CN115197992A - 一种筛选肠道中调控糖脂代谢益生菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选肠道中调控糖脂代谢益生菌的方法。属于益生元和益生菌技术领域。本发明联合超高压和生物酶解技术，定向酶解桑叶多糖，并结合醇沉、纳滤、柱层析及反渗透制备得到具有特定结构的益生元；本发明制备的益生元可特异性地调控肠道中约氏乳杆菌，并验证其调控糖脂代谢活性，建立了一种益生元特异性筛选肠道益生菌的方法；本发明定向筛选益生菌的方法简单，并且制备得到的肠道益生菌能够有效调控糖脂代谢活性。

Description

一种筛选肠道中调控糖脂代谢益生菌的方法
技术领域
本发明涉及益生元和益生菌技术领域，更具体的说是涉及一种筛选肠道中调控糖脂代谢益生菌的方法。
背景技术
糖脂代谢是机体能量供给的重要生命过程，其稳态平衡是宿主应对体内外各种应激反应的重要保障。糖脂代谢紊乱会引发肥胖、糖尿病、血脂异常及脂肪肝等系列慢性疾病，严重威胁人类健康。随着人们生活节奏及饮食习惯的改变，与环境及营养等因素息息相关的慢性疾病的患病人数急速上升。
糖脂代谢紊乱的发生与高脂饮食及缺乏运动的生活方式、遗传、代谢及环境等因素相关。此外，研究证实肠道菌群在肥胖和糖尿病等糖脂代谢紊乱疾病的发病过程中起关键作用。近年来研究显示，膳食干预是影响肠道菌群结构及功能的重要手段，其中，肠道菌群可对营养组分的变化作出迅速反应，而好的饮食习惯也对肠道微生物结构的稳定起到了关键性的作用，由此，通过膳食干预肠道微生物改善糖脂代谢紊乱成为食品营养学研究的新切入点。而通过直接补充肠道益生菌是一种直接有效的方式，但目前益生菌的主要从环境或者土壤中筛选，存在工作量大、且不确定性高等缺点。
综上，如何提供一种筛选肠道中调控糖脂代谢益生菌的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种筛选肠道中调控糖脂代谢益生菌的方法。通过制备特定结构的益生元，定向富集具有调控糖脂代谢活性的肠道益生菌。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
益生元在筛选调控糖脂代谢益生菌中的应用，所述益生元为8个聚合度的功能性低聚糖，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖通过α-1,2、β-1,4、β-1,2链接而成，其不能被机体消化酶所降解，直接作用于肠道菌群，其具体结构如下：
α-(2-OAc)-Manp-1→2-β-Glcp-1→4-β-Glcp-1→4-α-Glcp-1→2-α-Glcp-1→2-α-Galp-1→2-β-Galp-1→2-β-Galp-1。
进一步的，所述益生元的制备方法如下：
(1)桑叶经过水提醇沉得到桑叶多糖；
(2)桑叶多糖经过超高压辅助半纤维素酶水解、浓缩得到益生元粗反应液；
(3)将益生元粗反应液经过醇沉、纳滤、反渗透得到初步纯化的益生元溶液；
(4)将初步纯化的益生元溶液经过柱层析分离进行纯化，即得益生元。
进一步的，所述益生元的制备方法如下：
(1)以干燥的桑叶为原料，将16～20％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子水中，在75℃的条件下水提多糖10～15h，使用终浓度为60％～80％(v/v)的乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
(2)取5～9％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.2～0.5％(w/v)，调整pH值为6.0～6.5，在300～600MPa的条件下反应4～5h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到益生元粗反应液；
所取得的有益效果：半纤维素酶的添加量会影响益生元结构和聚合度，进而对其活性产生影响。采用本发明参数可最终得到具有特定结构α-(2-OAc)-Manp-1→2-β-Glcp-1→4-β-Glcp-1→4-α-Glcp-1→2-α-Glcp-1→2-α-Galp-1→2-β-Galp-1→2-β-Galp-1的益生元。
(3)将益生元粗反应液(25％～50％，w/v)依次经过醇沉、纳滤、反渗透得到初步纯化的益生元溶液；
所取得的有益效果：若益生元粗反应液浓度过低，影响纳滤效果；浓度过高，容易产生传质阻力，对纳滤分离膜造成损伤。
