CN109182441A - 人参皂苷Rb1发酵液的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，它包括：1）每1L MRS培养基加入人参皂苷Rb1 1~5g，溶解，调节pH值至5.0~5.5；2）在无菌条件下，将含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基过滤除菌；3）将发酵乳杆菌按照1~5%接种量接种于含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基中，发酵条件为：33~40℃下摇床培养，摇床转速为70~130r/min，发酵5~7天；动物实验结果表明，该发酵乳杆菌发酵人参Rb1对修复高脂饮食诱导的脂肪性肝损伤具有潜在作用；该发酵乳杆菌发酵人参皂苷Rb1转化生成Rg3和F2后对高脂饮食引起的肝损伤及炎症反应具有一定的缓解和改善作用，而Rb1没有作用。

Description

人参皂苷Rb1发酵液的制备方法及其应用

技术领域

本发明属微生物应用技术领域，具体涉及人参皂苷Rb1发酵液的制备方法及其应用。

背景技术

人参皂苷为三萜糖苷类化合物，是人参的主要药用活性成分。根据其苷元上C-3、C-6和C-20位置的糖苷键(Glycosidicbond)的种类和数量的不同，衍生出不同类型的人参皂苷。根据其在植物中的含量分为主要人参皂苷(Majorginsenoside，如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1等)和稀有人参皂苷(Rareginsenoside，如Rg3、Rh1、Rh2、F1、F2、CK、C-O、CY 和C-Mc)等。其中稀有人参皂苷是指在人参中含量极低或者不存在的皂苷。由于苷元和糖基的种类、糖基的数量和糖基连接的碳位不同，其活性差别很大。人参皂苷Rb1可以改善神经变性动物运动障碍，降低神经变性动物死亡率及减小纹状体损害体积；减少永久性大脑中动脉闭塞大鼠大脑梗塞体积，改善动物的位置导航残疾，促进烧伤创面愈合。人参皂苷F2具有抗疲劳、安神补脑、抗肿瘤等功效。陈茜等发现人参皂苷F2对胃癌SGC-7901细胞和肺癌SPC-A-1细胞均具有抑制作用；成宗焕等发现人参皂苷F2具有抑制肿瘤细胞的增殖，倒转肿瘤细胞及细菌中所表现出来的多重耐药性等效果。Rg3可作用于细胞生殖周期的G2期，抑制癌细胞有丝分裂前期蛋白质和ATP的合成，使癌细胞的增殖生长速度减慢，并且具有抑制癌细胞浸润、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等作用。

付玉等利用青霉菌将人参提取物中的人参主皂苷转化为稀有人参皂苷F2、Ｒg3和C-K，且转化效果十分可观。Yan等利用一种拟青霉菌将人参皂苷Ｒb1转化为稀有人参皂苷C-K。陈旸等利用植物乳杆菌将人参总皂苷转化为人参皂苷Rd。Bai等利用植物乳杆菌将人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd。Kim等利用植物乳杆菌M1进行发酵将总人参皂苷转化为人参皂苷Rg1、Rg5、Rk1、C-K、Rh1、Rg2。但是，利用发酵乳杆菌转化Rb1为稀有人参皂苷Rg3和F2的报道没有，特别是生成Rg3的报道没有。卲淇等报道发酵乳杆菌菌株L1可将人参皂苷Rb1转化为稀有人参皂苷F2，植物乳杆菌菌株L5可以将人参皂苷Rb1转化生成稀有人参皂苷F2和C-K。

发明内容

本发明目的是提供一种人参皂苷Rb1发酵液的制备方法及其应用。

人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，它包括：

1）每1L MRS培养基加入人参皂苷Rb1 1~5g，溶解，调节pH值至5.0~5.5；

2）在无菌条件下，将含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基过滤除菌；

3）将发酵乳杆菌按照1~5%接种量接种于含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基中，发酵条件为：33~40℃下摇床培养，摇床转速为70~130r/min，发酵5~7天，获得人参皂苷Rb1发酵液；

