CN115433289B - 一种益生元、提取方法及在富集肠道益生菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了益生元、提取方法，并将提取的益生元应用于筛选调节糖脂代谢肠道益生菌中，益生元的结构为α‑T‑Glcp‑1→3‑β‑Glcp‑1→(5‑α‑Araf‑1)3→3‑α‑(6‑OAc)→Glcp‑1，由2个葡萄糖、1个6‑乙酰基葡萄糖及3个阿拉伯糖分子通过α‑1,3、α‑1,5、β‑1,5连接而成；以该益生元筛选肠道益生菌，对小鼠进行灌胃处理，筛选益生元最显著富集的肠道菌群，然后将该菌群与其他菌群进行相关性分析，获得肠道益生菌。
Description
技术领域
本发明涉及肠道益生菌筛选技术领域，更具体地说是涉及一种益生元、提取方法及应用。
背景技术
糖脂代谢是机体能量供给的重要生命过程，其稳态平衡是宿主应对体内外各种应激反应的重要保障。糖脂代谢紊乱会引发肥胖、糖尿病、血脂异常及脂肪肝等系列慢性疾病，严重威胁人类健康。随着人们生活节奏及饮食习惯的改变，与环境及营养等因素息息相关的慢性疾病的患病人数急速上升。
糖脂代谢紊乱的发生与高脂饮食及缺乏运动的生活方式、遗传、代谢及环境等因素相关。此外，研究证实肠道菌群在肥胖和糖尿病等糖脂代谢紊乱疾病的发病过程中起关键作用。近年来研究显示，膳食干预是影响肠道菌群结构及功能的重要手段，其中，肠道菌群可对营养组分的变化作出迅速反应，而好的饮食习惯也对肠道微生物结构的稳定起到了关键性的作用，由此，通过膳食干预肠道微生物改善糖脂代谢紊乱成为食品营养学研究的新切入点。而通过直接补充肠道益生菌是一种直接有效的方式，但目前益生菌主要从环境或者土壤中筛选，存在工作量大、且不确定性高等缺点。
因此，如何提供一种益生元的提取方法及应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种益生元、提取方法及应用，通过制备特定结构的益生元，富集具有调控糖脂代谢活性的肠道益生菌。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
益生元在筛选调节糖脂代谢肠道益生菌中的应用，益生元由2个葡萄糖、1个6-乙酰基葡萄糖及3个阿拉伯糖分子通过α-1,3、α-1,5、β-1,5连接而成，其结构为α-T-Glcp-1→3-β-Glcp-1→(5-α-Araf-1)3→3-α-(6-OAc)→Glcp-1。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种益生元，所述益生元为α-T-Glcp-1→3-β-Glcp-1→(5-α-Araf-1)3→3-α-(6-OAc)→Glcp-1。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种益生元的提取方法，过程包括：
(1)以干燥的桑叶为原料，将16-20％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子中，在75℃的条件下水提多糖10-15h，使用终浓度为60％-80％乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
(2)取5-9％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.2-0.5％(w/v)，调整pH值为6.0-6.5，在300-600MPa的条件下反应1-2h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到益生元粗反应液；
(3)将益生元粗反应液依次经过醇沉、纳滤、反渗透，将益生元粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液；
(4)将20-25％(w/v)初步纯化的益生元溶液加入到80cm×5.0cm离子交换树脂层析柱DEAE-Spepharose Fast Flow中，以0.3mol/L NaCl为洗脱剂，洗脱流速为1.0-2.0mL/min，收集60-200min洗脱液，反渗透浓缩，然后将20-25％(w/v)浓缩液加入到80cm×5.0cm葡聚糖凝胶G-15柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为1.0-2.0mL/min，收集150-250min洗脱液，反渗透浓缩，得到纯化后的益生元溶液；
(5)通过核磁分析鉴定所制备的益生元具有特定的结构，其为：α-T-Gl cp-1→3-β-Glcp-1→(5-α-Araf-1)3→3-α-(6-OAc)→Glcp-1。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种筛选调节糖脂代谢的肠道益生菌的方法，其特征在于，以所述的益生元筛选，过程包括：以所述益生元对小鼠进行灌胃处理，筛选益生元最显著富集的肠道菌群，然后将该菌群与其他菌群进行相关性分析，获得肠道益生菌。
作为上述技术方案优选的技术方案，灌胃用的益生元为25-100mg/kg.bw的益生元溶液。
作为上述技术方案优选的技术方案，益生元能特异性显著促进肠道菌群慢葡萄球菌、停滞棒杆菌、鼠乳杆菌的增殖，显著抑制毛螺菌科细菌28-4、梭菌sp.ASF502菌的生长。
作为上述技术方案优选的技术方案，肠道益生菌的有效活菌总数为108-1010CFU/mL，灌胃剂量为2.5-10mL/kg·bw，灌胃时间为60-90d。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种能调节糖脂代谢的肠道益生菌，其特征在于，所述益生菌由上述所述的方法筛选得到。