(4)将20～25％(w/v)初步纯化的益生元溶液加入到离子交换树脂层析柱DEAE-Spepharose Fast Flow(60cm×5.0cm)中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为1.0～2.0mL/min，收集100～300min洗脱液，反渗透浓缩，然后将20～25％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25(60cm×5.0cm)柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为0.5～1.0mL/min，收集150～200min洗脱液，反渗透浓缩，即得益生元。
一种筛选肠道中调控糖脂代谢益生菌的方法，筛选过程中使用益生元，所述益生元为8个聚合度的功能性低聚糖，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖通过α-1,2、β-1,4、β-1,2链接而成，其不能被机体消化酶所降解，直接作用于肠道菌群，其具体结构如下：
α-(2-OAc)-Manp-1→2-β-Glcp-1→4-β-Glcp-1→4-α-Glcp-1→2-α-Glcp-1→2-α-Galp-1→2-β-Galp-1→2-β-Galp-1。
进一步的，包括如下步骤：
(1)使用益生元灌胃糖脂代谢紊乱的小鼠；
(2)分析益生元对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，筛选出对肠道菌群有显著影响的菌群；
(3)在对肠道菌群有显著影响的菌群中，通过相关性分析筛选出和其他所有菌群都存在显著相关性的菌为益生菌；
(4)将筛选出的益生菌灌胃给糖脂代谢紊乱的小鼠，验证其调控糖脂代谢的活性。
进一步的，所述步骤(1)中灌胃剂量为25～100mg/kg·bw，灌胃时间为60～90天。
所取得的有益效果：若灌胃剂量过低，达不到改善糖脂代谢效果；而若灌胃剂量过高，容易导致小鼠消化不良，肠胀气。
若灌胃时间太短，益生元改善小鼠糖脂代谢紊乱效果不明显；而灌胃时间太长，导致实验周期过长，影响实验效率。
进一步的，所述步骤(4)中益生菌的有效活菌总数为108～1010CFU/mL，灌胃剂量为2.5～10mL/kg·bw，灌胃时间为60～90天。
所取得的有益效果：若有效活菌数及灌胃剂量过低，影响其改善糖脂代谢活性；若有效活菌数及灌胃剂量过高，会破坏肠道菌群的多样性。
进一步的，糖脂代谢紊乱小鼠肠道中约氏乳杆菌丰度显著降低。
上述方法筛选出的益生菌。
进一步的，所述益生菌为约氏乳杆菌。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)本发明联合超高压和生物酶解技术，定向酶解桑叶多糖，并结合醇沉、纳滤、柱层析及反渗透制备得到具有特定结构的益生元；(2)本发明制备的益生元可特异性地调控肠道中约氏乳杆菌，并验证其调控糖脂代谢活性，建立了一种益生元特异性筛选肠道益生菌的方法；(3)本发明定向筛选益生菌的方法简单，并且制备得到的肠道益生菌能够有效调控糖脂代谢活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例1中益生元的一维核磁图谱；
图2附图为本发明实施例1中益生元的1H-1HCOSY核磁图谱；
图3附图为本发明实施例1中益生元的HSQC核磁图谱；
图4附图为本发明实施例1中益生元的HMBC核磁图谱；
图5附图为本发明实施例1显著影响糖脂代谢紊乱小鼠菌群结果；
图6附图为本发明实施例2显著影响糖脂代谢紊乱小鼠菌群结果；
图7附图为本发明实施例3显著影响糖脂代谢紊乱小鼠菌群结果；
图8附图为本发明对比例1显著影响糖脂代谢紊乱小鼠菌群结果；
图9附图为本发明对比例2显著影响糖脂代谢紊乱小鼠菌群结果；
图10附图本发明对比例3显著影响糖脂代谢紊乱小鼠菌群结果；
图11附图为本发明对比例5显著影响糖脂代谢紊乱小鼠菌群结果；
图12附图为本发明实施例1显著影响肠道菌群的相关性分析结果；
图13附图为本发明实施例2显著影响肠道菌群的相关性分析结果；
图14附图为本发明实施例3显著影响肠道菌群的相关性分析结果；
图15附图为本发明对比例1显著影响肠道菌群的相关性分析结果；
图16附图为本发明对比例2显著影响肠道菌群的相关性分析结果；
图17附图为本发明对比例3显著影响肠道菌群的相关性分析结果；
图18附图为本发明对比例5显著影响肠道菌群的相关性分析结果；
图19附图为本发明正常小鼠与糖脂代谢紊乱小鼠(模型组)肠道菌群中约氏乳杆菌丰度变化。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
(1)益生元的制备
以干燥的桑叶为原料，将16％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子水中，在75℃的条件下水提多糖15h，使用终浓度为80％乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
取5％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.5％(w/v)，调整pH值为6.0，在600MPa的条件下反应4h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到益生元粗反应液；
