CN113185588A

CN113185588A - 一种牛支原体MbovP701蛋白及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113185588A
Application number: CN202110466319.3A
Authority: CN
Inventors: 郭爱珍; 李茜茜; 郝智瑜; 朱习芳; 赵刚; 张慧; 陈颖钰; 胡长敏; 陈曦; 陈建国
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-04-28
Filing date: 2021-04-28
Publication date: 2021-07-30

Abstract

本发明涉及动物传染病防治技术领域，尤其涉及一种牛支原体MbovP701蛋白及其制备方法与应用。本发明的MbovP701蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，编码该蛋白的核苷酸如SEQIDNO：2所示。本发明的MbovP701蛋白在Mg²⁺存在条件下具有降解外源双链DNA的核酸外切酶功能，且为非经典的分泌蛋白，可以分泌至胞体外发挥核酸外切酶的作用，为牛支原体生长提供必需的营养物质。因此该蛋白可作为分子靶标，应用于制备牛支原体防治药物。

Description

一种牛支原体MbovP701蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及动物传染病防治技术领域，尤其涉及一种牛支原体 MbovP701蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)属于古柔膜体纲(Mollicutes)，支原体目(Mycoplasmatles)，支原体科，支原体属，是引起肉牛和奶牛多种疾病的重要病原体。牛支原体感染主要导致牛肺炎，也可致乳腺炎、关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种病症。随着全球化一体化的发展，牛支原体已呈全球流行的趋势。在法国，其患有肺炎的牛场中牛支原体的分离率30％；在英国，其患有肺炎的牛场中牛支原体抗体阳性率为20％-25％；在爱尔兰，其患有肺炎的牛场中牛支原体的分离率为 13％-23％。有研究表明牛支原体肺炎的爆发与运输应极密切相关，临床上对于牛支原体病的预防主要通过加强饲养管理，减少长途运输等应激因素造成的影响。

目前尚缺乏特异性防控手段用于牛支原体病的防治，而创制特异性防控措施需要特异性分子靶标。确定牛支原体的毒力相关因子是发现牛支原体特异性靶标的前提。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛支原体MbovP701蛋白及其制备方法与应用，本发明的牛支原体MbovP701蛋白有望作为特异性的分子靶标，应用于牛支原体病的防治中。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种牛支原体MbovP701蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ IDNO：1所示；

编码所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了所述的牛支原体MbovP701蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)将Mbov_0701基因457、841位的TGA密码子突变为TGG，得到SEQ ID NO：2所示的基因序列；

(2)将SEQ ID NO：2所示的基因序列构建重组表达质粒，并转入大肠杆菌DH5α中，得到大肠杆菌DH5α(pET-30a-Mbov_0701)；

(3)提取大肠杆菌DH5α(pET-30a-Mbov_0701)中的质粒，转化入表达菌株中，诱导表达，得到牛支原体MbovP701蛋白。

作为优选，所述Mbov_0701基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

作为优选，所述大肠杆菌DH5α(pET-30a-Mbov_0701)，拉丁文名称为 Escherichiacoli DH5α(pET-30a-Mbov_0701)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年9月25日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020542。

作为优选，所述的表达菌株为大肠杆菌BL21。

作为优选，所述诱导表达的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷。

作为优选，所述诱导表达的温度为35～39℃，诱导表达的时间为 2.5～3.5h。

本发明还提供了所述的牛支原体MbovP701蛋白作为分子靶标在制备牛支原防治药物中的应用。

本发明提供了一种牛支原体MbovP701蛋白及其制备方法与应用，本发明的牛支原体MbovP701蛋白具有如下优点：

(1)本发明首次发现牛支原体蛋白MbovP701是一种类YqaJ蛋白，具有核酸外切酶活性，因而是一种毒力相关因子，可望作为分子靶标开发和利用。

(2)本发明编码MbovP701蛋白的核苷酸序列组成的突变菌株T5.808 菌株与细胞共培养时，较野生菌株HB0801呈现生长缺陷表型。同时T5.808 菌株在PPLO培养基中培养时，相较于野生型菌株HB0801呈现显著的生长缺陷及小菌落表型，证明MbovP701对于牛支原体在与宿主细胞共培养条件下的生长至关重要，可望作为分子靶标应用于牛支原体致病和防治药物制备中。