作为上述就似乎方案优选的技术方案，所述益生菌为停滞棒杆菌。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种具有特定结构的益生元，该益生元从桑叶中经特定的工艺提取出来，可以定向富集肠道益生菌；而且经过该特定结构的益生元富集后，肠道益生菌得到最大限度的繁殖，进而调节糖脂代谢，该种筛选方法可以快速定向地筛选出肠道益生菌。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1-3及对比例1-3显著影响肠道菌群的相关性分析；a、b、c、d、e、f、g分别对应实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例5；
图2附图为本发明实施例1益生元的核磁图谱；a、b、c、d分别对应1H和13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC分析结果；
图3附图为本发明实施例1-3及对比例1-3显著影响糖脂代谢紊乱小鼠菌群图；其中，a、b、c、d、e、f、g分别对应实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3、对比例5的结果；
图4附图为本发明实施例1-3显著富集的停滞棒状菌调控糖脂代谢活性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1一种筛选调节糖脂代谢肠道益生菌的方法，过程包括：
以干燥的桑叶为原料，将16％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子中，在75℃的条件下水提多糖15h，使用终浓度为80％乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
取5％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.5％(w/v)，调整pH值为6.0，在600MPa的条件下反应4h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到低聚糖粗反应液；
将低聚糖粗反应液依次经过终浓度为80％(v/v)乙醇醇沉及在0.3MPa下，以1L/h流速过纳滤(300Da)、反渗透膜，将低聚糖粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液；
将20％(w/v)初步纯化的益生元溶液加入到离子交换树脂层析柱DEAE-Spepharose Fast Flow(80cm×5.0cm)中，以0.3mol/L NaCl为洗脱剂，洗脱流速为1.0mL/min，收集100-200min洗脱液，反渗透浓缩，然后将20％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-15(80cm×5.0cm)柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为1.0mL/min，收集200-250min洗脱液，反渗透浓缩，得到纯化后的益生元溶液；对益生元结构进行鉴定，益生元由2个葡萄糖、1个6-乙酰基葡萄糖及3个阿拉伯糖分子通过α-1,3、α-1,5、β-1,5连接而成，其结构为α-T-Glcp-1→3-β-Glcp-1→(5-α-Araf-1)3→3-α-(6-OAc)→Glcp-1；
将纯化后的益生元溶液(50mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠(n＝10，每组10只小鼠)，灌胃时间60天；分析益生元对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，确定益生元最显著富集的肠道菌群(停滞棒杆菌)，并通过划线分离法得停滞棒杆菌。
实施例2
一种筛选调节糖脂代谢肠道益生菌的方法，过程包括：
以干燥的桑叶为原料，将18％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子中，在75℃的条件下水提多糖12.5h，使用终浓度为60％-80％乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
取7％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.35％(w/v)，调整pH值为6.3，在450MPa的条件下反应4.5h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到低聚糖粗反应液；
将低聚糖粗反应液依次经过终浓度为70％(v/v)乙醇醇沉及在0.2MPa下，以2L/h流速过纳滤(300Da)、反渗透膜，将低聚糖粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液；
将23％(w/v)初步纯化的益生元溶液加入到80cm×5.0cm离子交换树脂层析柱DEAE-Spepharose Fast Flo中，以0.3mol/L NaCl为洗脱剂，洗脱流速为1.5mL/min，收集80-180min洗脱液，反渗透浓缩，然后将23％(w/v)浓缩液加入到80cm×5.0cm葡聚糖凝胶G-15柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为1.50mL/min，收集175～225min洗脱液，反渗透浓缩，得到纯化后的益生元溶液；对益生元结构进行鉴定，益生元由2个葡萄糖、1个6-乙酰基葡萄糖及3个阿拉伯糖分子通过α-1,3、α-1,5、β-1,5连接而成，其结构为α-T-Glcp-1→3-β-Glcp-1→(5-α-Araf-1)3→3-α-(6-OAc)→Glcp-1；
