CN113512559B - 牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用 - Google Patents

牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及动物传染病防治技术领域。本发明提供了牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用。所述基因突变株在Mbov_0701基因的701核苷酸位点后出现插入突变，在与牛胚胎肺细胞共培养时，表现出显著生长缺陷表型，在PPLO固体培养基上表现为小菌落形态。Mbov_0701基因编码蛋白是一种核酸外切酶MbovP701，本申请的基因突变株可应用于牛支原体代谢生理、致病和防治药物制备等领域。

Description

牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用
技术领域
本发明涉及动物传染病防治技术领域，尤其涉及牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用。
背景技术
牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于支原体科支原体属成员，是肉牛和奶牛的重要病原体，可致肺炎、关节炎、乳腺炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等等多种疾病。
尽管自牛支原体发现至今已有60年，但目前尚缺乏特异性防控手段用于牛支原体病的防治，而创制特异性防控措施需要特异性分子靶标。确定牛支原体的毒力相关因子是发现牛支原体特异性靶标的前提。本申请人通过基因克隆表达鉴定MbovP701蛋白在Mg2+存在条件下具有降解外源双链DNA的核酸外切酶功能，且为非经典的分泌蛋白，可以分泌至胞体外发挥核酸外切酶的作用，因此是牛支原体防治药物研发的潜在分子靶标。在此基础上，证实其基因缺失突变株在与牛胚胎肺细胞(EBL)共培养时，表现出显著的生长缺陷表型，表明该基因是牛支原体与宿主细胞共生长时所必需的基因，可能通过降解外源核酸为牛支原体提供核苷酸营养。鉴于该蛋白对牛支原体的生长的影响，其突变株可望在牛支原体致病、生理代谢和防治药物等领域具有潜在的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用，Mbov_0701基因的编码蛋白MbovP701为类YqaJ蛋白，具有核酸外切酶活性。与野生菌株比较，突变菌株与牛胚胎肺细胞共培养时，呈现出显著的生长缺陷，在PPLO固体培养基上呈现小菌落表型。基于牛支原体与细胞共培养下的存活能力与毒力相关，该突变株可望在牛支原体致病、生理代谢和药物防治等领域有潜在应用前景。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了牛支原体Mbov_0701突变基因，所述突变基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，所述突变基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了所述突变基因作为牛支原体生长缺陷标志物的应用。
本发明还提供了一株牛支原体Mbov_0701基因突变株，所述基因突变株保藏名称为牛支原体T5.808，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2020541。
本发明还提供了所述牛支原体Mbov_0701基因突变株在制备牛支原体防治药物中的应用。
本发明提供了牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用。所述基因突变株在Mbov_0701基因的701核苷酸位点后出现插入突变，在与牛胚胎肺细胞共培养时，表现出显著生长缺陷表型，在PPLO固体培养基上表现为小菌落形态。Mbov_0701基因编码蛋白是一种核酸外切酶MbovP701，本申请的基因突变株可应用于牛支原体代谢生理、致病和防治药物制备等领域。
附图说明
图1为牛支原体生长缺陷菌株T5.808定量检测分析图；
图2为Mbov_0701基因序列中转座子插入突变位点；
图3牛支原体与EBL细胞共培养生长曲线分析图；
图4牛支原体在PPLO培养基中生长曲线分析图；
图5牛支原体野生株HB0801和突变株T5.808的菌落形态图；
图6牛支原体野生株HB0801和突变株T5.808菌落面积散点图。
保藏说明
牛支原体T5.808，拉丁文为Mycoplasma bovis T5.808，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国，武汉，武汉大学；保藏日期为2020年9月25日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2020541。
具体实施方式
本发明提供了牛支原体Mbov_0701突变基因，所述突变基因的核苷酸序列如SEQID NO：1所示，所述突变基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了所述突变基因作为牛支原体生长缺陷标志物的应用。
本发明还提供了一株牛支原体Mbov_0701基因突变株，所述基因突变株保藏名称为牛支原体T5.808，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2020541。
本发明还提供了所述牛支原体Mbov_0701基因突变株在制备牛支原体防治药物中的应用
在本发明中，所述生长缺陷是指生长缓慢，到达平台期的菌落数量低于普通菌株，菌落变小且菌落形态和普通菌株相比发生明显变化。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1牛支原体生长缺陷突变体的筛选鉴定