所述的发酵乳杆菌其保藏编号为CCTCC. M 2016372；

步骤1）所述的人参皂苷Rb1的添加量为2g；

步骤1）所述的调节pH值至5.2；

步骤1）所述的所述的MRS培养基为：酪蛋白胨 10.0g，牛肉膏 10.0g，酵母粉 5.0g，葡萄糖 5.0g，乙酸钠 5.0g，柠檬酸二铵 2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄.7H₂O0.2g，MnSO₄.H₂O 0.05g，CaCO₃ 20.0g，琼脂 15.0g，自来水 1.0L，pH6.8。灭菌条件：121℃，15 min；

步骤2）所述的过滤除菌，是用孔径为0.45μm微孔滤膜过滤除菌；

步骤3）所述的发酵乳杆菌，其保藏编号为CCTCC. M 2016372，所述的接种量为3%；

步骤3）所述的发酵条件为：36~38℃下摇床培养，摇床转速为80~110r/min，发酵7天。

所述的方法制备的人参皂苷Rb1发酵液在制备治疗高脂饮食引起的肝损伤及炎症反应的药物方面的应用。

所述的方法制备的人参皂苷Rb1发酵液在制备抑制血清和肝脏中ALT水平升高的药物方面的应用。

本发明提供了人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，它包括：1）每1L MRS培养基加入人参皂苷Rb1 1~5g，溶解，调节pH值至5.0~5.5；2）在无菌条件下，将含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基过滤除菌；

3）将发酵乳杆菌按照1~5%接种量接种于含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基中，发酵条件为：33~40℃下摇床培养，摇床转速为70~130r/min，发酵5~7天；动物实验结果表明，该发酵乳杆菌发酵人参Rb1对修复高脂饮食诱导的脂肪性肝损伤具有潜在作用；该发酵乳杆菌发酵人参皂苷Rb1转化生成Rg3和F2后对高脂饮食引起的肝损伤及炎症反应具有一定的缓解和改善作用，而Rb1没有作用。

附图说明

图1 KP-3菌株的菌体和菌落形态特征，(A)菌体形态，(B)菌落形态特征；

图2 KP-3菌株的系统发育树和16S rDNA测序结果，(A)系统发育树，(B)测序结果；

图3 TLC法分析人参皂苷Rb1转化途径；

图4 人参皂苷Rb1转化为Rg3和F2的分子式示意图；

图5 肝脏组织病理学形态的变化(HE染色×10)；Control：空白组；HFD：高脂饲料对照组；HFD+NFG：高脂饲料Rb1实验组；HFD+FG：高脂饲料发酵Rb1实验组；

图6 益生菌发酵人参对高脂饮食小鼠血清和肝脏中ALT水平的影响；Control：空白组；HFD：高脂饲料对照组；HFD+NFG：高脂饲料Rb1实验组；HFD+FG：高脂饲料发酵Rb1实验组。

具体实施方式

实施例1 有效转化人参皂苷Rb1菌株的筛选与鉴定

称取1g韩国泡菜，将其完全浸泡在5ml液体灭菌MRS培养基中，在37℃条件下恒温培养20-24h；将接种环伸入液体MRS培养基后在固体培养基上划线，37℃恒温培养48h；挑取不同单菌落继续接种在固体MRS培养基上进一步纯化，反复操作至菌株纯化完全；最终将单菌落接种于液体MRS培养基内，在37℃条件下恒温培养20-24h，按照3%的接种量进行接菌，传代培养3次后进行菌种保藏，将浓度为50%的灭菌甘油与菌液按照1：1的比例混合后置于-80℃冰箱，保藏待用；利用分离纯化的不同菌株发酵人参，通过对不同菌株转化人参皂苷的效果进行评价，最终确定一株转化人参皂苷能力较强的菌株作为试验菌株；通过观察菌落形态并进行镜检，将初步筛选出的具有转化人参皂苷生成稀有人参皂苷能力的菌株送至上海生工公司进行16S rDNA测序，鉴定结果如下：

通过对筛选的KP-3进行菌体和菌落形态学观察，菌体形态特征如图1A所示，革兰氏染色镜检KP-3菌株为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状，无鞭毛，不产生芽孢；菌落形态特征如图1B所示，KP-3菌株在平板上凸起、圆形、表面光滑、呈乳白色菌落。