附图说明

图1为pET-30a质粒图谱。

图2为pET-30a-Mbov_0701重组表达质粒图。

图3为支原体MbovP701蛋白以及突变蛋白dlt-1、dlt-2、dlt-3和dlt-wh 蛋白的电泳图(其中从左往右依次为MbovP701、dlt-1、dlt-2、dlt-3、dlt-wh 和Mark)。

图4为琼脂糖凝胶电泳检测MbovP701蛋白降解双链DNA图(其中+ 表示加入MbovP701蛋白，-表示未加入蛋白)。

图5为不同时段MbovP701、dlt-1、dlt-2、dlt-3和dlt-wh蛋白对双链DNA 降解情况图(其中左上为MbovP701降解图，右上为dlt-1蛋白降解图，左中为dlt-2蛋白降解图，右中为dlt-3蛋白降解图，左下为dlt-wh蛋白降解图，右下为空白对照降解图)。

图6为T5.808菌株和HB0801在牛胚胎肺细胞(EBL)中的生长曲线图。

图7为T5.808菌株和HB0801在PPLO培养基的生长曲线图。

图8为HB0801和T5.808菌落的显微图。

图9为HB0801和T5.808菌落面积图。

保藏说明

大肠杆菌DH5α(pET-30a-Mbov_0701)，拉丁文名称为Escherichia coli DH5α(pET-30a-Mbov_0701)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年9月25日，保藏编号为CCTCC NO： M 2020542。

牛支原体HB0801拉丁文名称为Mycoplasma bovis HB0801，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2010年2月 1日，保藏编号为CCTCCNO：M 2010040。

具体实施方式

本发明实施例中所述序列SEQ ID NO：4为SEQ ID NO：2的223-351 位核苷酸缺失的序列，序列长度为762bp，编码的dlt-1蛋白为MbovP701蛋白75-117位氨基酸缺失的蛋白。

本发明实施例中所述序列SEQ ID NO：5为SEQ ID NO：2的370-447 位核苷酸缺失的序列，序列长度为813bp，编码的dlt-2蛋白为MbovP701蛋白124-149位氨基酸缺失的蛋白。

本发明实施例中所述序列SEQ ID NO：6为SEQ ID NO：2的493-555 位核苷酸缺失的序列，序列长度为828bp，编码的dlt-3蛋白为MbovP701蛋白165-185位氨基酸缺失的蛋白。

本发明实施例中所述序列SEQ ID NO：7为SEQ ID NO：2的223-555 位核苷酸缺失的序列，序列长度为558bp，编码的dlt-wh蛋白为MbovP701 蛋白75-185位氨基酸缺失的蛋白。

本发明实施例中所述的pET-30a质粒购自默克中国投资公司。

本发明实施例中所述的DNA连接酶(T4 DNA ligase)购自New England Biolabs(Beijing)LTD。

本发明实施例中所述的蛋白酶抑制剂购自上海罗氏制药有限公司。

本发明实施例中所述的Ni-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料购自GE 医疗公司。

本发明实施例中所述的MEM完全培养基购自美国Hyclone公司。

本发明实施例中所述的PBS溶液中包括质量溶度为0.2g/L的KCl、8g/L 的NaCl，1.44g/L的Na₂HPO₄，0.24g/L的KH₂PO₄；

所述的PBS溶液的pH为7.6。

本发明实施例中所述的上样缓冲液为pH6.8，摩尔浓度1M的Tris-HCl 溶液。

本发明实施例中所述的binding buffer缓冲液中含有摩尔浓度为20mM Na₃PO₄、0.5M NaCl和20mM咪唑；

所述的binding buffer缓冲液的pH为7.4。

本发明实施例中所述的washing buffer缓冲液中含有摩尔浓度为20mM Na₃PO₄、0.5M NaCl和60mM咪唑；

所述的washing buffer缓冲液的pH为7.4。

本发明实施例中所述的elute buffer缓冲液中含有摩尔浓度为20mM Na₃PO₄、0.5MNaCl和1M咪唑；

所述的elute buffer缓冲液的pH为7.4。

本发明实施例中所述的基因序列为SEQ ID NO：3的Mbov_0701基因来自于牛支原体HB0801；

本发明实施例中所述的T5.808株为牛支原体HB0801的突变菌株；

所述突变的位点为Mbov_0701基因457、841位的TGA密码子突变为 TGG；

所述T5.808株为携带牛支原体MbovP701蛋白的菌株。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1牛支原体MbovP701基因的克隆、表达和纯化