将益生元粗反应液依次经过终浓度为80％(v/v)乙醇醇沉及在0.3MPa下，以1L/h流速过纳滤(300Da)、反渗透膜，将益生元粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液；
将初步纯化的益生元溶液(20％，w/v)加入到DEAE-Spepharose Fast Flow(60cm×5.0cm)中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为1.0mL/min，收集200～300min洗脱液，反渗透浓缩，然后将20％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25(60cm×5.0cm)柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为0.5mL/min，收集150～200min洗脱液，反渗透浓缩，得到益生元；
核磁分析
将100mg益生元完全溶解于95％D2O中，冷冻干燥，反复三次后将益生元溶解于D2O中，过0.22μm水系滤膜后，装入核磁管。
检测条件：使用Bruker600M超导核磁共振波谱仪，TXI反相三共振探头(5mm)，1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、谱均在298K检测；1H谱与13C谱分别在600和150MHz扫描完成，采用标准Bruker脉冲序列进行1H-1HCOSY、HSQC及HMBC分析，使用MestReNova6.1.1软件解析上述图谱，结果如图1～4所示。
通过一维和二维核磁(1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC)分析鉴定所制备的益生元具有特定的结构，其为：α-(2-OAc)-Manp-1→2-β-Glcp-1→4-β-Glcp-1→4-α-Glcp-1→2-α-Glcp-1→2-α-Galp-1→2-β-Galp-1→2-β-Galp-1。
(2)调控糖脂代谢益生菌的筛选
将益生元溶液(50mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间60天。
分析益生元对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，筛选出对肠道菌群有显著影响的菌群。
宏基因组分析
①DNA的提取：利用细菌DNA提取试剂盒提取小鼠盲肠内容物总的DNA，利用NanoDrop 2000对DNA纯度和浓度进行检测，并通过2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量
②DNA文库的构建及测序：取1μg上述DNA加入37.5μL Fragmentation buffer将DNA打断，重复多次直至DNA片段为300bp左右，使用电泳检测DNA打断效果。随后向DNA片段中加入End-Repair Mix于25℃进行末端修复30min，修复后使用DNA纯化试剂盒进行纯化，然后加入A-Tailing Mix使DNA3’末端加上PolyA尾，最后在DNA片段两端接入测序接头。运用2％琼脂糖凝胶对上述DNA片段进行PCR扩增。随后纯化PCR产物，使用2％琼脂糖电泳对其纯度进行检测，并用QuantiFluorTM-ST定量分析产物浓度，随后构建DNA文库。对文库质量进行检测，确保文库DNA有效浓度超过2nmol/L，然后用Illumina HiSeq2500对文库进行高通量测序。
③数据分析：得到测试原始数据后，首先通过Cutadapt彻底清除原始数据中的Illumina接头序列，再用PrinSEQ去除低质量的序列片段和个别序列。处理后的数据通过Bowtie2比对去除宿主来源的基因，获得用于后续分析的有效数据(Clean Reads)，然后进行De Novo组装，对所有序列整合并去冗余得到Unigene集合。随后对Unigene进行物种和功能注释。通过物种注释分析菌群群落结构，并选取相似度最高的基因序列并对其进行功能注释和富集分析。
结果如图5；结果表明，能显著促进拟杆菌属细菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等细菌增殖，显著抑制毛螺菌科细菌、细菌1XD8-92等菌的生长。
在对肠道菌群有显著影响的菌群中，通过相关性分析筛选出和其他所有菌群都存在显著相关性的菌为益生菌，结果如图12；结果表明，通过Spearman相关性分析，只有约氏乳杆菌与其他菌都存在显著相关性，说明益生元能定向富集约氏乳杆菌，从而影响其他菌的丰度。
确定益生元最显著富集的肠道菌群(约氏乳杆菌)，并通过划线分离法得到约氏杆菌。