KP-3菌株经过16S rDNA测序分析可知，其序列长为1354bp，其碱基序列如序列表SEQ NO.1所示；将KP-3菌株的16S rDNA序列提交至NCBI的GenBank并通过BLAST进行同源性比对；如图2所示，结果表明KP-3菌株的16S rDNA与L. fermentum strain 25C2的16S rDNA具有较高的同源性，证实KP-3菌株为发酵乳杆菌；利用Mega7. 0软件并采用NJ法（NeighborJoining）构建系统发育树。

以KP-3基因组的DNA作为模板，进行多重PCR扩增目的片段，其PCR产物在1200bp-2000bp处存在特异性条带，进一步证实KP-3菌株为发酵乳杆菌；现保存于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期2016年7月14日，编号为CCTCC. M 2016372，分类命名为Lactobacillus fermentum。

所述的MRS培养基为：酪蛋白胨 10.0g，牛肉膏 10.0g，酵母粉 5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠 5.0g，柠檬酸二铵 2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，MnSO₄.H₂O 0.05g，CaCO₃ 20.0g，琼脂 15.0g，自来水 1.0L，pH6.8。灭菌条件：121℃，15min；以下实施例中MRS培养基的制备与此相同。

实施例2人参皂苷Rb1的转化实验

一、活化菌种

将实施例1制备的发酵乳杆菌KP-3，接种于灭菌MRS液体培养基中，接种量为3%，在37℃条件下恒温培养20-24小时，连续3次传代培养。

二、人参皂苷标准品的制备

精密称取人参标品F2、Rg3各0.2mg，溶解于2ml的95%甲醇溶液，若存在不溶现象，超声30分钟左右即可完全溶解。

三、人参皂苷Rb1发酵液的制备

1）液体 MRS培养基中加入0.2%人参皂苷标准品Rb1，至完全溶解，调节pH值至5.2左右；

2）在无菌条件下，将含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基用孔径为0.45μm微孔滤膜过滤除菌；

3）按照3%接种量将发酵乳杆菌KP-3接种于含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基中；

4）37℃条件下摇床培养，摇床转速为90r/min，发酵时间为7天获得人参皂苷Rb1发酵液；

5）在上述的发酵过程中，当发酵至2天、5天时，取出少量的发酵液，保存。

四、人参皂苷的提取方法

将发酵0天、2天、5天和7天的人参皂苷Rb1发酵液，与水饱和正丁醇按1:1等体积混匀，置于离心机内在10000rpm条件下离心1min，取上清液；此步骤连续重复三次后，合并上清液，获得人参皂苷提取液，用于分析人参皂苷Rb1的转化途径。

五、薄层层析法分析人参皂苷

将人参皂苷标准品和人参皂苷提取液点于薄层层析硅胶板上，上样量为2μl，样品点样位置为距薄层板底端1cm处，各样品间距为7-8mm，点样完毕后吹干；置于展开剂中使其缓慢上行展开；展层完毕后均匀喷洒显色剂，并置于烘箱中105℃加热5-10min使人参皂苷显色；

所述的展开剂组分及体积比为：三氯甲烷：甲醇：水=10 : 5 : 1，显色剂为10%硫酸溶液；

薄层层析的结果见图3，可以看出，发酵7天后层析有两个条带，与标准品对照可知，这两个条带分别是人参皂苷Rg3和F2，说明人参皂苷Rb1转化成具有更高生物活性的稀有人参皂苷Rg3和F2；人参皂苷Rb1转化的分子示意图见图4。

实施例3 人参皂苷活性实验

一、试验动物分组情况

将40只清洁级试验小鼠(C57BL/6N)随机分成4组，分别为空白组、高脂饲料对照组、高脂饲料Rb1实验组和发酵高脂饲料Rb1实验组，保证各组间小鼠初始体重无显著性差异，每组10只；不同组间小鼠饲喂不同饮食，具体如下：

空白组：基础饲料：购买于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司；

高脂饲料对照组：高脂饲料：基础饲料为主要成分并辅以其他有效成分，如胆盐、胆固醇和蛋黄等；适应一段时间后，将猪油含量提高到20%，基础饲料相应减少到68.8%；营养成分见下表1；