将纯化后的益生元溶液(100mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠(n＝10，每组10只小鼠)，灌胃时间75天；分析益生元对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，确定益生元最显著富集的肠道菌群(停滞棒杆菌)，并通过划线分离法得到停滞棒杆菌。
实施例3
一种筛选调节糖脂代谢肠道益生菌的方法，过程包括：
以干燥的桑叶为原料，将20％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子中，在75℃的条件下水提多糖10h，使用终浓度为60％-80％乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
取9％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.2％(w/v)，调整pH值为6.5，在300MPa的条件下反应5h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到低聚糖粗反应液；
将低聚糖粗反应液依次经过终浓度为60％(v/v)乙醇醇沉及在0.2MPa下，以3L/h流速过纳滤(300Da)、反渗透膜，将低聚糖粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液；
将25％(w/v)初步纯化的益生元溶液加入到80cm×5.0cm离子交换树脂层析柱DEAE-Spepharose Fast Flow中，以0.3mol/L NaCl为洗脱剂，洗脱流速为2.0mL/min，收集60-160min洗脱液，反渗透浓缩，然后将25％(w/v)浓缩液加入到80cm×5.0cm葡聚糖凝胶G-15柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为2.0mL/min，收集150～200min洗脱液，反渗透浓缩，得到纯化后的益生元溶液；对益生元结构进行鉴定，益生元由2个葡萄糖、1个6-乙酰基葡萄糖及3个阿拉伯糖分子通过α-1,3、α-1,5、β-1,5连接而成，其结构为α-T-Glcp-1→3-β-Glcp-1→(5-α-Araf-1)3→3-α-(6-OAc)→Glcp-1；
将纯化后的益生元溶液(25mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠(n＝10，每组10只小鼠)，灌胃时间90天；分析益生元对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，确定益生元最显著富集的肠道菌群(停滞棒杆菌)，并通过划线分离法得到停滞棒杆菌。
对比例1
将商业化的低聚果糖溶液(50mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间60天；分析低聚果糖对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响。
对比例2
将商业化的低聚半乳糖溶液(50mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间60天；分析低聚半乳糖对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响。
对比例3
将商业化的低聚异麦芽糖溶液(50mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间60天；分析低聚异麦芽糖对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响。
对比例4
以干燥的桑叶为原料，将16％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子中，在75℃的条件下水提多糖15h，使用终浓度为80％乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
取5％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.5％(w/v)，调整pH值为6.0，在600MPa的条件下反应4h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到低聚糖粗反应液；
将低聚糖粗反应液依次经过终浓度为80％(v/v)乙醇醇沉及在0.3MPa下，以1L/h流速过纳滤(300Da)、反渗透膜，将低聚糖粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液；
将初步纯化的益生元溶液(20％，w/v)加入到离子交换树脂层析柱中，以去离子水为洗脱剂，收集洗脱液，反渗透浓缩，然后将浓缩液(20％，w/v)加入到葡聚糖凝胶G-25柱中，以去离子水为洗脱剂，收集洗脱液，反渗透浓缩，得到纯化后的益生元。
将100mg益生元完全溶解于95％D2O中，冷冻干燥，反复三次后将益生元溶解于D2O中，过0.22μm水系滤膜后，装入核磁管。
检测条件：使用Bruker 600M超导核磁共振波谱仪，TXI反相三共振探头(5mm)，1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、谱均在298K检测；1H谱与13C谱分别在600和150MHz扫描完成，采用标准Bruker脉冲序列进行1H-1HCOSY、HSQC及HMBC分析，使用MestReNova 6.1.1软件解析上述图谱。
