CN110592161A - 多糖的制备方法、保健口服液及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多糖的制备方法、保健口服液及其制备方法，该方法包括：利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，获得发酵液；对所述发酵液进行处理，获得多糖。通过这种方式，本发明能够得到营养价值丰富的多糖，进而得到营养价值丰富的保健口服液。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种多糖的制备方法、保健口服液及制备方法。
背景技术
液体发酵技术于20世纪40年代应用于保健食品，于20世纪80年代应用于中药研究。随着微生物研究的深入以及分离技术和结构鉴定的不断发展，通过对中药进行液体培养，除了能够大量增殖菌丝或孢子，还可在发酵液中得到多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、酶、核酸、氨基酸等多种具有生理活性的物质，具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老及提高免疫力等功效；发酵技术应用于药食共有资源，可制得集营养与保健功能于一体的新型食品。
蝙蝠蛾拟青霉(Paeilyes hepiali)经深层发酵所得的干菌丝具有与冬虫夏草相似的有效成分和药理作用，临床验证了其药用价值，是我国卫生部公布可用于进行保健食品生产较早的两种虫草类真菌之一，其菌丝粉已有大量产品面市，该菌种具有发酵周期短，生产工艺较易的特点。多糖作为其中一类具有重要生物活性的物质，在对人类一些疑难病症的治疗方面显示出很好的疗效；多糖及其衍生物具有多种生物学功能，具有多方面的药理作用。
但是，蝙蝠蛾拟青霉经深层发酵所得干菌丝最后得到的多糖，其营养成分比较单一。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种多糖的制备方法、保健口服液及制备方法，能够得到营养价值丰富的多糖，进而得到营养价值丰富的保健口服液。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种多糖的制备方法，包括：利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，获得发酵液；对所述发酵液进行处理，获得多糖。
其中，所述蝙蝠蛾拟青霉菌种是蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种，其中，所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种能够比未诱变的蝙蝠蛾拟青霉菌种产出较高的多糖；其中，所述利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵之前，包括：提供所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种。
其中，所述提供所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种，包括：采用化学诱变剂对未经诱变处理的蝙蝠蛾拟青霉菌株进行诱变，得到所述述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株；利用第一培养基在第一培养条件下培养所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株，获得蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种。
其中，所述化学诱变剂是亚硝基胍；其中，所述第一培养基的组分包括：葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O和维生素B1；其中，所述第一培养基的组分包括：葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、维生素B1；其中，所述第一培养条件是：所述第一培养基的pH值范围是5.5-7.5，培养温度范围是22-28℃，摇床转速范围是120-180转/分。
其中，所述利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，包括：利用种子培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行种子培养，得到种子培养液；利用人参发酵培养基对接种后的种子培养液进行第一发酵培养，得到第一发酵培养液；利用人参发酵培养基对接种后的第一发酵培养液进行补料分批放大的第二发酵培养，得到第二发酵培养液；其中，所述种子培养基的组分包括：葡萄糖、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钙；所述种子培养基的总氮大于或等于9％；所述种子培养基的p H值是5.0-7.0；其中，所述人参发酵培养基是将人参粉末以预定体积比添加到发酵培养基得到的；所述发酵培养基的组分包括：玉米淀粉、葡萄糖、玉米浆、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、的维生素B1；所述发酵培养基的pH值是5.0-7.0；所述第一发酵培养液的接种量是所述人参发酵培养基的体积的6-8％。
