgaatc atcgaatctt tgaacgcaca ttgcgcccct tggtattcca gggggcatgc 540 ctgtttgagc gtcatttcct tctcaaacat tctgtttggt agtgagtgat actctttgga 600 gttaacttga aattgctggc cttttcattg gatgtttttt tttccaaaga gaggtttctc 660 tgcgtgcttg aggtataatg caagtacggt cgttttaggt tttaccaact gcggctaatc 720 ttttttatac tgagcgtatt ggaacgttat cgataagaag agagcgtcta ggcgaacaat 780 gttcttaaag tttgacctca aatcaggtag gagtacccgc tgaacttaag cattcataag 840 cccggagaaa aagg 854 <210> 5 <211> 848 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 ctttctttcg gggggggtac tgggaaggat cattaaagaa atttaataat tttgaaaatg 60 gatttttttt gttttggcaa gagcatgaga gcttttactg ggcaagaaga caagagatgg 120 agagtccagc cgggcctgcg cttaagtgcg cggtcttgct aggcttgtaa gtttctttct 180 tgctattcca aacggtgaga gatttctgtg cttttgttat aggacaatta aaaccgtttc 240 aatacaacac actgtggagt tttcatatct ttgcaacttt ttctttgggc attcgagcaa 300 tcggggccca gaggtaacaa acacaaacaa ttttatttat tcattaaatt tttgtcaaaa 360 acaagaattt tcgtaactgg aaattttaaa atattaaaaa ctttcaacaa cggatctctt 420 ggttctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgatacg taatgtgaat tgcagaattc 480 cgtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccttg gtattccagg gggcatgcct 540 gtttgagcgt catttccttc tcaaacattc tgtttggtag tgagtgatac tctttggagt 600 taacttgaaa ttgctggcct tttcattgga tgtttttttt tccaaagaga ggtttctctg 660 cgtgcttgag gtataatgca agtacggtcg ttttaggttt taccaactgc ggctaatctt 720 ttttatactg agcgtattgg aacgttatcg ataagaagag agcgtctagg cgaacaatgt 780 tcttaaagtt tgacctcaaa tcaggtagga gtacccgctg aacttaagca tatctaancc 840 ggaagaaa 848 <210> 6 <211> 1474 <212> DNA <213> Lactobacillus buchneri <400> 6 cccccagcgc ggctatctgc agtcgacgcg tctccgttat gattttaggt gcttgcactt 60 gaaagattta acattgagac gagtggcgaa ctggtgagta acacgtgggt aacctgccct 120 tgaagtaggg gataacactt ggaaacaggt gctaataccg tataacaacc aaaaccacct 180 ggttttggtt taaaagacgg cttcggctgt cactttagga tggacccgcg gcgtattagc 240 ttgttggtaa ggtaacggcc taccaaggcg atgatacgta gccgacctga gagggtaatc 300 ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 360 ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggg tttcggctcg 420 taaaactctg ttgttggaga agaacaggtg tcagagtaac tgttgacatc ttgacggtat 480 ccaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 540 cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaggt ctgatgtgaa 600 agccttcggc ttaaccggag aagtgcatcg gaaaccggga gacttgagtg cagaagagga 660 cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 720 aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gcatgggtag cgaacaggat 780 tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgagtgcta agtgttggag ggtttccgcc 840 cttcagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc gcaaggttga 900 aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc 960 tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttctgccaa cctaagagat taggcgttcc 1020 cttcggggac agaatgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080 ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttgttagttg ccagcattca gttgggcact 1140 ctagcaagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200 ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacggta caacgagtcg cgaaaccgcg 1260 aggtcaagct aatctcttaa agccgttctc agttcggatt gtaggctgca actcgcctac 1320 atgaagttgg aatcgctagt aatcgtggat cagcatgcca cggtgaatac gttcccgggc 1380 cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagccg gtgaggtacc 1440 ttcggggacc agccgtctaa gtagatcacg ctgg 1474 <210> 7 <211> 1461 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei subsp. paracasei <400> 7 cccgcaggcg caatctgcag tcgacgagtt ctcgttgatg atcggtgctt gcaccgagat 60 tcaacatgga acgagtggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc cttaagtggg 120 ggataacatt tggaaacaga tgctaatacc gcatagatcc aagaaccgca tggttcttgg 180 ctgaaagatg gcgtaagcta tcgcttttgg atggacccgc ggcgtattag ctagttggtg 240 aggtaacggc tcaccaaggc gatgatacgt agccgaactg agaggttgat cggccacatt 300 gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccacaatgg 360 acgcaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ctttcgggtc gtaaaactct 420 gttgttggag aagaatggtc ggcagagtaa ctgttgtcgg cgtgacggta tccaaccaga 480 aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttatccg 540 gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga aagccctcgg 600 cttaaccgag gaagcgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac 660 tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg aaggcggctg 720 tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga ttagataccc 780 tggtagtcca tgccgtaaac gatgaatgct aggtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc 840 cgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg aaactcaaag 900 gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960 aaccttacca ggtcttgaca tcttttgatc acctgagaga tcaggtttcc ccttcggggg 1020 caaaatgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080 ccgcaacgag cgcaaccctt atgactagtt gccagcattt agttgggcac tctagtaaga 1140 ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200 ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt acaacgagtt gcgagaccgc gaggtcaagc 1260 taatctctta aagccattct cagttcggac tgtaggctgc aactcgccta cacgaagtcg 1320 gaatcgctag taatcgcgga tcagcacgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380 accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac acccgaagcc ggtggcgtaa ccctttagga 1440 gcgagcctct agtgcatgtt t 1461 <210> 8 <211> 1460 <212> DNA <213> Lactobacillus paracasei subsp. paracasei <400> 8 ttttcggatg gcgcaatctg cagtcgacga gtctcgttga tgattggtgc ttgcccgaga 60 ttcaacatgg aacgagtggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccttaagtgg 120 gggataacat ttggaaacag atgctaatac cgcatagatc caagaaccgc atggttcttg 180 gctgaaagat ggcgtaagct atcgcttttg gatggacccg cggcgtatta gctagttggt 240 gaggtaacgg ctcaccaagg cgatgatacg tagccgaact gagaggttga tcggccacat 300 tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 360 gacgcaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag gctttcgggt cgtaaaactc 420 tgttgttgga gaagaatggt cggcagagta actgttgtcg gcgtgacggt atccaaccag 480 aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc 540 ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccctcg 600 gcttaaccga ggaagcgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa 660 ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 720 gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc 780 ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgaatgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg 840 ccgcagctaa cgcattaagc attccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa 900 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960 gaaccttacc aggtcttgac atcttttgat cacctgagag atcaggtttc cccttcgggg 1020 gcaaaatgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080 cccgcaacga gcgcaaccct tatgactagt tgccagcatt tagttgggca ctctagtaag 1140 actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200 cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgagaccg cgaggtcaag 1260 ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga ctgtaggctg caactcgcct acacgaagtc 1320 ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380 caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccgaagc cggggcgtaa ccctttagga 1440 gcagcgtcta tgagacggtt 1460