实施例2
(1)益生元的制备
以干燥的桑叶为原料，将18％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子水中，在75℃的条件下水提多糖12.5h，使用终浓度为80％乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
取7％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.35％(w/v)，调整pH值为6.3，在450MPa的条件下反应4.5h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到益生元粗反应液；
将益生元粗反应液依次经过终浓度为70％(v/v)乙醇醇沉及在0.2MPa下，以2L/h流速过纳滤(300Da)、反渗透膜，将益生元粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液；
将初步纯化的益生元溶液(23％，w/v)加入到离子交换树脂层析柱DEAE-Spepharose Fast Flow(60cm×5.0cm)中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为1.5mL/min，收集150～250min洗脱液，反渗透浓缩，然后将23％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25(60cm×5.0cm)柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为0.75mL/min，收集150～200min洗脱液，反渗透浓缩，得到纯化后的益生元溶液；
通过一维和二维核磁(1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC)分析鉴定所制备的益生元具有特定的结构，其为：α-(2-OAc)-Manp-1→2-β-Glcp-1→4-β-Glcp-1→4-α-Glcp-1→2-α-Glcp-1→2-α-Galp-1→2-β-Galp-1→2-β-Galp-1。
(2)调控糖脂代谢益生菌的筛选
将益生元溶液(100mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间75天。
分析益生元对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，筛选出对肠道菌群有显著影响的菌群，结果如图6；结果表明，能显著促进拟杆菌属细菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等细菌增殖，显著抑制毛螺菌科细菌、细菌1XD8-92等菌的生长。
在对肠道菌群有显著影响的菌群中，通过相关性分析筛选出和其他所有菌群都存在显著相关性的菌为益生菌，结果如图13；结果表明，通过Spearman相关性分析，只有约氏乳杆菌与其他菌都存在显著相关性，说明益生元能定向富集约氏乳杆菌，从而影响其他菌的丰度。
确定益生元最显著富集的肠道菌群(约氏乳杆菌)，并通过划线分离法得到约氏杆菌。
实施例3
(1)益生元的制备
以干燥的桑叶为原料，将20％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子水中，在75℃的条件下水提多糖10h，使用终浓度为80％乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
取9％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.2％(w/v)，调整pH值为6.5，在300MPa的条件下反应5h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到益生元粗反应液；
将益生元粗反应液依次经过终浓度为60％(v/v)乙醇醇沉及在0.2MPa下，以3L/h流速过纳滤(300Da)、反渗透膜，将益生元粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液；
将初步纯化的益生元溶液(25％，w/v)加入到离子交换树脂层析柱DEAE-Spepharose Fast Flow(60cm×5.0cm)中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为2.0mL/min，收集100～200min洗脱液，反渗透浓缩，然后将25％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25(60cm×5.0cm)柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为1.0mL/min，收集150～200min洗脱液，反渗透浓缩，得到纯化后的益生元溶液；