将SEQ ID NO：2用EcoRI和HindIII酶进行酶切，同时将pET-30a质粒(如图1所示)用EcoRI和HindIII进行双酶切。将酶切后的序列和pET-30a 质粒用DNA连接酶进行连接，得到重组质粒pET-30a-Mbov_0701(如图2 所示)。用该重组表达质粒pET-30a-Mbov_0701转化大肠杆菌DH 5α后，37℃ 摇床，180r/min，培养12h。提取质粒。用通用载体T7经过测序，确定插入序列正确后转化大肠杆菌表达菌株BL21。将所得的重组大肠杆菌BL21在 LB液体培养基中培养至OD＝0.6时，取1mL菌液作为诱导前对照，同时加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mM，在37℃摇床上诱导表达3h。取1mL菌液进行下一步处理：样品处理方法为12000r/min离心1min 后弃掉上清，加入1mLPBS溶液重悬后，再以12000r/min离心1min弃掉上清，然后加入30μL的PBS和30μL上样缓冲液重悬。在100℃沸水中煮沸 10min，得到牛支原体MbovP701蛋白。

将牛支原体MbovP701蛋白按如下步骤进行纯化：

(1)向亲和层析柱中加入1mLNi-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料；

(2)向亲和层析柱中加入12mL ddH₂O洗涤；

(3)加入12mL的binding buffer平衡柱子；

(4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的蛋白表达上清，收集前几滴滤出的液体；

(5)加入50mL binding buffer缓冲液平衡柱子，收集前几滴液体；

(6)加入50mL washing buffer缓冲液洗去杂蛋白；

(7)加入12mL elute buffer缓冲液洗脱目的蛋白；

(8)配置12％SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中 (20μL/每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120V)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜。然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白，电泳结果如图3所示。

将SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7 按上述步骤诱导表达重组蛋白dlt-1、dlt-2、dlt-3和dlt-wh，酶切位点选择 BamHI和XhoI，并按上述纯化步骤进行纯化，电泳结果如图3所示。

图3显示，表达产物比原蛋白大了约5kDa，原因是为在重组蛋白序列上游添加一段含有His标签的序列，纯化后的牛支原体重组蛋白MbovP701 蛋白的大小约为39kDa，dlt-1的大小为34kDa，dlt-2的大小为35kDa，dlt-3 的大小为36kDa，dlt-wh的大小为26kDa。

实施例2MbovP701蛋白对10000bp双链DNA降解活性的检测

按如下步骤配置MbovP701蛋白核酸外切酶活检测体系：

取250bp双链DNA片段A1μg，加入25mM Tris-HCl(pH8.0)，7.5mM MgCl₂后，再加入30pM MbovP701蛋白，加入ddH₂O补至30μL，37℃过夜反应，琼脂糖凝胶电泳观察MbovP701蛋白对dsDNA的降解情况。以不加 MbovP701蛋白作为对照组。结果如图4所示。

按上述步骤设置MbovP701蛋白对10000bp双链DNA片段B的降解情况，以不加MbovP701蛋白作为对照。结果如图4所示。

图4显示，MbovP701蛋白可以将双链DNA片段完全降解，说明本申请MbovP701蛋白具有核酸外切酶的活性。

实施例3MbovP701蛋白对4000bp双链DNA降解活性的检测

按实施例2所述的MbovP701蛋白酶活检测体系分别配置MbovP701蛋白、dlt-1蛋白、dlt-2蛋白、dlt-3蛋白、dlt-wh蛋白在0min、10min、20min、 30min、60min、120min对序列长度为4000bp的双链DNA片段的降解情况。分别以不加任何蛋白作为对照。结果如图5所示。