其中，所述对所述发酵液进行处理，获得多糖，包括：对所述发酵液进行浓缩处理；采用乙醇沉淀法对浓缩处理后的发酵液进行处理，得到沉淀物，所述沉淀物即为多糖。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种保健口服液，所述保健口服液包括如上任一项制备方法制备得到的多糖。
其中，所述保健口服液还包括牛磺酸、蜂蜜、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、苯甲酸钠及柠檬酸。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种保健口服液的制备方法，包括：提供对如上任一项所述的多糖纯化后的多糖提取母液；利用所述多糖提取母液和除所述多糖提取母液之外的其它保健口服液组分制备得到保健口服液。
其中，所述其它保健口服液组分包括：牛磺酸、蜂蜜、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、苯甲酸钠及柠檬酸；其中，所述利用所述多糖提取母液和除所述多糖提取母液之外的其它保健口服液组分制备得到保健口服液，包括：将所述多糖提取母液、第一其它保健口服液组分倒入配料罐中，加入纯化水至第一预定体积，混合均匀后加热至煮沸灭菌；待灭菌后的溶液冷却后，再加入第二其它保健口服液组分，加入纯化水至第二预定体积，得到保健口服液。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明由于利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，得到的发酵液中的菌丝体还包括人参的营养成分，这使得对发酵液进行处理后得到的多糖除了原来蝙蝠蛾拟青霉菌丝体单一的多糖营养成分外，还包括人参中的营养成分，例如稀有的人参皂苷等等。通过这种方式，能够得到营养价值丰富的多糖，为制备营养价值丰富的营养口服液提供技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。其中：
图1是本发明多糖的制备方法一实施例的流程示意图；
图2是本发明多糖的制备方法另一实施例的流程示意图；
图3是本发明多糖的制备方法又一实施例的流程示意图；
图4是本发明多糖的制备方法又一实施例的流程示意图；
图5是本发明多糖的制备方法又一实施例的流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在详细介绍本发明之前，先了解一下与本发明相关的现有技术情况。
现在社会中，高压白领阶层、频繁出差的工作人员、运动量大易疲劳的运动选手以及时刻准备迎考的学生人群，普遍存在体质下降、慢性病多发的现象，处于健康与疾病之间的过渡状态，即“第三状态”－亚健康状态。但目前还未彻底明确导致亚健康的真正原因，缺乏针对性的治疗措施。所以开发增强免疫力的保健食品，具有广阔的市场空间，适应当前人们生活和工作的需要。因此此类研究具有较高的实际应用价值。
液体发酵技术是将营养物质溶解在液体中作为培养基，然后接入菌种，通过培养得到目的产物的过程。液体发酵，规模大产量高，可以进行工业化连续生产；生产效率高，适于机械化和自动化生产，是当前微生物发酵工业的主要方式。
液体发酵技术于20世纪40年代应用于保健食品，于20世纪80年代应用于中药研究。将中药材与辅料搅拌，置于一定温度和湿度下，通过微生物的发酵达到提高中药药效、改变药性、降低毒副作用、扩大用药品种等目的。随着微生物研究的深入以及分离技术和结构鉴定的不断发展，通过对中药进行液体培养，除了能够大量增殖菌丝或孢子，还可在发酵液中得到多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、酶、核酸、氨基酸等多种具有生理活性的物质。这类生理活性物质具有抗癌、抗炎、抗菌、抗衰老及提高免疫力等功效。发酵技术应用于药食共有资源，可制得集营养与保健功能于一体的新型食品。
综上所述，液体发酵技术在保健食品的研究方面尚处于起步阶段，不可避免地存在一些问题。特别在药物毒性、药理方面的研究较少；发酵后其化学成分的变化及发酵产物的药效学评价相关研究方法学标准也没有建立，严重影响着中药液体发酵技术的发展。液体发酵技术通过微生物作用可将药物降解成小分子活性物质，其更易于通过血脑屏障与人体细胞蛋白结合，可被直接利用。因此，降解后的小分子活性物质具有在人体中吸收较快、较完全，效果较好等优势。
蝙蝠蛾拟青霉(Paeilyes hepiali)经深层发酵所得的干菌丝具有与冬虫夏草相似的有效成分和药理作用，临床验证了其药用价值，是我国卫生部公布可用于进行保健食品生产较早的两种虫草类真菌之一，其菌丝粉已有大量产品面市。该菌种具有发酵周期短，生产工艺较易的特点。作为蝙蝠蛾拟青霉菌丝提取物，多糖是提取物中一类具有重要生物活性的物质，对人类一些疑难病症的治疗方面显示出很好的疗效。多糖及其衍生物具有多种生物学功能，如细胞特异性识别，细胞表面对各种抗原和药物的受体，激活免疫细胞等，从而使多糖具有多方面的药理作用，如降血压、降血脂、健胃保肝、抗氧化、延缓衰老、提高免疫、缓解疲劳等，这使其成为目前药用真菌研究的热点。