Rb1干预组：除饲喂上述的高脂饲料，饲喂未发酵的Rb1，剂量为200mg/kg/d；

发酵Rb1干预组：除饲喂上述的高脂饲料，饲喂益生菌发酵人参皂苷Rb1 7天的发酵液，剂量为200mg/kg/d；

其中发酵Rb1干预组的人参皂苷Rb1样品经过发酵后常规灭菌，保证无活菌；各组小鼠自由摄食，饮用纯净水，饲养环境为12小时循环光照，温度为20±2℃，湿度50±5%；每天记录摄食量，每周称量一次小鼠体重并更换垫料；试验周期为8周，处死前禁食12小时，记录死前体重，眼球取血，打开胸腔和腹腔后迅速取出小鼠各脏器及脂肪，称重并记录；

二、动物血清的制备

将小鼠血液收集在1.5ml离心管内，常温静置一段时间后低温（4℃）离心，条件为3000rpm离心10min，取上清液置于干净离心管中，保存于-80℃冰箱，待用；

三、小鼠肝匀浆液的制备

准确称取0.1g小鼠肝脏组织置于1.5ml离心管中，用手术剪在离心管内剪碎，并加入900μl生理盐水缓冲液将肝脏组织进行充分匀浆；匀浆结束后，置于冷冻高速离心机内，在4℃条件下离心10min，转速为3000r/min，取上清液即得肝脏组织匀浆液，置于-80℃冰箱保存，用于生理生化分析；

四、小鼠肝脏形态学切片处理方法

为观察小鼠肝脏形态学变化，故制备小鼠肝脏组织切片用于病理学分析，其主要操作流程为：取材固定、脱水透明、浸蜡包埋、切片展片、染色封片；

五、生化指标的检测

小鼠血清ALT、AST、LPS及肝脏中ALT、AST和TNF-α等指标均按照试剂盒说明书进行操作；

六、结果：

1、益生菌发酵人参皂苷Rb1对高脂饮食小鼠肝脏组织形态学的影响

为探究益生菌发酵人参皂苷Rb1是否对肝损伤具有缓解作用，通过苏木精-伊红染色（HE染色）对小鼠肝脏组织形态学进行观察；如图5所示，对照组（Con）小鼠肝脏组织病理学形态染色表明对照组小鼠肝脏组织细胞均匀完整，肝细胞中未见脂滴；相对地，高脂组（HFD）高脂饮食小鼠的肝脏组织细胞胞浆空泡化，肝脏组织细胞边界模糊不清，完整性受损，可见大小不等脂滴，说明连续8周高脂饮食则可以引起小鼠肝脏脂肪变性；通过与高脂组小鼠肝脏组织细胞比较发现，发酵Rb1干预组（HFD+FG）小鼠肝脏组织细胞中脂滴数量减少并抑制肝脏组织细胞的肥大和胞浆空泡化，从而有效改善小鼠肝脏组织的脂肪变性；未发酵的Rb1干预组（HFD+NFG）与高脂组比较差异不明显；说明在一定程度上，益生菌发酵人参Rb1对修复高脂饮食诱导的脂肪性肝损伤具有潜在作用。

2、益生菌发酵人参皂苷Rb1对高脂饮食小鼠血清和肝脏谷丙转氨酶水平的影响

谷丙转氨酶（ALT）是反映肝实质性损害的最常用指标；临床上认为，当1%的肝细胞发生坏死时，血清ALT水平即可升高1倍；因此，本研究通过对小鼠血清和肝脏中ALT水平分析，评价益生菌发酵人参皂苷Rb1对长期摄入高脂饮食造成肝损伤的影响；如图6所示，与正常对照组相比，高脂组高脂饮食导致小鼠血清和肝脏中ALT水平的升高均具有显著性差异(P<0.05)。益生菌发酵人参皂苷Rb1有效抑制血清和肝脏中ALT水平的升高(P<0.05)，分别降低了22.96%和11.83%。未发酵的Rb1干预组与高脂组比较没有显著变化。数据表明，益生菌发酵人参皂苷Rb1转化生成Rg3和F2后对高脂饮食引起的肝损伤及炎症反应具有一定的缓解和改善作用，而Rb1没有作用。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 人参皂苷Rb1发酵液的制备方法及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1354