图5显示，MbovP701蛋白以及MbovP701蛋白中氨基酸缺失的dlt-1蛋白、dlt-2蛋白、dlt-3蛋白和dlt-wh蛋白均能在120min内将4000bp的dsDNA 降解。说明MbovP701蛋白功能域不在预测的YqaJ蛋白功能域内，MbovP701 可能为类YqaJ蛋白的新型核酸外切酶。

实施例4Mbov_0701基因缺失株T5.808在与宿主细胞(EBL)共培养条件下生长缺陷特性的分析

取牛支原体HB0801和T5.808分别以1:1000的比例接种于PPLO液体培养基，于37℃，5％CO₂培养箱中静置培养36h到达对数末期后，进行CFU 计数。即将培养好的菌液进行10倍递增稀释，取10μL适当稀释度的菌液涂布于PPLO固体培养基，倒置于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～7d后，在显微镜下进行菌落计数，菌落数计算公式为：CFU/mL＝菌落数×稀释度×100。

将EBL细胞培养于MEM完全培养基中，于37℃，5％CO₂条件下培养，待细胞长至80％时，用含0.25％EDTA的胰酶37℃消化处理3min后，立即加入MEM完全培养基终止消化。1000rpm离心5min，弃上清，细胞沉淀用适当体积的MEM完全培养基吹打制成细胞悬液，并对细胞悬液用血球计数板进行计数。计数方法简述如下：取重悬均匀的细胞悬液适量沿盖片边缘缓缓滴入血球计数板，使盖片下充满悬液，在高倍显微镜下对血球计数板四周及中间的5个小格中的细胞进行计数，细胞数/mL＝(5个小格的细胞数/20) ×稀释倍数×10⁶。

取计数好的细胞悬液按2×10⁴cells/cm²接种于24孔细胞培养板，即 4×10⁴cells/每孔。取适量计数好的牛支原体悬液于8000g离心10min，菌体沉淀用PBS洗涤3次，将洗涤后的牛支原体用适量MEM完全培养基重悬，使细菌数为2×10⁴CFU/mL。取100μL处理好的菌液于含有EBL细胞的培养板中，并添加MEM完全培养基使每孔液体量为1.5mL。将支原体和细胞混合物于37℃，5％CO₂培养箱中分别培养24h、48h和72h。经一次冻融 (-80℃/37℃)循环裂解细胞后，取适量菌液进行菌落计数，计数结果如图 6所示。

图6显示，T5.808菌株的生长较HB0801菌株慢。

实施例5Mbov_0701基因缺失株T5.808在PPLO液体培养基中的生长特性

取牛支原体HB0801和T5.808以1:1000的比例接种PPLO液体培养基，静置于37℃，5％CO₂培养箱中培养36h即到达对数期后，进行CFU计数，方法如下：将培养好的菌液进行10倍递增稀释，取10μL适当稀释度的菌液涂布于PPLO固体培养基，37℃，倒置培养，5％CO₂培养箱中培养3～7d后，在体视显微镜下进行菌落计数，菌落数计算公式为：CFU/mL＝菌落数×稀释度×100。

将计数好的牛支原体用PPLO培养基稀释成10⁵CFU/mL，按1:10比例接种至PPLO培养基中，37℃，静置培养，5％CO₂培养箱中连续培养72h，每12h取适当菌液进行菌落计数，将各时间点的菌落数对时间作图获得生长曲线，比较突变株和野生株的生长曲线，显示突变菌株相较于野生株呈现生长延迟，野生株在培养24h后到达平台生长期，突变菌株培养48h才到达平台生长期，结果如图7所示。

由于支原体的生物合成和代谢能力有限，其生存需依赖于宿主提供的营养物质。尽管支原体中存在许多代谢的替代途径，可以使其在营养丰富条件下生长良好，但在宿主体内的增殖是病原体传播和建立致病性所必需的， Mbov_0701的缺失导致牛支原体在宿主细胞中生长缺陷，可能导致其对宿主的致病性产生影响。

实施例6Mbov_0701基因缺失株T5.808在PPLO固体培养基中的形态特征

将培养至对数末期的牛支原体HB0801和T5.808菌株分别稀释适当倍数，涂布于PPLO固体培养基上，于37℃，5％CO₂培养箱中培养3～7d后，在显微镜下观察牛支原体菌落形态，结果如图8所示。