蝙蝠蛾拟青霉菌丝体提取的多糖，其营养成分单一，营养价值不高。本发明通过将人参加入培养液中对蝙蝠蛾拟青霉菌株进行液体深层发酵，使得发酵液中的营养成分种类增多；通过优化培育产多糖高的、变异的蝙蝠蛾拟青霉菌株，并优化培养基和培养条件，使多糖含量提高；通过对发酵液进行处理获得粗多糖，粗多糖的提取率增高，用提取的粗多糖制备保健的口服液口感酸甜、略有苦涩味，营养价值高，能舒缓疲劳，提高人体免疫力。
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
参见图1，图1是本发明多糖的制备方法一实施例的流程示意图，该方法包括：
步骤S101：利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，获得发酵液。
步骤S102：对发酵液进行处理，获得多糖。
人参自古誉为“百草之王”，是“滋阴补生，扶正固本”之极品，含多种皂甙和多糖类成分。人参的肉质根为著名强壮滋补药，适用于调整血压、恢复心脏功能、神经衰弱及身体虚弱等症，也有祛痰、健胃、利尿、兴奋等功效。
液体深层发酵也称为浸没式培养，它是利用液体培养基在发酵罐内进行的一种搅拌培养方式。液体深层发酵的优点是：第一，是很多微生物的最适生长环境；第二，菌体及营养物、产物易于扩散，是在均质或拟均质条件下进行的，便于控制，易于扩大生产规模；第三，液体输送方便，易于机械化操作；第四，厂房面积小，生产效率高，易自动化控制，产品质量稳定；第五，产品易于提取、精制等。
液体深层发酵的方式包括分批发酵、连续发酵以及补料分批发酵。分批发酵是指营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长；该方式可以有效地延长分批培养中的对数期。补料分批发酵又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术；该方式可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。
由于利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，得到的发酵液中的菌丝体还包括人参的营养成分，这使得对发酵液进行处理后得到的多糖除了原来蝙蝠蛾拟青霉菌丝体单一的多糖营养成分外，还包括人参中的营养成分，例如稀有的人参皂苷等等。通过这种方式，能够得到营养价值丰富的多糖，为制备营养价值丰富的营养口服液提供技术支持。
在一实施例中，蝙蝠蛾拟青霉菌种是蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种，其中，蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种能够比未诱变的蝙蝠蛾拟青霉菌种产出较高的多糖。
参见图2，其中，步骤S101中，利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵之前，具体可以包括：
步骤S103：提供蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种。
如果有现存的蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种，则可以活化后直接使用。如果没有现存的蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种，则需要对未经诱变处理的蝙蝠蛾拟青霉菌株进行诱变处理。诱变技术是育种的一个重要工具。诱变的方式一般有物理诱变和化学诱变。物理诱变有紫外线、激光、微波、X射线、gama射线、alpha射线、beta射线和快中子等，其中对微生物诱变效果较好、应用较广泛的有紫外线、微波、X射线和gama射线。
参见图3，在一实施例中，步骤S103具体可以包括：子步骤S1031和子步骤S1032。
子步骤S1031：采用化学诱变剂对未经诱变处理的蝙蝠蛾拟青霉菌株进行诱变，得到蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株。
化学诱变中采用的化学诱变剂(有诱变作用的化学物质)很多，主要有烷化剂、亚硝基胍、硫酸二乙醋、氮芥盐酸盐、5溴尿嘧啶等,这些化学诱变剂对细胞都具有强烈的毒性，一般不能被微生物所利用，作用后使微生物发生变异而起到诱变育种的作用。化学诱变剂往往具有专一性,一种诱变剂对基因的某部位发生作用，对其余部位则影响很少。
其中，化学诱变剂是亚硝基胍(NTG，nitroso-guanidin)。NTG用于诱变育种，是公认效果显著的化学超诱变剂。NTG用于诱变育种的主要原理为：亚硝基胍属烷化剂，而烷化剂是突变中一类相当有效的化学诱变剂，这类诱变剂具有1个或多个活性烷基，它们易取代DNA分子中活泼的氢原子，使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化，DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。
步骤S1032：利用第一培养基在第一培养条件下培养蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株，获得蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种。通过这种方式，能够获得足够的蝙蝠蛾拟青霉菌种并连续传代培养。