通过一维和二维核磁(1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC)分析鉴定所制备的益生元具有特定的结构，其为：α-(2-OAc)-Manp-1→2-β-Glcp-1→4-β-Glcp-1→4-α-Glcp-1→2-α-Glcp-1→2-α-Galp-1→2-β-Galp-1→2-β-Galp-1。
(2)调控糖脂代谢益生菌的筛选
将益生元溶液(25mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间90天。
分析益生元对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，筛选出对肠道菌群有显著影响的菌群，结果如图7；结果表明，能显著促进拟杆菌属细菌、约氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等细菌增殖，显著抑制毛螺菌科细菌、细菌1XD8-92等菌的生长。
在对肠道菌群有显著影响的菌群中，通过相关性分析筛选出和其他所有菌群都存在显著相关性的菌为益生菌，结果如图14；结果表明，通过Spearman相关性分析，只有约氏乳杆菌与其他菌都存在显著相关性，说明益生元能定向富集约氏乳杆菌，从而影响其他菌的丰度。
确定益生元最显著富集的肠道菌群(约氏乳杆菌)，并通过划线分离法得到约氏杆菌。
对比例1
将商业化的低聚果糖溶液(50mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间60天。
分析低聚果糖对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，筛选出对肠道菌群有显著影响的菌群，结果如图8；结果表明，主要促进Acutalibacter 1XD8-33、台湾乳杆菌(Lactobacillus taiwanensis)、Pseudofiavonifractor Marseille-P3106、ClostridiumAT4、Intestinimonas massiliensis、Eubacterium xylanophilum的增殖，抑制Desulfovibrionaceae bacterium、Parabacteroides goldsteinii、ParabacteroidesASF519等菌的生长。
在对肠道菌群有显著影响的菌群中，通过相关性分析筛选出和其他所有菌群都存在显著相关性的菌为益生菌，结果如图15；结果表明，没有特定一种或几种菌与其显著影响的肠道菌群之间都存在显著相关性，说明并不能定向富集肠道菌群。
对比例2
将商业化的低聚半乳糖溶液(50mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间60天。
分析低聚半乳糖对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，筛选出对肠道菌群有显著影响的菌群，结果如图9；结果表明，主要促进Lactobacillus hominis及巴氏生孢八叠球菌(Sporosarcina pasteurii)的生长，抑制Bacteroides acidifaciens、Desulfovibrionaceae bacterium、Mailhella massiliensis等菌的增殖。
在对肠道菌群有显著影响的菌群中，通过相关性分析筛选出和其他所有菌群都存在显著相关性的菌为益生菌，结果如图16；结果表明，没有特定一种或几种菌与其显著影响的肠道菌群之间都存在显著相关性，说明并不能定向富集肠道菌群。
对比例3
将商业化的低聚异麦芽糖溶液(50mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间60天。
分析低聚异麦芽糖对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，筛选出对肠道菌群有显著影响的菌群，结果如图10；结果表明，主要促进假长双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudomonas)、Colidextribacter OB.20、Bacterium 1xD42-67的增殖，抑制Lachnoclostridium An181、Bacteroides acidifaciens、Desulfovibrionaceaebacterium等菌的生长。
在对肠道菌群有显著影响的菌群中，通过相关性分析筛选出和其他所有菌群都存在显著相关性的菌为益生菌，结果如图17；结果表明，没有特定一种或几种菌与其显著影响的肠道菌群之间都存在显著相关性，说明并不能定向富集肠道菌群。