通过一维和二维核磁(1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC)分析鉴定所制备的益生元具有特定的结构，其为：α-(2-OAc)-Manp-1→2-β-Glcp-1→4-β-Glcp-1→4-α-Glcp-1→2-α-Glcp-1→2-α-Galp-1→2-β-Galp-1→2-β-Galp-1。
对比例5
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到10％(w/v)溶液，在pH4.9、80℃下进行水提多糖，提取时间为8h，5000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶多糖溶液；
取3％桑叶多糖溶液，加入1％半纤维素酶，反应温度为50℃，反应时间为8h，反应pH 6.0，8000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶低聚糖粗反应液；
将桑叶低聚糖粗反应液通过联合使用纳滤(200Da)和超滤(2000Da)膜系统将低聚糖粗反应液中的单糖和未被酶降解且分子量大于2000Da的多糖去除，得到初步纯化的低聚糖溶液；
将上述初步纯化的低聚糖溶液(20％，w/v)加入到DEAE-52层析柱中(20mm×300mm)，以0.3mol/L的NaCl为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集250-400min的洗脱液MLO2，浓缩；随后将5％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-15柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集70-130min的洗脱液，浓缩得到分离纯化后的桑叶低聚糖MLO2-1溶液。
将纯化后的益生元溶液(25mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠(n＝10，每组10只小鼠)，灌胃时间90天；分析益生元对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，确定益生元最显著富集的肠道菌群(鼠乳杆菌)，并通过划线分离法得到鼠乳杆菌。通过Spearman相关性分析发现，如图1所示，在实施例1-3显著影响的肠道菌群中，只有停滞棒杆菌与其他菌都存在显著相关性，说明本发明制备的益生元能定向富集停滞棒杆菌，从而影响其他菌的丰度。而在对比例1-3中，没有特定一种或几种菌与其显著影响的肠道菌群之间都存在显著相关性，说明对比例1-3并不能定向富集肠道菌群。而对比例5显著影响的肠道菌群中，只有鼠乳杆菌与其他菌都存在显著相关性。(益生元调控糖脂代谢的机制主要是通过调节肠道菌群的结构及其被肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸等代谢物从而进一步影响机体的糖脂代谢过程，发挥调控活性。而不同益生元结构不一样，导致其影响的肠道菌群也不一样，而不同肠道菌群影响机体糖脂代谢活性又相差很大)。
具体分析过程包括宏基因组分析
①DNA的提取利用细菌DNA提取试剂盒提取盲肠内容物DNA，利用NanoDrop 2000对DNA纯度和浓度进行检测，并通过2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量
②DNA文库的构建及测序取1μg上述DNA加入37.5μLFragmentation buffer将DNA打断，重复多次直至DNA片段为300bp左右，使用电泳检测DNA打断效果。随后向DNA片段中加入End-Repair Mix于25℃进行末端修复30min，修复后使用DNA纯化试剂盒进行纯化，然后加入A-Tailing Mix使DNA3’末端加上PolyA尾，最后在DNA片段两端接入测序接头。运用2％琼脂糖凝胶对上述DNA片段进行PCR扩增。随后纯化PCR产物，使用2％琼脂糖电泳对其纯度进行检测，并用QuantiFluorTM-ST定量分析产物浓度，随后构建DNA文库。对文库质量进行检测，确保文库DNA有效浓度超过2nmol/L，然后用Illumina HiSeq2500对文库进行高通量测序。
③数据分析得到测试原始数据后，首先通过Cutadapt彻底清除原始数据中的Illumina接头序列，再用PrinSEQ去除低质量的序列片段和个别序列。处理后的数据通过Bowtie2比对去除宿主来源的基因，获得用于后续分析的有效数据(Clean Reads)，然后进行De Novo组装，对所有序列整合并去冗余得到Unigene集合。随后对Unigene进行物种和功能注释。通过物种注释分析菌群群落结构，并选取相似度最高的基因序列并对其进行功能注释和富集分析。
针对实施例3制备得到的功能性低聚糖和停滞棒杆菌进行了各种性能指标的测试分析，测试标准及分析结果如下：
核磁分析
将100mg益生元完全溶解于95％D2O中，冷冻干燥，反复三次后将低聚糖溶解于D2O中，过0.22μm水系滤膜后，装入核磁管。检测条件:使用Bruker 600M超导核磁共振波谱仪，TXI反相三共振探头(5mm)，1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC谱均在298K检测；1H谱与13C谱分别在600和150MHz扫描完成，采用标准Bruker脉冲序列进行1H-1HCOSY、HSQC及HMBC分析，使用MestReNova 6.1.1软件解析上述图谱，见图2