利用华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原分室构建的细胞共培养生长缺陷实验模型，将EBL细胞按照4×104cell/cm2铺至24孔细胞培养板，利用感染比为0.5将初筛的18株突变体接种至EBL细胞中，设置野生株HB0801为阳性对照。将突变体与EBL细胞在37℃二氧化碳培养箱中共培养72h。经一次冻融(-80℃/37℃)循环裂解细胞，利用菌落计数法定量测定18株突变体菌落数。结果如图1所示，显示T5.808突变菌株生长缺陷表型显著。
利用细菌基因组提取试剂盒(购自宝生物工程大连有限公司)，提取牛支原体T5.808突变体全基因组，对Tn4001转座子与牛支原体基因组连接处进行测序，将测序结果与牛支原体HB0801全基因组序列进行比对，结果显示，T5.808突变基因为Mbov_0701，转座子插入位点位于基因组832343位点后，位于Mbov_0701基因701位点后，结果如图2所示。
实施例2牛支原体生长缺陷突变体的生长曲线的检测
1.牛支原体在EBL细胞中生长曲线检测
(1)牛支原体培养和计数：取牛支原体HB0801和T5.808分别以1:1000的比例接种于PPLO液体培养基，于37℃，5％CO2培养箱中静置培养36h到达对数末期后，进行CFU计数。即将培养好的菌液进行10倍递增稀释，取10μL适当稀释度的菌液涂布于PPLO固体培养基，倒置于37℃，5％CO2培养箱中培养37d后，在体视显微镜下进行菌落计数，菌落数计算公式为：CFU/mL＝菌落数×稀释度×100。
(2)EBL细胞培养和计数：将EBL细胞培养于MEM完全培养基(即含10％热灭活胎牛血清的MEM培养基，MEM培养基，购自美国Hyclone公司)中，于37℃，5％CO2条件下培养，待细胞长至80％满的单细胞层时，用含0.25％EDTA的胰酶37℃消化处理3min后，立即加入MEM完全培养基(购自美国Hyclone公司)终止消化。1000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用适当体积的MEM完全培养基吹打制成细胞悬液，并对细胞悬液用血球计数板进行计数。计数方法简述如下：取重悬均匀的细胞悬液适量沿盖片边缘缓缓滴入血球计数板，使盖片下充满悬液，在高倍显微镜下对血球计数板四周及中间的5个小格中的细胞进行计数，细胞数/mL＝(5个小格的细胞数/20)×稀释倍数×106。
(3)牛支原体与EBL细胞共培养及生长曲线的检测：取计数好的细胞悬液按2×104cells/cm2接种于24孔细胞培养板，即4×104cells/每孔。取适量计数好的牛支原体悬液于8000g离心10min，菌体沉淀用PBS洗涤3次，将洗涤后的牛支原体用适量MEM完全培养基重悬，使细菌数为2×104CFU/mL。取100μL处理好的菌液于含有EBL细胞的培养板中，并添加MEM完全培养基使每孔液体量为1.5mL。将支原体和细胞混合物于37℃，5％CO2培养箱中分别培养24h、48h和72h。经一次冻融(-80℃/37℃)循环裂解细胞后，取适量菌液进行菌落计数，结果如图3所示，显示突变菌株的生长速度较野生菌株变慢。
2.牛支原体在PPLO中生长曲线的检测
(1)牛支原体培养和计数：取牛支原体HB0801和T5.808以1:1000的比例接种PPLO液体培养基，静置于37℃，5％CO2培养箱中培养36h即到达对数期后，进行CFU计数，方法如下：将培养好的菌液进行10倍递增稀释，取10μL适当稀释度的菌液涂布于PPLO固体培养基，37℃，倒置培养，5％CO2培养箱中培养37d后，在体视显微镜下进行菌落计数，菌落数计算公式为：CFU/mL＝菌落数×稀释度×100。
(2)牛支原体生长曲线的检测：将计数好的牛支原体用PPLO培养基稀释成105CFU/mL，按1:10比例接种至PPLO培养基中，37℃，静置培养，5％CO2培养箱中连续培养72h，每12h取适当菌液进行菌落计数，将各时间点的菌落数对时间作图获得生长曲线，比较突变株和野生株的生长曲线，显示突变菌株相较于野生株呈现生长延迟，野生株在培养24h后到达平台生长期，突变菌株培养48h才到达平台生长期，结果如图4所示。
由于支原体的生物合成和代谢能力有限，其生存需依赖于宿主提供的营养物质。尽管支原体中存在许多代谢的替代途径，可以使其在营养丰富条件下生长良好，但在宿主体内的增殖是病原体传播和建立致病性所必需的，Mbov_0701的缺失导致牛支原体在宿主细胞中生长缺陷，可能导致其对宿主的致病性产生影响。
实施例3牛支原体共培养生长缺陷突变体的形态学观察
(1)显微镜观察牛支原体菌落形态
将培养至对数末期的牛支原体HB0801和T5.808菌株分别稀释适当倍数，涂布于PPLO固体培养基上，于37℃，5％CO2培养箱中培养37d后，在体视显微镜下观察牛支原体菌落形态，结果显示T5.808突变菌株菌落小于HB0801菌株，且形态发生明显变化，如图5所示。
(2)牛支原体菌落面积测定
分别对野生株HB0801，突变株T5.808的50个菌落的面积进行测定，结果显示，突变株T5.808的菌落面积相较于野生株菌落面积显著减小，结果如图6所示。
由以上实施例可知，本发明提供了牛支原体Mbov_0701突变基因及其突变株和应用。所述基因突变株在Mbov_0701基因的701核苷酸位点后出现插入突变，在与牛胚胎肺细胞共培养时，表现出显著生长缺陷表型，在PPLO固体培养基上表现为小菌落形态。Mbov_0701基因编码蛋白是一种核酸外切酶MbovP701，本申请的基因突变株可应用于牛支原体代谢生理、致病和防治药物制备等领域。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 牛支原体Mbov_701突变基因及其突变株和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctaaat actataatgg tgtgcactac acattagatg aagtaaatca tcaagttatc 60
ttgatggata aatttcaaga gcagttatta ggaacaaata aatttttaaa gtttaaaaag 120