其中，第一培养基的组分包括：葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O和维生素B1。
其中，第一培养基的组分包括：葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、维生素B1。
在一具体应用中，第一培养基的组分包括：10g/L的葡萄糖、5g/L的酵母浸粉、1g/L的KH2PO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、50mg/L的ZnSO4·7H2O、10mg/L的维生素B1。
其中，第一培养条件是：第一培养基的pH值范围是5.5-7.5，例如：5.5、6.5、7.5，等等，培养温度范围是22-28℃，例如：22℃、25℃、28℃，等等，摇床转速范围是120-180转/分，例如：120转/分、150转/分、180转/分，等等。
参见图4，在一实施例中，步骤S101，利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，具体可以包括：
子步骤S1011：利用种子培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行种子培养，得到种子培养液。
种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。最后一级的种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。
在一实施例中，种子培养基的组分包括：葡萄糖、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钙；种子培养基的总氮大于或等于9％；种子培养基的p H值范围是5.0-7.0，例如：5.0、6.0、7.0，等等。
在一具体应用中，种子培养基的组分包括：3％的葡萄糖，2％的酵母膏，0.2％的硫酸镁，0.1％的磷酸氢二钾，0.2％的磷酸二氢钾，0.03％的氯化钙；种子培养基的总氮大于或等于9％；种子培养基的p H值是6.0。
子步骤S1012：利用人参发酵培养基对接种后的种子培养液进行第一发酵培养，得到第一发酵培养液。
在本实施例中，人参发酵培养基是将人参粉末以预定体积比添加到发酵培养基得到的。其中，人参粉末与发酵培养基的预定体积比是1:50。
发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。
在一实施例中，发酵培养基的组分包括：玉米淀粉、葡萄糖、玉米浆、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、维生素B1；发酵培养基的pH值范围是5.0-7.0，例如：5.0、6.0、7.0，等等。
在一具体应用中，发酵培养基的组分包括：40g/L的玉米淀粉、5g/L的葡萄糖、25g/L的玉米浆、1g/L的硫酸镁、1g/L的磷酸二氢钾、1.5g/L的硫酸锌、25mg/L的维生素B1；发酵培养基的pH值是7.0。
子步骤S1013：利用人参发酵培养基对接种后的第一发酵培养液进行补料分批放大的第二发酵培养，得到第二发酵培养液。
其中，第一发酵培养液的接种量是人参发酵培养基的体积的6-8％，例如：6％、7％、8％，等等。
参见图5，在一实施例中，步骤S102中，对发酵液进行处理，获得多糖，具体可以包括：
步骤S1021：对发酵液进行浓缩处理。浓缩处理的方式包括但不限于：离心、加热煮沸，等等。
步骤S1022：采用乙醇沉淀法对浓缩处理后的发酵液进行处理，得到沉淀物，沉淀物即为多糖。该步骤大概包括酶解提取、加热提取、取上清液，乙醇沉淀上清液、取沉淀物、干燥恒重，即得多糖。
发酵液中是培养出来的大量的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体。多糖是从菌丝体中提取出来的。
下面以一个具体的实际应用来详细说明上述多糖的制备方法。
步骤1，配置恒温摇床的第一培养基：
第一培养基含有以下组分：葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O和维生素B1；进一步，10g/L的葡萄糖、5g/L的酵母浸粉、1g/L的KH2PO4、0.5g/L的MgSO4·7H2O、50mg/L的ZnSO4·7H2O、10mg/L的维生素B1。
第一培养条件的范围值：第一培养基的pH值5.5-7.5，培养温度22-28℃，摇床转速120-180转/分；具体地，第一培养基的pH值6.0，培养温度25℃，摇床转速150转/分。
步骤2，初步选育蝙蝠蛾拟青霉菌株：
采用亚硝基胍化学诱变剂诱导蝙蝠蛾拟青霉菌株突变的操作过程如下：