分析实施例1-3、对比例1-3、5对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，如图3所示。实施例1-3能肠道菌群慢葡萄球菌、停滞棒杆菌、鼠乳杆菌等细菌增殖，显著抑制毛螺菌科细菌28-4、梭菌sp.ASF502等菌的生长；而对比例1主要促进Acutalibacter 1XD8-33、台湾乳杆菌(Lactobacillus taiwanensi s)、Pseudofiavonifractor Marseille-P3106、Clostridium AT4、Intestinimonas massiliensis、Eubacterium xylanophilum的增殖，抑制Desulfovibrionaceae ba cterium、Parabacteroides goldsteinii、ParabacteroidesASF519等菌的生长；对比例2主要促进Lactobacillus hominis及巴氏生孢八叠球菌(Sporosarcina pasteurii)的生长，抑制Bacteroides acidifaciens、Desulfovibrionaceae bacterium、Mailhella massiliensis等菌的增殖；对比例3主要促进假长双歧杆菌(Bi fidobacterium pseudomonas)、Colidextribacter OB.20、Bacterium1xD42-67的增殖，抑制Lachnoclostridium An181、Bacteroides acidifaciens、Desulfovib rionaceae bacterium等菌的生长。对比例5能显著促进Aerococcusurinaeequi、鼠乳杆及肠乳杆菌等菌的增殖、抑制Klebsiella variicola、大肠杆菌等的生长，对比例5与本发明益生元提取时的过程中参数不一致，进而得到的多糖结构不同，又因为不同的菌能表达不同的糖苷水解酶，导致其能利用的碳源结构不同，进而富集到的肠道益生菌种类就不同。
实施例4
取50只8周龄雄性C57BL/6J小鼠(20±2g)分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、实验组(实施例1-3富集的停滞棒杆菌及对比例5附件的鼠乳杆菌)，正常组喂养普通饲料，模型组和实验组采用60％高脂饲料喂养小鼠诱导糖脂代谢紊乱模型，模型建立后，在喂养高脂饲料第二周开始，实验组灌胃实施例3富集的停滞棒杆菌(108CFU/mL，10mL/kg·bw)，90天，正常组喂养普通饲料，同时正常组和模型组灌胃等剂量的生理盐水，观察小鼠血糖和血脂变化。
由图4可知，实施例1-3富集的停滞棒杆菌及对比例5富集的鼠乳杆菌可以显著降低糖脂代谢紊乱小鼠的血糖、TG、TC、HDL-C和LDL-C水平
(P<0.05)。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1.一种益生元的提取方法，其特征在于，过程包括：
（1）以干燥的桑叶为原料，按照质量体积比为16-20%mg/ml的比例将桑叶粉添加至pH7.0的去离子中，在75℃的条件下水提多糖10-15 h，使用终浓度为60%-80%乙醇醇沉，5000×g离心10 min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
（2）取质量体积比为5-9%mg/ml的桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶，纤维素酶与桑叶多糖溶液的质量体积比为0.2-0.5%mg/ml，调整pH值为6.0-6.5，在300-600 MPa的条件下反应1-2 h，8000×g离心5 min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到益生元粗反应液；
（3）将益生元粗反应液依次经过醇沉、纳滤、反渗透，将益生元粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液;
（4）按照质量体积比为20-25%mg/ml的比例将初步纯化的益生元溶液加入到80 cm×5.0 cm离子交换树脂层析柱DEAE-Spepharose Fast Flow中，以0.3 mol/L NaCl为洗脱剂，洗脱流速为1.0-2.0 mL/min，收集60-200 min洗脱液，反渗透浓缩，得到浓缩液，然后按照质量体积比为20-25%mg/ml的比例将浓缩液加入到80 cm×5.0 cm葡聚糖凝胶G-15柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为1.0-2.0 mL/min，收集150-250 min洗脱液，反渗透浓缩，得到纯化后的益生元溶液；
（5）通过核磁分析鉴定所制备的益生元具有特定的结构，其为：α-T-Glcp-1→3-β-Glcp-1→(5-α-Araf-1)3→3-α-(6-OAc)-Glcp-1。
2.一种筛选调节糖脂代谢的肠道益生菌的方法，其特征在于，以权利要求1所述的益生元筛选，过程包括：以所述益生元对小鼠进行灌胃处理，筛选益生元最显著富集的肠道菌群，然后将该菌群与其他菌群进行相关性分析，获得肠道益生菌。
3.根据权利要求2所述的一种筛选调节糖脂代谢的肠道益生菌的方法，其特征在于，灌胃用的益生元为25-100mg/kg.bw的益生元溶液。
4.根据权利要求3所述的一种筛选调节糖脂代谢的肠道益生菌的方法，其特征在于，益生元能特异性显著促进肠道菌群慢葡萄球菌、停滞棒杆菌、鼠乳杆菌的增殖，显著抑制毛螺菌科细菌28-4、梭菌sp.ASF502菌的生长。
5.根据权利要求4所述的一种筛选调节糖脂代谢的肠道益生菌的方法，其特征在于，肠道益生菌的有效活菌总数为108-1010CFU/mL，灌胃剂量为2.5-10 mL/kg·bw，灌胃时间为60-90d。
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