ctaggcggtt catcaatatc aaatattttg acacccgatc gttttaatag cgagtttaag 180
gctttttgtc atatagctag attagctctt cctgttttac aaaaaaaata tgtttatgct 240
ggtcaaattt tagagcctaa aatcattgat aatttgcaag aattttacac caaaaaattg 300
cttaaaagca ctataatcaa gcatattgaa gcaaaagatg ttgattatga ctactttaaa 360
aatttagata ttattggtgg tgtgccagat gctttagctg aaaatgaaaa aattgttttt 420
gaaattaaaa caactaatat aaaaaactat gattcttgaa ctttaaacgg tcaagctaat 480
aaattaaaaa aagatggtgt tcctcttggc tataaaaaac aagcacagct atatgcaagc 540
cttctaggct acgattctta tattattgta ggttgctttt taaatgatga tgattatgac 600
aagcccgaaa atgttgacgt ctcaaaaaga aaaattgaag cattccatta ttcattaaaa 660
aataatttgg atttacaaat gcaaatcaaa gatgacattc aaaaaataat agagtttcat 720
aaaagatata gcgttttaaa agaaaagaaa tcgcctaagt atgatttaat tcatgacaaa 780
gatcaggtgg actatcttag atgcaaaaat gaaaccgaaa gaagagaact ttttgacaaa 840
tgaaaagaaa tgggtaaaat tgataatgat tttccatttg aatcatttta a 891
<210> 2
<211> 296
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Lys Tyr Tyr Asn Gly Val His Tyr Thr Leu Asp Glu Val Asn
1 5 10 15
His Gln Val Ile Leu Met Asp Lys Phe Gln Glu Gln Leu Leu Gly Thr
20 25 30
Asn Lys Phe Leu Lys Phe Lys Lys Leu Gly Gly Ser Ser Ile Ser Asn
35 40 45
Ile Leu Thr Pro Asp Arg Phe Asn Ser Glu Phe Lys Ala Phe Cys His
50 55 60
Ile Ala Arg Leu Ala Leu Pro Val Leu Gln Lys Lys Tyr Val Tyr Ala
65 70 75 80
Gly Gln Ile Leu Glu Pro Lys Ile Ile Asp Asn Leu Gln Glu Phe Tyr
85 90 95
Thr Lys Lys Leu Leu Lys Ser Thr Ile Ile Lys His Ile Glu Ala Lys
100 105 110
Asp Val Asp Tyr Asp Tyr Phe Lys Asn Leu Asp Ile Ile Gly Gly Val
115 120 125
Pro Asp Ala Leu Ala Glu Asn Glu Lys Ile Val Phe Glu Ile Lys Thr
130 135 140
Thr Asn Ile Lys Asn Tyr Asp Ser Trp Thr Leu Asn Gly Gln Ala Asn
145 150 155 160
Lys Leu Lys Lys Asp Gly Val Pro Leu Gly Tyr Lys Lys Gln Ala Gln
165 170 175
Leu Tyr Ala Ser Leu Leu Gly Tyr Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Cys
180 185 190
Phe Leu Asn Asp Asp Asp Tyr Asp Lys Pro Glu Asn Val Asp Val Ser
195 200 205
Lys Arg Lys Ile Glu Ala Phe His Tyr Ser Leu Lys Asn Asn Leu Asp
210 215 220
Leu Gln Met Gln Ile Lys Asp Asp Ile Gln Lys Ile Ile Glu Phe His
225 230 235 240
Lys Arg Tyr Ser Val Leu Lys Glu Lys Lys Ser Pro Lys Tyr Asp Leu
245 250 255
Ile His Asp Lys Asp Gln Val Asp Tyr Leu Arg Cys Lys Asn Glu Thr
260 265 270
Glu Arg Arg Glu Leu Phe Asp Lys Trp Lys Glu Met Gly Lys Ile Asp
275 280 285
Asn Asp Phe Pro Phe Glu Ser Phe
290 295

Claims (2)

1.一株牛支原体Mbov_0701基因突变株，其特征在于，所述基因突变株保藏名称为牛支原体T5.808，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2020541。
2.权利要求1所述牛支原体Mbov_0701基因突变株在制备牛支原体防治药物中的应用。
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