<212> DNA

<213> 发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)

<400> 1

gtcgccaacg agtggcggac gggtgagtaa cacgtaggta acctgcccag aagcggggga 60

caacatttgg aaacagatgc taataccgca taacagcgtt gttcgcatga acaacgctta 120

aaagatggct tctcgctatc acttctggat ggacctgcgg tgcattagct tgttggtggg 180

gtaacggcct accaaggcga tgatgcatag ccgagttgag agactgatcg gccacaatgg 240

gactgagaca cggcccatac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cacaatgggc 300

gcaagcctga tggagcaaca ccgcgtgagt gaagaagggt ttcggctcgt aaagctctgt 360

tgttaaagaa gaacacgtat gagagtaact gttcatacgt tgacggtatt taaccagaaa 420

gtcacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttatccgga 480

tttattgggc gtaaagagag tgcaggcggt tttctaagtc tgatgtgaaa gccttcggct 540

taaccggaga agtgcatcgg aaactggata acttgagtgc agaagagggt agtggaactc 600

catgtgtagc ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctacc 660

tggtctgcaa ctgacgctga gactcgaaag catgggtagc gaacaggatt agataccctg 720

gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctag gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgccg 780

gagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga 840

attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagct acgcgaagaa 900

ccttaccagg tcttgacatc ttgcgccaac cctagagata gggcgtttcc ttcgggaacg 960

caatgacagg tggtgcatgg tcgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020

gcaacgagcg caacccttgt tactagttgc cagcattaag ttgggcactc tagtgagact 1080

gccggtgaca aaccggagga aggtggggac gacgtcagat catcatgccc cttatgacct 1140

gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac aacgagtcgc gaactcgcga gggcaagcaa 1200

atctcttaaa accgttctca gttcggactg caggctgcaa ctcgcctgca cgaagtcgga 1260

atcgctagta atcgcggatc aagcaatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacaa 1320

caccgcccgt caacaccaat gaaggagttt gtaa 1354

Claims (9)

1.人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，它包括：

1）每1L MRS培养基加入人参皂苷Rb1 1~5g，溶解，调节pH值至5.0~5.5；

2）在无菌条件下，将含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基过滤除菌；

3）将发酵乳杆菌按照1~5%接种量接种于含有人参皂苷Rb1的MRS液体培养基中，发酵条件为：33~40℃下摇床培养，摇床转速为70~130r/min，发酵5~7天，获得人参皂苷Rb1发酵液；所述的发酵乳杆菌其保藏编号为CCTCC. M 2016372。

2.根据权利要求1所述的人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，其特征在于：步骤1）所述的人参皂苷Rb1的添加量为2g。

3.根据权利要求2所述的人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，其特征在于：步骤1）所述的调节pH值至5.2。

4. 根据权利要求3所述的人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，其特征在于：步骤1）所述的所述的MRS培养基为：酪蛋白胨 10.0g，牛肉膏 10.0g，酵母粉 5.0g，葡萄糖 5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵 2.0g，Tween 80 1.0g，K₂HPO₄ 2.0g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，MnSO₄.H₂O 0.05g，CaCO₃ 20.0g，琼脂 15.0g，自来水 1.0L，pH6.8，灭菌条件：121℃，15 min。

5.根据权利要求4所述的人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，其特征在于：步骤2）所述的过滤除菌，是用孔径为0.45μm微孔滤膜过滤除菌。

6. 根据权利要求5所述的人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的发酵乳杆菌，其保藏编号为CCTCC. M 2016372，所述的接种量为3%。

7.根据权利要求6所述的人参皂苷Rb1发酵液的制备方法，其特征在于：步骤3）所述的发酵条件为：36~38℃下摇床培养，摇床转速为80~110r/min，发酵7天。

8.权利要求1所述的方法制备的人参皂苷Rb1发酵液在制备治疗高脂饮食引起的肝损伤及炎症反应的药物方面的应用。

9.权利要求1所述的方法制备的人参皂苷Rb1发酵液在制备抑制血清和肝脏中ALT水平升高的药物方面的应用。