Claims (10)

  1. 서열 번호 8의 서열을 갖는, 홍삼 발효용 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 미생물은, 홍삼에 포함된 Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2 및 Rd 중 하나 이상의 메이져 사포닌을 F2, Rg3, Rh2 및 컴파운드-k(Compound-K) 중 하나 이상의 마이너 사포닌으로 전환시키는 특성을 나타내는, 홍삼 발효용 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 미생물은 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp . paracasei)의 염기 서열과 상동성 99% 이상을 나타내는 갖는 것을 특징으로 하는, 홍삼 발효용 미생물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 미생물은 KCTC12108BP의 기탁 번호를 갖는 것을 특징으로 하는, 홍삼 발효용 미생물.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 미생물을 홍삼 추출액에 가하여 발효시키는 단계를 포함하는, 홍삼 발효액 제조방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 발효시키는 단계 후 효소를 첨가하여 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 홍삼 발효액 제조방법.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 발효시 설탕(sucrose) 또는 염(NaCl)을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 홍삼 발효액 제조방법.
  8. 청구항 5에 있어서,
    상기 발효시 사용되는 미생물 배양액이, 배추, 무, 양상추, 양배추, 당근, 바나나, 감자, 상추로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로부터 제조된 것을 특징으로 하는, 홍삼 발효액 제조방법.
  9. 청구항 5의 제조 방법에 의하여 제조된 홍삼 발효액을 포함하는, 면역 증강용 홍삼 발효 음료.
  10. 청구항 5의 제조 방법에 의하여 제조된 홍삼 발효액을 포함하는, 암 개선 및 암 예방용 홍삼 발효 음료.
KR1020120151862A 2011-12-22 2012-12-24 신규한 홍삼 발효용 미생물, 이를 이용한 홍삼 발효액 및 홍삼 발효 음료 KR101295444B1 (ko)

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