取新鲜的斜面菌，用pH6.0的0.1mol/L磷酸缓冲液洗下菌体，经离心洗涤，用缓冲液制成菌悬液，浓度为106cfu/mL。配制NTG溶液：由于NTG水溶性较差，所以在配制时先用少量的丙酮溶解，然后再加入缓冲溶液，其比例为9：1，先取9mL缓冲液和1mL的亚硝基胍丙酮溶液配制成浓度为1mg/mL的NTG母液溶液。使用时，取母液0.2mL加入菌悬液1.8mL，即为NTG处理浓度为0.1mg/mL的诱变处理体系，同理配制NTG处理浓度为0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL的诱变处理体系。将以上菌悬液和不同处理浓度NTG溶液混合于各个试管内，研究不同亚硝基胍处理时间和不同浓度亚硝基胍诱变的效果。终止反应时，用生理盐水稀释50倍，离心洗涤，重复3次，除去NTG药物。加入种子培养基，在冰水浴2h。离心除去培养基，用无菌水使沉淀悬浮，并按照十倍浓度梯度稀释法稀释之后，涂布于马铃薯平面培养基，37℃避光培养48h。并以相同的操作，取未经诱变处理的菌液稀释涂布平板，避光培养相同时间作为对照。挑取透明圈直径与菌落直径比大者，转接到发酵培养基中进一步摇瓶复筛，采用苯酚硫酸铵法测定多糖含量，选出产多糖较高的突变菌株。诱导突变的蝙蝠蛾拟青霉菌发生活化，使用接种针将突变的菌株逐一接种于250mL的锥形瓶(装有第一培养基)中，在26℃下、150rpm的恒温摇床中培养48h，获得大量的蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种并连续传代培养。
步骤3，利用含人参的培养液对蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种进行液体深层发酵：
首先利用种子培养基培养，得到种子培养液。种子培养基的组分包括：3％的葡萄糖、2％的酵母膏、0.2％的硫酸镁、0.1％的磷酸氢二钾、0.2％的磷酸二氢钾、0.03％的氯化钙；种子培养基的总氮大于或等于9％；种子培养基的p H值是6.0。
配置发酵培养基，发酵培养基的组分包括：40g/L的玉米淀粉、5g/L的葡萄糖、25g/L的玉米浆、1g/L的硫酸镁、1g/L的磷酸二氢钾、1.5g/L的硫酸锌、25mg/L的维生素B1；发酵培养基的pH值是7.0。
以人参粉末与发酵培养基的体积比是1:50的比例向发酵培养基添加人参粉末，得到人参发酵培养基。利用人参发酵培养基对接种后的种子培养液进行第一发酵培养，得到第一发酵培养液。
步骤4，在步骤3的基础上，对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行补料分批放大发酵培养(即第二发酵培养)，其中，第一发酵培养液的接种量是人参发酵培养基的体积的7％。
步骤5，分离、提取发酵液中蝙蝠蛾拟青霉菌丝体，得到多糖。
使用离心法(15min，4000rpm/min)对发酵液离心，去掉上清，然后将离心后的发酵液加热煮沸、浓缩。使用乙醇沉淀法，具体步骤如下：
1)酶解：将称取的26份200g虫草菌粉分别放于500mL三角瓶中，依次加入300mL蒸馏水及一种酶试剂，添加量为蒸馏水量的0.1％(即0.3g或0.3mL)。将三角瓶置于往复式调速摇床中，设置转速170r/min、温度55℃，提取3h。2)提取后，将三角瓶放入100℃的水浴锅内热水提取3h，加热提取过程结束后常温冷却至室温，于4℃冰箱冷藏过夜。第二天将提取的多糖样液放入高速离心机内4000r/min离心20min，弃去残渣，得到上清液。3)醇沉上述上清液转移到200mL容量瓶内，加蒸馏水定容至200mL。再将200mL上清液分别转移至己编号的1000mL烧杯内，分别加入4倍体积(即800mL)的无水乙醇，混合均匀，置于4℃冰箱醇沉过夜。第三天将醇沉过夜的样液放入高速离心机内4000r/min离心20min，弃去上清液，得到虫草多糖醇沉产物。4)干燥恒重：多糖醇沉产物置于干燥箱60℃烘干至恒重，称重后计算得率。多糖的测定采用分光光度法(苯酚-硫酸法)。
本实施例，加入人参粉末后，沉淀物中除含有菌丝体多糖，还有稀有人参皂苷如Rg3等；且由于采用蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种，增加了多糖的产量及菌丝体，菌丝体生物量为20.9g/L，多糖得率和多糖含量分别为15.28％和50.34％。采用未诱变的蝙蝠蛾拟青霉菌种，菌丝体生物量为15.3g/L，多糖得率和多糖含量分别为12.75％和40.23％。
本发明还提供一种保健口服液，该保健口服液包括如上任一项制备方法制备得到的多糖。
其中，保健口服液还包括牛磺酸、蜂蜜、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、苯甲酸钠及柠檬酸。
在一具体应用中，保健口服液的组分包括：9％的多糖、0.35％的牛磺酸、4.0％的蜂蜜、0.1％的维生素B1、0.1％的维生素B2、0.05％的维生素B6、0.1％的维生素C、0.04％的苯甲酸钠及0.15％的柠檬酸。
上述保健口服液口感微甜、略有苦涩味，能够舒缓疲劳、提高免疫力。
本发明还提供一种保健口服液的制备方法，该方法包括：
提供对上述任一项的多糖纯化后的多糖提取母液；利用多糖提取母液和除多糖提取母液之外的其它保健口服液组分制备得到保健口服液。
其中，其它保健口服液组分包括：牛磺酸、蜂蜜、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、苯甲酸钠及柠檬酸。
其中，利用多糖提取母液和除多糖提取母液之外的其它保健口服液组分制备得到保健口服液，具体可以包括：将多糖提取母液、第一其它保健口服液组分倒入配料罐中，加入纯化水至第一预定体积，混合均匀后加热至煮沸灭菌；待灭菌后的溶液冷却后，再加入第二其它保健口服液组分，加入纯化水至第二预定体积，得到保健口服液。
具体来说，第一其它保健口服液组分包括非热敏性物料，例如：糖液(蜂蜜)、维生素类液、柠檬酸溶液，等等。第一其它保健口服液组分还可以包括辅料。第二其它保健口服液组分包括热敏性物料，例如：蜂王浆等等。第二其它保健口服液组分还可以包括补加的维生素、柠檬酸，等等。