对比例4
益生元的制备
(1)以干燥的桑叶为原料，将16％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子水中，在75℃的条件下水提多糖15h，使用终浓度为80％乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
(2)取5％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.5％(w/v)，调整pH值为6.0，在600MPa的条件下反应4h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到益生元粗反应液；
(3)将益生元粗反应液依次经过终浓度为80％(v/v)乙醇醇沉及在0.3MPa下，以1L/h流速过纳滤(300Da)、反渗透膜，将益生元粗反应液中的未被酶降解的多糖和单糖去除，经反渗透浓缩得到初步纯化的益生元溶液；
(4)将初步纯化的益生元溶液(20％，w/v)加入到DEAE-Spepharose Fast Flow(60cm×5.0cm)中，以0.3mol/LNaCl为洗脱剂，洗脱流速为1.0mL/min，收集50～150min洗脱液，反渗透浓缩，然后将20％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-15(60cm×5.0cm)柱中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为0.5mL/min，收集150～200min洗脱液，反渗透浓缩，得到益生元。
核磁分析
将100mg益生元完全溶解于95％D2O中，冷冻干燥，反复三次后将益生元溶解于D2O中，过0.22μm水系滤膜后，装入核磁管。
检测条件：使用Bruker 600M超导核磁共振波谱仪，TXI反相三共振探头(5mm)，1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC、谱均在298K检测；1H谱与13C谱分别在600和150MHz扫描完成，采用标准Bruker脉冲序列进行1H-1HCOSY、HSQC及HMBC分析，使用MestReNova6.1.1软件解析上述图谱。
通过一维和二维核磁(1H、13C、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC)分析鉴定所制备的益生元具有特定的结构，其为：α-T-Glcp-1→3-β-Glcp-1→(5-α-Araf-1)3→3-α-(6-OAc)-Glcp-1。
由实施例1～3与对比例4可知，纯化步骤参数对制备益生元的结构影响较大。
对比例5
将桑叶粉加入到蒸馏水中得到10％(w/v)溶液，在pH4.9、80℃下进行水提多糖，提取时间为8h，5000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶多糖溶液；
取3％桑叶多糖溶液，加入1％半纤维素酶，反应温度为50℃，反应时间为8h，反应pH6.0，8000×g离心5min后取上清液，浓缩，得到桑叶低聚糖粗反应液；
将桑叶低聚糖粗反应液通过联合使用纳滤(200Da)和超滤(2000Da)膜系统将低聚糖粗反应液中的单糖和未被酶降解且分子量大于2000Da的多糖去除，得到初步纯化的低聚糖溶液；
将上述初步纯化的低聚糖溶液(20％，w/v)加入到DEAE-52层析柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集50-200min的洗脱液MLO1，浓缩；随后将5％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱中(20mm×300mm)，以去离子水为洗脱剂，流速为1mL/min洗脱，收集150-250min的洗脱液，浓缩得到分离纯化后的桑叶低聚糖MLO1-2溶液。
将MLO1-2溶液(25mg/kg·bw)灌胃由高脂饲料(脂肪含量占比60％)诱导的糖脂代谢紊乱小鼠，灌胃时间90天。
分析MLO1-2对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，筛选出对肠道菌群有显著影响的菌群，结果如图11；结果表明，能显著促进马尿气球菌、罗伊氏乳杆菌、约氏乳杆菌等细菌增殖，显著抑制摩氏摩根菌、肠拟杆菌等菌的生长。
在对肠道菌群有显著影响的菌群中，通过相关性分析筛选出和其他所有菌群都存在显著相关性的菌为益生菌，结果如图18；结果表明，通过Spearman相关性分析，只有罗伊氏乳杆菌与其他菌都存在显著相关性，说明MLO1-2能定向富集罗伊氏乳杆菌，从而影响其他菌的丰度。
确定MLO1-2最显著富集的肠道菌群(罗伊氏乳杆菌)，并通过划线分离法得到罗伊氏杆菌。
实验1
为了进一步说明本发明能达到的效果，进行如下实验：