图8显示，T5.808突变菌株菌落小于HB0801菌株，且形态发生明显变化。

分别对野生株HB0801，突变株T5.808的50个菌落的面积进行测定，结果如图9所示。

图9显示，突变株T5.808的菌落面积相较于野生株菌落面积显著减小。

由以上实施例可知，本发明提供了一种牛支原体MbovP701蛋白及其制备方法与应用，本发明的牛支原体MbovP701蛋白具有如下优点：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种牛支原体MbovP701蛋白及其制备方法与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 296

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Lys Tyr Tyr Asn Gly Val His Tyr Thr Leu Asp Glu Val Asn

1 5 10 15

His Gln Val Ile Leu Met Asp Lys Phe Gln Glu Gln Leu Leu Gly Thr

20 25 30

Asn Lys Phe Leu Lys Phe Lys Lys Leu Gly Gly Ser Ser Ile Ser Asn

35 40 45

Ile Leu Thr Pro Asp Arg Phe Asn Ser Glu Phe Lys Ala Phe Cys His

50 55 60

Ile Ala Arg Leu Ala Leu Pro Val Leu Gln Lys Lys Tyr Val Tyr Ala

65 70 75 80

Gly Gln Ile Leu Glu Pro Lys Ile Ile Asp Asn Leu Gln Glu Phe Tyr

85 90 95

Thr Lys Lys Leu Leu Lys Ser Thr Ile Ile Lys His Ile Glu Ala Lys

100 105 110

Asp Val Asp Tyr Asp Tyr Phe Lys Asn Leu Asp Ile Ile Gly Gly Val

115 120 125

Pro Asp Ala Leu Ala Glu Asn Glu Lys Ile Val Phe Glu Ile Lys Thr

130 135 140

Thr Asn Ile Lys Asn Tyr Asp Ser Trp Thr Leu Asn Gly Gln Ala Asn

145 150 155 160

Lys Leu Lys Lys Asp Gly Val Pro Leu Gly Tyr Lys Lys Gln Ala Gln

165 170 175

Leu Tyr Ala Ser Leu Leu Gly Tyr Asp Ser Tyr Ile Ile Val Gly Cys

180 185 190

Phe Leu Asn Asp Asp Asp Tyr Asp Lys Pro Glu Asn Val Asp Val Ser

195 200 205

Lys Arg Lys Ile Glu Ala Phe His Tyr Ser Leu Lys Asn Asn Leu Asp

210 215 220

Leu Gln Met Gln Ile Lys Asp Asp Ile Gln Lys Ile Ile Glu Phe His

225 230 235 240

Lys Arg Tyr Ser Val Leu Lys Glu Lys Lys Ser Pro Lys Tyr Asp Leu

245 250 255

Ile His Asp Lys Asp Gln Val Asp Tyr Leu Arg Cys Lys Asn Glu Thr

260 265 270

Glu Arg Arg Glu Leu Phe Asp Lys Trp Lys Glu Met Gly Lys Ile Asp

275 280 285

Asn Asp Phe Pro Phe Glu Ser Phe

290 295

<210> 2

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggctaaat actataatgg tgtgcactac acattagatg aagtaaatca tcaagttatc 60

ttgatggata aatttcaaga gcagttatta ggaacaaata aatttttaaa gtttaaaaag 120

ctaggcggtt catcaatatc aaatattttg acacccgatc gttttaatag cgagtttaag 180

gctttttgtc atatagctag attagctctt cctgttttac aaaaaaaata tgtttatgct 240

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cttaaaagca ctataatcaa gcatattgaa gcaaaagatg ttgattatga ctactttaaa 360

aatttagata ttattggtgg tgtgccagat gctttagctg aaaatgaaaa aattgttttt 420

gaaattaaaa caactaatat aaaaaactat gattcttgga ctttaaacgg tcaagctaat 480

aaattaaaaa aagatggtgt tcctcttggc tataaaaaac aagcacagct atatgcaagc 540

cttctaggct acgattctta tattattgta ggttgctttt taaatgatga tgattatgac 600

aagcccgaaa atgttgacgt ctcaaaaaga aaaattgaag cattccatta ttcattaaaa 660

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tggaaagaaa tgggtaaaat tgataatgat tttccatttg aatcatttta a 891