下面以一个具体的实际应用来详细说明上述保健口服液的制备方法。
步骤1，采用热熔沉淀精滤，对提取的多糖进行纯化，进而得到多糖提取母液，在热熔沉淀时加入的水量将多糖的pH值调节为5.0-6.0，多糖液温度为30℃，压力为0.2MPa，滤网的孔径是0.6μm。
步骤2，将多糖提取母液，及其它成分倒入配料罐中；其中，最终浓度分别是：多糖9％、牛磺酸0.35％、蜂蜜4.0％、维生素B1 0.1％、维生素B2 0.1％、维生素B6 0.05％、维生素C 0.1％、苯甲酸钠0.04％及柠檬酸0.15％。
步骤3，按比例加入其余辅料，缓慢加入纯化水至体积，充分搅拌、混合。
步骤4，加热煮沸灭菌30min，待溶液冷却后，加入蜂蜜液充分搅拌、混合。
步骤5，按配方比例加入维生素类液及食用香料柠檬酸，进行充分搅拌。
步骤6，加入纯化水至配液量，过滤；过滤孔径0.45um。
步骤7，使用0.1mol/L的HCL溶液及0.1mol/L的NaOH溶液调节配液的pH值为5.0-6.0，相对密度(相对于水)为1.15-1.25kg/cm3。
步骤8，将配液输送至灌轧工序进行灌装、密封制得保健口服液。
在本实施例中，通过对原料进行提纯、混合等处理，极大限度地保留了原料的营养价值，制得的成品口感丰富，营养价值高。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种多糖的制备方法，其特征在于，包括：
利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，获得发酵液；
对所述发酵液进行处理，获得多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蝙蝠蛾拟青霉菌种是蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种，其中，所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种能够比未诱变的蝙蝠蛾拟青霉菌种产出较高的多糖；
其中，所述利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵之前，包括：
提供所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提供所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种，包括：
采用化学诱变剂对未经诱变处理的蝙蝠蛾拟青霉菌株进行诱变，得到所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株；
利用第一培养基在第一培养条件下培养所述蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株，获得蝙蝠蛾拟青霉诱变菌种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述化学诱变剂是亚硝基胍；
其中，所述第一培养基的组分包括：葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O和维生素B1；
其中，所述第一培养基的组分包括：葡萄糖、酵母浸粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、维生素B1；
其中，所述第一培养条件是：所述第一培养基的pH值范围是5.5-7.5，培养温度范围是22-28℃，摇床转速范围是120-180转/分。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用含人参的培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行液体深层发酵，包括：
利用种子培养基对蝙蝠蛾拟青霉菌种进行种子培养，得到种子培养液；
利用人参发酵培养基对接种后的种子培养液进行第一发酵培养，得到第一发酵培养液；
利用人参发酵培养基对接种后的第一发酵培养液进行补料分批放大的第二发酵培养，得到第二发酵培养液；
其中，所述种子培养基的组分包括：葡萄糖、酵母膏、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钙；所述种子培养基的总氮大于或等于9％；
所述种子培养基的p H值范围是5.0-7.0；
其中，所述人参发酵培养基是将人参粉末以预定体积比添加到发酵培养基得到的；
所述发酵培养基的组分包括：玉米淀粉、葡萄糖、玉米浆、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、维生素B1；
所述发酵培养基的pH值范围是5.0-7.0；
所述第一发酵培养液的接种量是所述人参发酵培养基的体积的6-8％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述发酵液进行处理，获得多糖，包括：
对所述发酵液进行浓缩处理；
采用乙醇沉淀法对浓缩处理后的发酵液进行处理，得到沉淀物，所述沉淀物即为多糖。
7.一种保健口服液，其特征在于，所述保健口服液包括权利要求1-6任一项制备方法制备得到的多糖。
8.根据权利要求7所述的保健口服液，其特征在于，所述保健口服液还包括牛磺酸、蜂蜜、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、苯甲酸钠及柠檬酸。