取50只8周龄雄性C57BL/6J小鼠(20±2g)分为5组，每组10只，分别为正常组、模型组、实验组(实施例1～3富集的约氏乳杆菌、对比例5富集的罗伊氏乳杆菌)，正常组喂养普通饲料，模型组和实验组采用60％高脂饲料喂养小鼠诱导糖脂代谢紊乱模型，模型建立后，在喂养高脂饲料第二周开始，实验组灌胃实施例1～3富集的约氏乳杆菌、对比例5富集的罗伊氏乳杆菌(108CFU/mL，10mL/kg·bw)，60天，正常组喂养普通饲料，同时正常组和模型组灌胃等剂量的生理盐水，观察小鼠血糖和血脂变化。结果如表1所示。
表1实施例1～3显著富集的约氏乳杆菌对糖脂代谢紊乱小鼠血糖和血脂的影响
Figure BDA0003809806240000131
由表1可知，实施例1～3富集的约氏乳杆菌及对比例5富集的罗伊氏乳杆菌可以显著降低糖脂代谢紊乱小鼠的血糖、TG、TC、HDL-C和LDL-C水平(P<0.05)；且实施例1～3富集的约氏乳杆菌效果显著好于对比例5富集的罗伊氏乳杆菌。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.益生元在筛选调控糖脂代谢益生菌中的应用，所述益生元为8个聚合度的功能性低聚糖，由甘露糖、葡萄糖和半乳糖通过α-1,2、β-1,4、β-1,2链接而成，其具体结构如下：
α-(2-OAc)-Manp-1→2-β-Glcp-1→4-β-Glcp-1→4-α-Glcp-1→2-α-Glcp-1→2-α-Galp-1→2-β-Galp-1→2-β-Galp-1。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述益生元的制备方法如下：
(1)桑叶经过水提醇沉得到桑叶多糖；
(2)桑叶多糖经过超高压辅助半纤维素酶水解、浓缩得到益生元粗反应液；
(3)将益生元粗反应液经过醇沉、纳滤、反渗透得到初步纯化的益生元溶液；
(4)将初步纯化的益生元溶液经过柱层析分离进行纯化，即得益生元。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述益生元的制备方法如下：
(1)以干燥的桑叶为原料，将16～20％(w/v)桑叶粉添加至pH7.0的去离子水中，在75℃的条件下水提多糖10～15h，使用终浓度为60％～80％(v/v)的乙醇醇沉，5000×g离心10min，收集沉淀，得到桑叶多糖；
(2)取5～9％(w/v)桑叶多糖溶液，加入半纤维素酶0.2～0.5％(w/v)，调整pH值为6.0～6.5，在300～600MPa的条件下反应4～5h，8000×g离心5min，将上清液过反渗透膜进行浓缩，得到益生元粗反应液；
(3)将益生元粗反应液依次经过醇沉、纳滤、反渗透得到初步纯化的益生元溶液；
(4)将20～25％(w/v)初步纯化的益生元溶液加入到离子交换树脂层析柱DEAE-Spepharose Fast Flow(60cm×5.0cm)中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为1.0～2.0mL/min，收集100～300min洗脱液，反渗透浓缩，然后将20～25％(w/v)浓缩液加入到葡聚糖凝胶G-25柱(60cm×5.0cm)中，以去离子水为洗脱剂，洗脱流速为0.5～1.0mL/min，收集150～200min洗脱液，反渗透浓缩，即得益生元。
4.一种筛选肠道中调控糖脂代谢益生菌的方法，其特征在于，筛选过程中使用益生元，所述益生元的结构为α-(2-OAc)-Manp-1→2-β-Glcp-1→4-β-Glcp-1→4-α-Glcp-1→2-α-Glcp-1→2-α-Galp-1→2-β-Galp-1→2-β-Galp-1。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使用益生元灌胃糖脂代谢紊乱的小鼠；
(2)分析益生元对糖脂代谢紊乱小鼠肠道菌群的影响，筛选出对肠道菌群有显著影响的菌群；
(3)在对肠道菌群有显著影响的菌群中，通过相关性分析筛选出和其他所有菌群都存在显著相关性的菌为益生菌；
(4)将筛选出的益生菌灌胃给糖脂代谢紊乱的小鼠，验证其调控糖脂代谢的活性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中灌胃剂量为25～100mg/kg·bw，灌胃时间为60～90天。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中益生菌的有效活菌总数为108～1010CFU/mL，灌胃剂量为2.5～10mL/kg·bw，灌胃时间为60～90天。
8.权利要求4～7所述的方法筛选出的益生菌。
9.如权利要求8所述的益生菌，其特征在于，所述益生菌为约氏乳杆菌。
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