<210> 3

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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tgaaaagaaa tgggtaaaat tgataatgat tttccatttg aatcatttta a 891

<210> 4

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggctaaat actataatgg tgtgcactac acattagatg aagtaaatca tcaagttatc 60

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gctttttgtc atatagctag attagctctt cctgttttac aatactttaa aaatttagat 240

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<210> 5

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggctaaat actataatgg tgtgcactac acattagatg aagtaaatca tcaagttatc 60

ttgatggata aatttcaaga gcagttatta ggaacaaata aatttttaaa gtttaaaaag 120

ctaggcggtt catcaatatc aaatattttg acacccgatc gttttaatag cgagtttaag 180

gctttttgtc atatagctag attagctctt cctgttttac aaaaaaaata tgtttatgct 240

ggtcaaattt tagagcctaa aatcattgat aatttgcaag aattttacac caaaaaattg 300

cttaaaagca ctataatcaa gcatattgaa gcaaaagatg ttgattatga ctactttaaa 360

aatttagatt atgattcttg gactttaaac ggtcaagcta ataaattaaa aaaagatggt 420

gttcctcttg gctataaaaa acaagcacag ctatatgcaa gccttctagg ctacgattct 480

tatattattg taggttgctt tttaaatgat gatgattatg acaagcccga aaatgttgac 540

gtctcaaaaa gaaaaattga agcattccat tattcattaa aaaataattt ggatttacaa 600

atgcaaatca aagatgacat tcaaaaaata atagagtttc ataaaagata tagcgtttta 660

aaagaaaaga aatcgcctaa gtatgattta attcatgaca aagatcaggt ggactatctt 720

agatgcaaaa atgaaaccga aagaagagaa ctttttgaca aatggaaaga aatgggtaaa 780

attgataatg attttccatt tgaatcattt taa 813

<210> 6

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggctaaat actataatgg tgtgcactac acattagatg aagtaaatca tcaagttatc 60

ttgatggata aatttcaaga gcagttatta ggaacaaata aatttttaaa gtttaaaaag 120

ctaggcggtt catcaatatc aaatattttg acacccgatc gttttaatag cgagtttaag 180

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caggtggact atcttagatg caaaaatgaa accgaaagaa gagaactttt tgacaaatgg 780

aaagaaatgg gtaaaattga taatgatttt ccatttgaat cattttaa 828

<210> 7

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggctaaat actataatgg tgtgcactac acattagatg aagtaaatca tcaagttatc 60

ttgatggata aatttcaaga gcagttatta ggaacaaata aatttttaaa gtttaaaaag 120

ctaggcggtt catcaatatc aaatattttg acacccgatc gttttaatag cgagtttaag 180

gctttttgtc atatagctag attagctctt cctgttttac aatcttatat tattgtaggt 240

tgctttttaa atgatgatga ttatgacaag cccgaaaatg ttgacgtctc aaaaagaaaa 300

attgaagcat tccattattc attaaaaaat aatttggatt tacaaatgca aatcaaagat 360

gacattcaaa aaataataga gtttcataaa agatatagcg ttttaaaaga aaagaaatcg 420

cctaagtatg atttaattca tgacaaagat caggtggact atcttagatg caaaaatgaa 480

accgaaagaa gagaactttt tgacaaatgg aaagaaatgg gtaaaattga taatgatttt 540

ccatttgaat cattttaa 558

Claims

1.一种牛支原体MbovP701蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

编码所述蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的牛支原体MbovP701蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述Mbov_0701基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述所述大肠杆菌DH5α(pET-30a-Mbov_0701)，拉丁文名称为Escherichia coli DH5α(pET-30a-Mbov_0701)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年9月25日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020542。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的表达菌株为大肠杆菌BL21。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷。

7.根据权利要求2～6任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的温度为35～39℃，诱导表达的时间为2.5～3.5h。

8.权利要求1所述的牛支原体MbovP701蛋白作为分子靶标在制备牛支原防治药物中的应用。