9.一种保健口服液的制备方法，其特征在于，包括：
提供对权利要求1-6任一项所述的多糖纯化后的多糖提取母液；
利用所述多糖提取母液和除所述多糖提取母液之外的其它保健口服液组分制备得到保健口服液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述其它保健口服液组分包括：牛磺酸、蜂蜜、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、苯甲酸钠及柠檬酸；
其中，所述利用所述多糖提取母液和除所述多糖提取母液之外的其它保健口服液组分制备得到保健口服液，包括：
将所述多糖提取母液、第一其它保健口服液组分倒入配料罐中，加入纯化水至第一预定体积，混合均匀后加热至煮沸灭菌；
待灭菌后的溶液冷却后，再加入第二其它保健口服液组分，加入纯化水至第二预定体积，得到保健口服液。
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|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111139277A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-12 | 长春工业大学 | 粗多糖及其制备工艺、保健口服液及其制备方法 |
| CN118028113A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-05-14 | 江苏神华药业有限公司 | 一种蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103627770A (zh) * | 2012-08-23 | 2014-03-12 | 云南云百草实验室有限公司 | 两种拟青霉属真菌对三七的生物转化 |
| CN104911109A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-16 | 吉林大学 | 一种高产蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株及培育方法 |
| CN106520562A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-03-22 | 锬酃藏虫草生物科技(深圳)有限公司 | 一种利用参类提取物培养冬虫夏草菌的方法及其应用 |
| CN108504621A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-09-07 | 江西国药有限责任公司 | 用于蝙蝠蛾拟青霉Cs-4的培养基及其制备方法 |
| CN109394823A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-01 | 四川长重宝生物工程有限责任公司 | 一种以复合菌发酵制备改良益母健的制备方法 |
-
2019
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103627770A (zh) * | 2012-08-23 | 2014-03-12 | 云南云百草实验室有限公司 | 两种拟青霉属真菌对三七的生物转化 |
| CN104911109A (zh) * | 2015-05-28 | 2015-09-16 | 吉林大学 | 一种高产蝙蝠蛾拟青霉诱变菌株及培育方法 |
| CN106520562A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-03-22 | 锬酃藏虫草生物科技(深圳)有限公司 | 一种利用参类提取物培养冬虫夏草菌的方法及其应用 |
| CN108504621A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-09-07 | 江西国药有限责任公司 | 用于蝙蝠蛾拟青霉Cs-4的培养基及其制备方法 |
| CN109394823A (zh) * | 2018-12-13 | 2019-03-01 | 四川长重宝生物工程有限责任公司 | 一种以复合菌发酵制备改良益母健的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张命龙 等: "蝙蝠蛾拟青霉液体发酵工艺优化及菌丝体腺苷含量的测定", 《菌物学报》 * |
| 马子君 等: "人参对冬虫夏草蝙蝠蛾拟青霉固体发酵的影响", 《人参研究》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111139277A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-05-12 | 长春工业大学 | 粗多糖及其制备工艺、保健口服液及其制备方法 |
| CN118028113A (zh) * | 2023-12-29 | 2024-05-14 | 江苏神华药业有限公司 | 一种蝙蝠蛾拟青霉营养分割流加发酵的方法 |
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